Name: 基础记录:一种分析果蝇味觉神经元反应的技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: 学习基础记录技术，用于分析黑腹果蝇味觉神经元对疏水性刺激的反应。该方法可检测苦味和糖敏感神经元的放电活动，揭示动物化学感受系统的分子机制。

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感谢 Zina Berman 提供的支持，Lisa Baik 对稿件的评论，以及 Carlson 实验室其他成员的讨论。本研究得到了 NIH 资助 K01 DC020145（授予 H.K.M.D）；以及 NIH 资助 R01 DC02174、R01 DC04729 和 R01 DC011697（授予 J.R.C）的支持。

以下方案符合耶鲁大学的所有动物护理指南。
1. 果蝇
<ol>
	<li>将10-15只新羽化的果蝇放入新鲜的标准培养瓶中，在25 °C、60%相对湿度、12:12小时光暗循环条件下培养。</li>
	<li>使用3-7日龄的果蝇进行实验。</li>
</ol>
2. 化学感受刺激
<ol>
	<li>获取尽可能高纯度的化学感受刺激物。按照供应商的建议保存至使用。</li>
	<li>将化学感受刺激物溶解，并用水或另一种所需且无毒的溶剂（如石蜡油）稀释至所需浓度。对于溶解的固体化合物，制备的溶液需至少搅拌1小时。</li>
</ol>
3. 玻璃刺激毛细管
<ol>
	<li>使用拉针仪将硼硅酸盐玻璃毛细管（100 mm 长，1 mm 外径，0.58 mm 内径）拉制成用于盛装刺激物的玻璃毛细管，尖端直径应控制在 3 µm 至 10 µm 之间。</li>
	<li>使用微量移液器吸头将选定的刺激溶液注入玻璃毛细管中。注意避免产生气泡，如有气泡可通过轻弹管壁去除。</li>
	<li>若刺激物在尖端结晶，应清洁或更换玻璃刺激毛细管。</li>
</ol>
4. 参考电极和记录电极
<ol>
	<li>使用钨丝（直径 127 µm，长度 76.2 mm）制备参考电极和记录电极。将参考电极和记录电极的尖端反复浸入 10% KNO3（约 1 M）溶液或 10% KOH（1.8 M）溶液中数秒，使其尖端直径磨至约 1 µm（这些电极的形状见 Delventhal 等.36 的图示）。 
	注意：该过程需施加电流（0.3–3 mA）以促进反应。</li>
</ol>
5. 准备果蝇以进行基础记录
<ol>
	<li>从试剂瓶中用吸虫器吸取一只果蝇。抽出吸虫器，并用手指堵住末端以困住果蝇。</li>
	<li>将果蝇吹入一个 200 µL 的塑料移液枪头中。保持吸虫器末端位于枪头内部，利用其推动果蝇向前，使其头部朝向枪头的狭窄端。</li>
	<li>使用剃刀片在枪头两端（即果蝇的前部和后部）进行修剪。</li>
	<li>使用黏土或一小块棉花进一步推动果蝇向前，直至其头部一半露出于修剪后的枪头末端。用镊子轻轻推动，使头部前端的唇瓣暴露出来。</li>
	<li>用黏土将修剪后的枪头固定在玻璃显微镜载玻片上（图 1）。</li>
	<li>在体视显微镜下，将唇瓣侧向放置于盖玻片上，使其中一个叶及其31个味觉感器暴露出来（图 1）。盖玻片可固定唇瓣位置。</li>
