大鼠和小鼠眼球组织学载玻片的制备和分析以评估视网膜
August 23rd, 2024
本手稿介绍了啮齿动物眼球载玻片的组织学制备方案。使用所提出的方法，可以在光学显微镜下轻松观察和评估视网膜内层。该程序适用于小鼠和大鼠的眼球。
我们的研究重点是开发一种简单的循序渐进方法来制备组织学载玻片和评估啮齿动物视网膜。视网膜组织学检查的结果可用于许多眼科疾病的研究，包括神经退行性和血管疾病。在已发表的文献中，对啮齿动物眼球组织学检查方法的描述非常有限。
缺乏分步指南，这使得初学者很难重新创建。我们相信该协议将对其他研究人员有用。尽管还有其他方法可用于评估视网膜的形态，包括光学相干断层扫描，但组织病理学检查允许评估单个细胞并提供更少的伪影。
因此，它可以证明对研究眼科疾病的病理机制更有用。首先，从冰箱中取出多聚甲醛和蔗糖固定的大鼠眼球。用锋利的手术刀沿矢状面将眼球切成两半。
然后取下并丢弃镜头。在室温下解冻眼球。将两半移入溶壳盒中，在流水下冲洗 20 分钟以洗掉蔗糖。
在通风橱下，以增加乙醇浓度对眼球脱水 15 分钟，最后在丙酮中脱水 7 分钟。要清除眼球，请在通风橱下将其置于二甲苯中 7 分钟。将一些固体石蜡加入烧杯中，然后将其放入培养箱中，培养箱的温度高于石蜡制造商指定的熔化温度。
石蜡完全融化后，将眼球移入烧杯中，将烧杯在培养箱中放置 1 小时。在孵育过程中，每 10 到 15 分钟搅拌一次烧杯，以防止石蜡浸润到组织中。接下来，打开磁带并取下顶盖。
选择金属模具，倒入少量石蜡覆盖模具底部。然后用镊子从盒中取出眼球，将一个眼球的一半放在杯子底部向上，另一半向下放在模具中的石蜡上。当组织固定到位时，小心地用石蜡覆盖眼球和包埋盒底部以形成一个块。
将块转移到冷却板上以完全凝固。凝固后，从金属模具中取出石蜡块，将石蜡块放回冷却板上 15 分钟。在切片机中固定石蜡块。
设置切片机以从块中修剪掉多余的石蜡，然后修剪直到到达眼球的中心。更改切片机设置后，切开 3.5 微米的薄片。将剪切部分放在载玻片上。
将玻片放入培养箱中 15 分钟，让石蜡融化。然后将载玻片放入二甲苯中。然后，将载玻片转移到 96% 乙醇中。
乙醇处理后，用流水清洗玻片 5 分钟。将玻片放入 Mayer 苏木精中 2 分钟，然后在 Mayer 苏木精中蘸有干净溶液 2 分钟。用流水清洗玻片两次，每次 5 分钟。
加入 1% 伊红 2 分钟，然后加入乙醇，各 1 分 30 秒。将玻片放入二甲苯中 2 分钟，然后用另一个装有干净溶液的烧杯加入二甲苯 1 分钟。使用自动玻片封口机密封玻片。
首先，在计算机上打开高分辨率扫描的大鼠眼球图像并找到横瞳横截面。通过滚动鼠标放大选定的横截面。然后旋转右上角的点以调整图像方向，使 Retina 处于水平状态。
单击右上角的放大框并选择 20 次以找到视网膜最厚的部分。接下来，右键单击鼠标以选择 注释和 标尺.将鼠标光标放在视网膜最厚部分的外部限制膜上，然后单击左按钮开始测量。
然后将光标垂直于内界膜移动，再次点击左键完成测量。将测量值的标题命名为 Retinal thickness（视网膜厚度），然后勾选复选框以显示标题和长度。接下来，使用尺子测量每个视网膜层的厚度，包括外核层、外丛状层、内核层和内丛状层，并相应地标记它们。
要计算神经节细胞层内的细胞数，请选择视网膜的一部分，然后使用尺子测量沿神经节细胞层的选定距离。要标记细胞体，请按鼠标右键并选择 Annotate、Saved 和 1 x RBC。在视网膜的预定长度上，单击沿神经节细胞层标识为圆形有核血红素染色体的每个细胞。
计算环状细胞的数量、视网膜厚度、单层厚度和神经节细胞层中的细胞数量，并在个体之间进行比较，以评估啮齿动物视网膜神经变性的特征。
概述
本手稿介绍了一种从啮齿动物眼球制备组织学幻灯片的协议。该方法允许在光学显微镜下轻松观察和评估视网膜内层。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 眼科学
- 组织学
背景
- 视网膜的组织学检查对于研究眼科疾病至关重要。
- 现有的啮齿动物眼球组织学方法有限。
- 通常缺乏逐步指南，阻碍了初学者的可重复性。
- 组织病理学检查提供了详细的细胞洞察，并且产生较少的伪影。
研究目的
- 开发一种简单的组织学幻灯片制备协议。
- 促进啮齿动物视网膜形态学的评估。
- 为眼科疾病研究的研究人员提供资源。
使用的方法
- 从啮齿动物眼球制备组织学幻灯片。
- 使用光学显微镜观察视网膜内层。
- 提供易于使用的逐步方法。
- 与其他评估方法（如光学相干断层扫描）进行比较。
主要结果
- 该提议的方法允许清晰地观察视网膜内层。
- 组织学幻灯片提供了详细的细胞信息。
- 与其他成像技术相比，产生的伪影较少。
- 该协议对各个层次的研究人员都是可访问的。
结论
- 该协议是啮齿动物视网膜组织学检查的宝贵资源。
- 它解决了初学者可用方法的空白。
- 该方法增强了对各种疾病中视网膜形态学的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Histological analysis of rodent retinas provides critical cellular-resolution data for preclinical ophthalmic drug discovery and mechanistic disease research. This protocol enables standardized, reproducible assessment of retinal morphology, supporting predictive confidence in early-stage target validation and translational studies. Reliable quantification of neurodegeneration and tissue remodeling informs risk-adjusted portfolio decisions in ophthalmology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of retinal degeneration and remodeling at the cellular level.
- Supports mechanistic de-risking by revealing neurodegenerative and vascular pathology in disease models.