</ol>
6. 电生理设备
<ol>
	<li>选择一个温度和相对湿度稳定（&#60;70%）且远离冰箱、离心机等电噪声和机械噪声源的房间用于设备安装。</li>
	<li>将显微镜放置在防震台的中心位置。</li>
	<li>将手动微操纵器固定在防震台上（图2）。</li>
	<li>将固定钨参考电极的不锈钢轴连接至手动微操纵器（图2）。</li>
	<li>使用支架将两个电动操纵器连接到同一台面上：一个配备记录电极探针的夹持器，另一个配备连接至不锈钢轴的玻璃刺激毛细管夹持器（图2）。</li>
	<li>将记录电极探针连接至智能数据采集控制器（IDAC）系统或其他放大器/数字化系统。</li>
	<li>将该IDAC系统连接至工作站的计算机。</li>
	<li>将手动和电动操纵器共同接地至设备系统的同一接地点。</li>
	<li>在计算机上安装适用于IDAC系统的数据采集软件，并确保数字采集驱动程序与计算机操作系统（例如 Windows XP-7、-8 或 -10）兼容。</li>
</ol>
7. 味觉感受器的记录
<ol>
	<li>将制备好的载玻片置于显微镜载物台上，使用低倍物镜（例如&#160;10x）。移动载物台，使唇瓣在低倍和高倍（例如50x）物镜下均位于视野中央并清晰对焦。</li>
	<li>使用低倍物镜将参考电极插入果蝇眼部。插入参考电极时，应选择与记录电极所在侧相对的一侧眼睛；例如，若记录电极从右侧接近，则将参考电极插入左侧眼睛。使用手动显微操作器进行精确插入。</li>
	<li>使用电动显微操作器将玻璃刺激毛细管的尖端移至低倍和高倍物镜视野中央并对焦（图3）。</li>
	<li>在低倍镜下，使用第二个电动显微操作器将记录电极移近唇瓣。</li>
	<li>在高倍镜下，使用电动显微操作器将记录电极插入味觉感器基部，直至听到IDAC系统音频输出中出现神经元放电的声音。</li>
	<li>一旦获得稳定信号，即使用IDAC系统配套软件开始记录信号（图4A-D）。点击开始记录按钮以启动记录。</li>
	<li>使用电动操作器将刺激用玻璃毛细管尖端移至味觉感器顶端，使其覆盖感器尖端。</li>
	<li>结束刺激时，使用电动操作器将玻璃刺激毛细管从感器上移开。</li>
	<li>使用脚踏开关手动标记刺激的开始和结束。脚踏开关连接至IDAC，通过IDAC与软件通信，以标记刺激的起始和终止时间点。</li>
</ol>
8. 分析
<ol>
	<li>使用 IDAC 系统配套软件的不同功能，按振幅（在可能的情况下）对峰电位群体进行分类，并分析其响应动力学。
	<ol>
		<li>为计数峰电位，左键单击感兴趣的记录，弹出可供选择的窗口。选择 转为峰电位，将启动另一个名为将波形转换为峰电位的窗口。在 新建 字段中输入 名称，然后点击 确定 按钮。</li>
		<li>在步骤 8.1.1 的 新建 字段中输入名称后，将进入 振幅直方图 视图。选择要计数的 振幅，然后关闭此视图。左键单击以添加计数器。</li>
		<li>手动检查峰电位，以确认基于软件分析所得出的结论。 
		注意：该软件还支持以不同格式导出数据，以便进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

A Novel Method for Enhanced Analysis of Insect Taste Neuron Activity

<ol><li>Joseph, R. M., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+chemoreceptors%3A+a+molecular+interface+between+the+chemical+world+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain.</a> Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).</li>
<li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+sensory+receptors-a+set+of+molecular+Swiss+Army+Knives%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives.</a> Genetics. 217 (1), 1-34 (2021).</li>
<li>Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+logic+and+evolution+of+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila.</a> Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).</li>
<li>Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila.</a> Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).</li>
<li>He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+sensilla+of+the+Drosophila+wing+express+a+candidate+ionotropic+pheromone+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor.</a> PLoS Biol. 17 (5), e2006619(2019).</li>
<li>Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+taste+coding+in+the+legs+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila.</a> J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).</li>
<li>Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labellar+taste+organs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Labellar taste organs of Drosophila melanogaster.</a> J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).</li>
<li>Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+antagonistic+gustatory+receptor+neurons+responding+to+sweet-salty+and+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila.</a> J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).</li>
<li>Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+organs+of+Drosophila+melanogaster%3A+fine+structure+and+expression+of+the+putative+odorant-binding+protein+PBPRP2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2.</a> Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).</li>
<li>Siddiqi, O., Rodrigues, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+a+complex+chemoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of a complex chemoreceptor.</a> Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).</li>
<li>Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+taste+receptors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Candidate taste receptors in Drosophila.</a> Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).</li>
<li>Koh, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+IR20a+clade+of+ionotropic+receptors+are+candidate+taste+and+pheromone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors.</a> Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).</li>
<li>Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expression+atlas+of+variant+ionotropic+glutamate+receptors+identifies+a+molecular+basis+of+carbonation+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing.</a> Nat Commun. 9 (1), 4252(2018).</li>
<li>Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+mechanisms+of+taste+coding+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila.</a> Sci Adv. 9 (46), (2023).</li>
<li>Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Gr5a+encodes+a+taste+receptor+tuned+to+trehalose%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 2 14526-14530 (2003).</li>
<li>Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Gr+genes+underlie+sugar+reception+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila.</a> Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).</li>
<li>Delventhal, R., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bitter+taste+receptors+confer+diverse+functions+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons.</a> Elife. 5, e11181(2016).</li>
<li>Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ir56b+is+an+atypical+ionotropic+receptor+that+underlies+appetitive+salt+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila.</a> Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).</li>
<li>Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+response+to+sugars+among+labellar+chemosensilla+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila.</a> Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).</li>
<li>Jeong, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+odorant-binding+protein+required+for+suppression+of+sweet+taste+by+bitter+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals.</a> Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).</li>
<li>Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+gustatory+receptor+required+for+the+responses+to+sucrose%2C+glucose%2C+and+maltose+identified+by+mRNA+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).</li>
<li>Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gr64f+is+required+in+combination+with+other+gustatory+receptors+for+sugar+detection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila.</a> Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).</li>
<li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRPA1+channel+mediates+chemical+avoidance+in+gustatory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).</li>
<li>Lacaille, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+sex+pheromone+tastes+bitter+for+Drosophila+males%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males.</a> PLoS One. 2 (7), e661(2007).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+receptors+required+for+avoiding+the+insecticide+L-canavanine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine.</a> J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).</li>
<li>Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+DEET+through+insect+gustatory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Avoiding DEET through insect gustatory receptors.</a> Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).</li>
<li>Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+gustatory+receptors+required+for+the+caffeine+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).</li>
<li>Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+gustatory+receptor+required+for+strychnine+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation.</a> Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).</li>
<li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+coding+of+bitter+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Peripheral coding of bitter taste in Drosophila.</a> J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).</li>
<li>Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taste+receptor+required+for+the+caffeine+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A taste receptor required for the caffeine response in vivo.</a> Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).</li>
<li>Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+gustatory+receptor+essential+for+aversive+taste+and+inhibiting+male-to-male+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship.</a> Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).</li>
<li>Rimal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+acetic+acid+gustatory+repulsion+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila.</a> Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).</li>
<li>Shim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+full+repertoire+of+Drosophila+gustatory+receptors+for+detecting+an+aversive+compound%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound.</a> Nat Commun. 6, 8867(2015).</li>
<li>Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+a+threat+of+the+Anthropocene%3A+Taste+avoidance+of+metal+ions+by+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119(2022).</li>
<li>Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+for+attractive+salt-taste+coding+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila.</a> Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).</li>
<li>Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+from+Drosophila+labellar+taste+sensilla%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla.</a> J Vis Exp. (84), e51355(2014).</li>
<li>Marella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+taste+responses+in+the+fly+brain+reveals+a+functional+map+of+taste+category+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior.</a> Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).</li>
<li>Thorne, N., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+expression+of+Drosophila+gustatory+receptor+genes+in+sensory+and+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons.</a> J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).</li>
<li>Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+representations+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Taste representations in the Drosophila brain.</a> Cell. 117 (7), 981-991 (2004).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在某些类型感器的记录中，区分不同神经元的峰电位可能具有挑战性。例如，S型和I型感器中的糖敏感神经元和机械感受神经元产生的峰电位幅度相似，难以将其区分开来4,14我们发现，使用非常尖锐的钨记录电极可以减少机械感受神经元的放电，记录电极的合理放置也能起到同样作用。将记录电极插入感受器窝的套环部位（即 进入基部但不深入）通常会导致机械感觉刺激减弱。此外，我们发现，如果记录到机械感觉神经元的放电水平较高，撤回记录电极并将其相对于感受器置于不同位置，往往会使放电水平降低。
在整个实验过程中确保记录电极的稳定性是另一个关键问题（见图4E）。机械干扰或电极位置的移动可能会对记录质量产生不利影响。投入时间和精力进行充分准备（如上述方案中所述），是避免因唇瓣移动而导致挫败感的关键。
我们注意到，某些化合物会引起I-a类I型感器产生ON和OFF两种反应，而这类化合物还存在另一个问题14。有时，再次施加刺激后仅能引发OFF反应，而无法引发ON反应。目前尚不清楚导致ON反应减弱的原因。
在基础记录过程中遇到的另一个挑战是，并非所有感受器都易于进行记录，这是由于它们在唇瓣上的位置所致。在31个唇瓣感受器中，仅有26个便于记录，这构成了该技术的一项局限性，如图3B所示。然而，原则上，通过旋转奥林巴斯显微镜的机械XY载物台，可以使这些感受器（I8、I9、I10、L9和S10）变得可及。
最后，我们强调投入精力进行果蝇制备的重要性。制备良好的果蝇在实验过程中更有可能获得可靠且高质量的记录结果。此外，可使用蔗糖作为阳性对照以确保记录质量；蔗糖能够引发唇瓣所有感受器的反应。