- Facilitates functional target validation through measurement of retinal layer thickness and ganglion cell counts.
- Provides robust morphological endpoints for hypothesis-driven research in ophthalmic indications.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized histological slides suitable for quantitative analysis across experimental cohorts.
- Enables reproducible measurement of retinal features, supporting assay development and validation.
- Provides high-resolution cellular data for screening compound effects on retinal structure.
- Reduces artifacts compared to imaging-only approaches, improving assay reliability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical endpoints with disease-relevant morphological biomarkers for translational continuity.
- Supports evaluation of therapeutic efficacy and safety in rodent models of ophthalmic disease.
- Enables cross-study comparison of neurodegenerative progression and intervention outcomes.
- Facilitates risk-adjusted advancement of candidates based on robust tissue-level evidence.
Pipeline & Workflow Integration
This histological protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and translational validation in ophthalmology pipelines.
- Discovery Biology: Provides quantitative morphological data for hypothesis testing and pathway analysis in retinal disease models.
- Screening: Supplies reproducible, artifact-minimized slides for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Enables precise measurement of retinal thickness, layer structure, and ganglion cell counts for comparative analysis.
- Translational Research: Aligns preclinical morphological endpoints with clinical biomarker strategies where feasible.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for retinal histology across multiple programs and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in retinal disease research.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of histological assessments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation by providing robust morphological endpoints.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of ophthalmic candidates based on quantitative tissue analysis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histological processing, sectioning, and staining of rodent ocular tissue.
- Needs access to microtomes, paraffin embedding systems, and high-resolution light microscopy.
- Demands cross-team standardization of measurement protocols and data annotation practices.
- Adaptation may be needed for different rodent strains or disease models to ensure consistency.
- Potential limitations include tissue handling artifacts and the need for careful slide preparation to preserve retinal architecture.