包括果蝇科昆虫在内的昆虫拥有复杂的味觉系统，使其能够从周围环境中获取复杂的化学信息。该系统使它们能够分辨不同物质的化学成分，区分有营养的物质和有害物质1，2。
该系统的核心是被称为味觉毛或感觉器的特化结构，它们分布在身体的多个部位。在果蝇科昆虫中，这些感觉器位于唇瓣上，唇瓣是果蝇头部主要的味觉器官1,2,3,4，同时也分布于腿部和翅膀上1,2,5,6。唇瓣位于喙的末端，包含两个叶状结构4,7,8。每个叶状结构上覆盖有31个味觉感觉器，根据形态分为短型、长型和中间型4,7,8。每个感觉器内含有2–4个味觉神经元1,2,9,10。这些味觉神经元表达至少四个不同基因家族的成员，即Gustatory receptor (Gr)（味觉受体）、Ionotropic receptor (Ir)（离子型受体）、Pickpocket (Ppk) 和 Transient receptor potential (Trp) 基因1,2,11,12,13。这些受体和通道的多样性使昆虫能够识别多种化学物质，包括非挥发性和挥发性化学信号1,2,14。
50 多年来，科学家一直使用一种称为尖端记录的技术来量化味觉神经元及其受体的反应3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 
29,30,31,32,33,34,35。然而，该方法存在重大局限性。首先，只能在刺激物接触期间测量神经活动，而无法在接触前或接触后进行测量。这一限制排除了对自发性放电活动的测量，并阻碍了对刺激移除后反应（OFF 反应）的测量。其次，仅能测试可溶于水溶液的呈味物质。
这些局限性可以通过一种很少使用的替代性电生理技术——“&#34;基部记录&#34;——加以克服。本文介绍了该技术，我们对该方法的改进源自Marion-Poll及其同事所使用的一种方法24，并展示了该技术目前可便捷测量的关键味觉编码特征14。

<table><tbody><tr><td>显微镜</td><td>奥林巴斯</td><td>BX51WI</td><td>配备50倍物镜（LMPLFLN 50X，Olympus）和10倍目镜。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>防振台</td><td>TMC</td><td>63-7590E</td><td></td></tr><tr><td>电动显微操作器</td><td>哈佛仪器公司与M&amp;auml;rzh&amp;auml;用户显微操作仪</td><td>PM 10 压电微操作器</td><td></td></tr><tr><td>手动显微操作器</td><td>M&amp;auml;rzh&amp;auml;用户显微操作仪</td><td>MM33 微操作仪</td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>ENCO</td><td>型号 #625-0930</td><td></td></tr><tr><td>参考文献&amp;nbsp; 和记录电极架</td><td>Ockenfels Syntech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>刺激玻璃毛细管夹持器</td><td>Ockenfels Syntech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>通用单端探针</td><td>Ockenfels Syntech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4通道USB交流采集控制器，IDAC-4</td><td>Ockenfels Syntech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>刺激控制器</td><td>Ockenfels Syntech GmbH</td><td>刺激控制器 CS 55</td><td></td></tr><tr><td>个人计算机</td><td>戴尔</td><td>Vostro</td><td>检查与数字采集系统和软件的兼容性</td></tr><tr><td>钨棒</td><td>A-M Systems</td><td>货号#716000</td><td></td></tr><tr><td>铝箔和/或法拉第笼</td><td></td><td></td><td>电磁噪声屏蔽</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>世界精密仪器公司</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>Model P-97 Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>VMZ 1x-4x</td><td>果蝇准备</td></tr><tr><td>p200 移液器吸头</td><td></td><td></td><td>通用</td></tr><tr><td>微量移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td></td><td></td><td>通用型</td></tr><tr><td>鳄鱼夹</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电力变压器</td><td>STACO 能源产品</td><td>STACO 3PN221B</td><td>由 P1000 移液器吸头、柔性塑料管和网状材料组装而成</td></tr><tr><td>油泥</td><td></td><td></td><td>通用型</td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td>通用型</td></tr><tr><td>塑料管</td><td>圣戈班</td><td>Tygon S3&amp;trade; E-3603</td><td></td></tr><tr><td>标准培养瓶</td><td>Archon Scientific</td><td></td><td>窄口1盎司聚苯乙烯小瓶，每个含10 mL葡萄糖培养基，并预装醋酸纤维素塞</td></tr><tr><td>盐酸小檗碱（BER）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 Y0001149</td><td></td></tr><tr><td>苯甲地那铵（DEN）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 D5765</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二乙基-间甲苯甲酰胺（DEET）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号 36542</td><td></td></tr></tbody></table>

基础记录：一种分析味觉神经元反应的技术 果蝇

Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila

昆虫通过其末端具有孔隙的味觉毛或称感器来感知外界环境。当感器接触到潜在的食物来源时，食物中的化合物会经由孔隙进入并激活内部的神经元。50多年来，这些神经反应一直通过一种称为“尖端记录”的技术进行测量。然而，该方法存在重大局限性，包括无法在刺激物接触前后测量神经活动，以及要求味觉物质必须可溶于水溶液。本文介绍一种我们称之为“基部记录”的技术，可克服上述局限。基部记录能够在刺激物接触前、接触期间及接触后测量味觉神经元的活动，从而实现对味觉刺激结束后出现的“关闭反应”进行深入分析。该技术还可用于研究疏水性化合物，例如在水中溶解度极低的长链信息素。总之，基部记录兼具单感器电生理学技术的优势——能够以高空间和时间分辨率测量神经元活动，且无需依赖遗传工具，同时克服了传统尖端记录技术的关键局限。

图4A 显示了来自一个感器的自发性动作电位。这些动作电位根据幅度可分为两类，其中幅度较大的来自对苦味化合物敏感的神经元，幅度较小的则来自对糖类有反应的神经元。动作电位幅度与功能特异性之间的关系已通过遗传学实验得到证实4,14,37,38,39。
图4B 显示了S5感受器中对苦味敏感的神经元对避蚊胺（DEET）气味的反应；该反应发生在避蚊胺溶液与感受器无任何直接接触的情况下。其中一个峰电位的幅度呈中等水平，可能是由两个较小峰电位叠加所致，分别来自糖敏感神经元和机械感受神经元。
图4C 显示了苦味刺激与I1感受器接触后产生的ON反应，以及接触终止后出现的OFF反应。需要注意的是，以每秒峰电位数（spikes/s）衡量的OFF反应幅度大于ON反应。
图4D 显示了另一种果蝇 Drosophila virilis 的 I1 感觉毛对苦味化合物小檗碱产生的 ON 和 OFF 反应。该技术的一个优势在于，无需向生物体引入任何转基因，即可应用于其他物种，包括蚊子。
图4E 展示了记录过程中可能出现的两个问题。首先，如果唇瓣未被妥善固定，其移动可能会引发感器中机械感觉神经元的放电尖峰。其次，记录电极可能会从感器中脱出，这种情况通常由唇瓣的移动引起。此时将失去接触，必须重新插入电极以记录放电尖峰。
<img alt="使用黏土和盖玻片固定果蝇的装置，显示在显微镜实验示意图中。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66665/66665fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：用于基础记录的果蝇准备。 一个修剪过的移液器吸头中包含一只雌性果蝇，其喙部牢固地放置在玻璃盖玻片上。(A) 移液器吸头和盖玻片均通过黏土堆牢固固定。(B) 喙部置于盖玻片上的高倍放大图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66665/66665fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电生理实验中用于电极定位的显微操作仪装置，如标注图所示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66665/66665fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：电生理实验装置示意图。（A）整体示意图，显示用于参考电极的手动显微操作仪、用于玻璃刺激毛细管的电动显微操作仪，以及用于记录电极的电动显微操作仪的位置。（B）显示参考电极、玻璃刺激毛细管和记录电极固定装置的概览图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66665/66665fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="使用玻璃刺激毛细管和电极记录昆虫感器的电生理装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66665/66665fig03v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：唇瓣与感器。（A）倒置显微镜下的唇瓣。唇瓣的放大图像，显示唇瓣一个叶上的味觉感器。图中还显示了靠近一种称为L2（大型2型）的大感器的刺激用玻璃毛细管，以及插入该感器基部的记录电极。（B）唇瓣感器的可及性。图示唇瓣上易于进行基部记录的感器，以及由于在常规制备位置中较难接近而不易记录的感器。缩写：A = 前部；M = 中部；P = 后部；L = 侧部。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66665/66665fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电生理学尖峰轨迹；动作电位；感器神经元记录；示意图；刺激反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66665/66665fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：自发性尖峰、苦味神经元反应及次优记录的示例轨迹。 （A）自发性尖峰的示例轨迹。尖峰来自I1感器中的苦味敏感神经元（红点）和糖敏感神经元（绿点）。在感器示意图中，苦味、糖和机械感受神经元分别以红色、绿色和黑色表示。（B）S5感器中苦味神经元（红点）对1 mM DEET蒸气反应的示例轨迹。注意，小幅度尖峰来自糖神经元和机械感受神经元，在本示例轨迹中难以通过幅度区分。缩写：DEET = N,N-二乙基-间甲苯甲酰胺。（C）I1感器中苦味神经元对1 mM苯甲地那铵的开（ON）和关（OFF）反应示例轨迹。在接触刺激物之前（自发放电）、期间（ON反应）和之后（OFF反应）均可观察到尖峰。缩写：DEN = 苯甲地那铵。（D）D. virilis I1感器中苦味神经元对0.5 mM盐酸小檗碱的ON和OFF反应示例轨迹。在接触前、接触期间和接触后均可观察到尖峰。缩写：BER = 盐酸小檗碱。（E）次优记录的示例轨迹。由于唇瓣移动，实验中途接触丢失。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66665/66665fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

一种很少使用但具有独特优势的电生理记录方法——基部记录法，能够分析味觉编码的某些特征，而这些特征是传统记录方法无法检测的。基部记录法还能够分析对疏水性刺激物的味觉反应，而这类刺激物无法通过传统的电生理学方法进行研究。

昆虫通过其末端具有孔隙的味觉毛或称感器来感知外界环境。当一个感器接触到潜在的……

我们的实验室致力于研究动物如何感知和响应气味、味觉以及某些信息素。我们在理解化学感受的分子基础方面取得了重要进展。我们在该领域取得了一系列突破，包括首次发现了昆虫的气味受体和昆虫的味觉受体。以及阐明气味和味觉编码逻辑的基本原理。该技术可测量刺激前、刺激期间和刺激后的测试神经元活动，从而能够对测试刺激后发生的一系列反应进行深入分析。该技术还可实现对神经元活动响应挥发性化合物气流的测量。传统的电生理检测技术无法测量神经元对疏水性化合物的响应，例如在水中扩散能力极弱的长链信息素。然而，借助该技术，我们可以通过将记录电极与玻璃刺激毛细管分离，从而克服这一局限性。我们的研究探索动物化学感受系统的工作机制，重点关注其在摄食和交配选择中的作用。目前，我们正在研究非编码RNA和微小肽，以及果蝇的嗅觉系统，并探讨蚊子和采采蝇如何利用这些系统寻找人类宿主。首先将10至15只新羽化的黑腹果蝇放入新鲜的标准培养瓶中。将这些小瓶置于25摄氏度、60%相对湿度条件下，保持12小时光照与12小时黑暗的循环。为准备用于盛装刺激物的玻璃毛细管，应选择硼硅酸盐玻璃毛细管，并使用拉管仪将其拉制。然后取钨棒作为参考电极和记录电极。将这些电极反复浸入10%硝酸钾溶液或氢氧化钾溶液中数秒，以将其尖端拉制至直径一微米。为从试剂瓶中吸取一只果蝇进入吸管，需小心抽出吸管，并用手指堵住吸管末端以困住果蝇。现在，将吸管的一端保持在200微升移液枪头内，并用该端推动果蝇，使其头部朝前移向枪头的狭窄端。使用剃须刀片，将枪头位于果蝇前方和后方的两端剪去。借助黏土或一小块棉花，进一步将果蝇向前推动，直至其头部的一半从剪短后的枪头末端伸出。使用镊子轻轻暴露头部前端的唇瓣。在体视显微镜下，将唇瓣侧向放置于盖玻片上，确保其中一个带有31个味觉感器的叶状结构暴露出来。首先，将载有果蝇唇瓣的玻片置于显微镜载物台上，使用低倍镜观察。使用手动显微操作器，将参考电极插入与记录电极所在眼相对的另一只眼中。接着，在低倍和高倍物镜下，使用电动显微操作器将玻璃刺激毛细管的尖端对准视野末端。然后在低倍镜下使用第二个电动显微操作器，将记录电极移近唇瓣。在高倍镜下，将记录电极插入味觉感器基部。持续插入，直至从IDAC系统的音频输出中听到神经元放电活动的声音。一旦检测到稳定信号，按下开始记录按钮，使用与IDAC系统配套的软件启动信号记录。使用电动操纵器调节刺激用玻璃毛细管的尖端，使其覆盖味觉感器的尖端。刺激结束时，使用电动操纵器将玻璃刺激毛细管从感器上移开。根据动作电位的幅度，将感器的动作电位分为两类。较大的峰形脉冲来自对苦味敏感的神经元，而较小的峰形脉冲则来自对糖敏感的神经元。S-5 感觉器中对苦味敏感的神经元对避蚊胺（DEET）气味产生反应，表明在无物理接触的情况下发生了感觉激活。当接触到苦味刺激物时，I-1 感觉器出现一个较弱的“开”反应，而在接触终止时则跟随一个更强的“关”反应。

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基础记录:一种分析果蝇味觉神经元反应的技术

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