Name: 从下腔静脉连续采集血液，然后进行门静脉采集以评估小鼠的肠道微生物代谢物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 9 s
Description: 学习从小鼠门静脉和下腔静脉连续采血的方法，用于评估肠道微生物代谢物特别是短链脂肪酸的产生与吸收。该技术可准确反映体内代谢物浓度，为研究肠道微生物与肺部免疫反应的关联提供可靠手段。

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AP 由美国国立卫生研究院/国家心脏、肺和血液研究所（NIH/NHLBI）的 R01 项目（1R01HL14653）资助。DM 由美国国立卫生研究院（NIH）的 T32 培训基金以及加州大学旧金山分校贝尼奥夫微生物组医学中心的培训生/工作人员启动奖资助。

本非存活手术的所有步骤均经加州大学旧金山分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。所用小鼠的性别与品系为雄性 C57BL/6J 小鼠（体重 25–35 g，年龄 12–15 周）。也可使用雌性或/和其他标准小鼠品系。
1. 麻醉
<ol>
	<li>用70%乙醇棉片擦拭小鼠腹部下半部分。通过腹腔注射三溴乙醇（250–400 mg/kg）进行麻醉。也可使用氯胺酮/赛拉嗪或异氟烷进行麻醉。在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止角膜损伤。</li>
	<li>腹腔注射布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg）以进行镇痛。 
	注意：由于剖腹手术会引起疼痛，必须使用布托啡诺。&#160;</li>
</ol>
2. 剖腹手术
<ol>
	<li>将麻醉后的小鼠仰卧置于手术台面（台面下放置加热垫）上，用胶带固定小鼠四肢。通过脚趾刺激确认麻醉深度是否合适&#160;无缩足反射的夹捏</li>
	<li>提起皮肤，用解剖剪做一纵向切口&#160;从脐部沿中线向剑突方向以及向尾侧至腹部基底部（外生殖器）剪开。</li>
	<li>使用解剖剪在腹膜上做一个类似的切口，注意不要穿孔或损伤肠道、膈肌或肝脏。</li>
	<li>扩大手术视野&#160;做一个贯穿全长的横向切口&#160;在脐部两侧用剪刀横向剪开（以扩大腹部宽度）。</li>
	<li>使用浸有温PBS的干净纱布将大肠和小肠移至术者右侧，以暴露下方的下腔静脉。</li>
</ol>
3. PV 结扎准备
<ol>
	<li>用棉签在手术视野内轻柔地移动肠段，以在肠系膜根部找到门静脉（PV）。</li>
	<li>使用解剖显微镜观察血管及其他腹部结构&#160;结构，小心地将7-0 Prolene缝线穿过靠近肝门部的门静脉后方（位于肠系膜下静脉与脾静脉之间）19 以便在第5步中进行连接反应（图1). 
	注意：从这一步开始，使用显微镜并非强制要求，但可显著改善&#160;整个操作的成功率。</li>
</ol>
4. 从下腔静脉采集血样
<ol>
	<li>将肝素化1 mL胰岛素注射器上的28G ½英寸针头插入下腔静脉（IVC），采集0.2–0.3 mL血液样本。 
	注意：如果此步骤中采集的血液过多，将导致第5步中门静脉（PV）血液采集量减少&#160;&#160;。</li>
	<li>将针头保留在下腔静脉内，以避免拔出时引起出血。</li>
</ol>
5. 从门静脉采集血液样本
<ol>
	<li>用7-0 Prolene缝线轻轻结扎门静脉（PV）；随着血液回流，门静脉应逐渐扩张。将另一支肝素化1 mL胰岛素注射器的28G ½英寸针头插入门静脉。</li>
	<li>缓慢抽吸，从门静脉采集最多0.3–0.5 mL血液。门静脉可能会塌陷，但应随着肠系膜静脉系统的血液重新充盈而逐渐再次扩张。</li>
</ol>
6. 样品储存
<ol>
	<li>采血后从下腔静脉和门静脉中移除针头。</li>
	<li>将注射器中的血液样本转移至1.5 mL肝素化&#160;eppendorf&#160;管中，并将&#160;样本置于冰上，后续处理为血浆，用于储存和按需分析。</li>
	<li>采用麻醉过量法处死小鼠，随后进行颈椎脱位（依照加州大学旧金山分校IACUC批准的指南）。</li>
</ol>

Improved Blood Sampling Technique to Assess Gut Microbial Metabolites in Mice

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<li>Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+dietary+fiber+to+host+physiology%3A+Short-chain+fatty+acids+as+key+bacterial+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">From dietary fiber to host physiology: Short-chain fatty acids as key bacterial metabolites.</a> Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文描述了一种创新的 体内 近似同步连续采集血液样本的方法&#160; 从小鼠的下腔静脉（IVC）和门静脉（PV）采集血液样本。该方法适用于检测肠道微生物群产生的、经门脉循环转运的代谢产物（如短链脂肪酸，SCFAs）的水平。在终末取血实验中，每只体重为25–30 g的小鼠平均最大采血量约为1 mL，相当于其总循环血量的50%。18然而，获得足够的&#160;从两个相互作用的个体中采集血液，用于所需的实验测量&#160;且邻近的静脉系统可能具有挑战性。小鼠门静脉（PV）的血管内压仅比下腔静脉（IVC）高3-5 mmHg。25，因此减少&#160;门静脉（PV）内的压力升高可导致下降&#160;下腔静脉（IVC）内的压力 反之亦然此外，小鼠的门静脉系统由来自肠系膜和脾脏的多条血管分支组成26，相对较小且脆弱。因此，使用解剖显微镜可准确识别门静脉及其相关分支，并防止门静脉和下腔静脉塌陷&#160;对本实验的成功至关重要。
本方案的创新之处在于采血前结扎&#160;门静脉（PV）。阻断门静脉向肝脏的血液引流可增加门静脉内的压力，从而使其扩张27，进而便于采血，并增加门静脉系统可采集的血量。然而，门静脉结扎会减少静脉回心血量，导致下腔静脉（IVC）迅速塌陷，使得&#160;难以将针头插入下腔静脉，并限制可采集的血量。因此，本方案建议在结扎并阻断远端&#160;门静脉之前，首先从下腔静脉抽吸血液。必须注意避免从下腔静脉采集过多血液&#160;，因为这&#160;可能导致门静脉发生显著且不可恢复的塌陷，即使在门静脉结扎后亦然。此外，结扎门静脉还有助于避免门静脉血与肝静脉血混合。值得注意的是，本方案中采集的血液样本量足以用于进一步的研究，如代谢组学分析、细胞因子检测以及肠道通透性测定：下腔静脉采血量为 0.2–0.3 mL，门静脉采血量为 0.3–0.5 mL。
本文介绍的门静脉/下腔静脉（PV/IVC）采血方法存在一些局限性。首先，从下腔静脉采集的血液可能无法完全代表全身循环血液，可能会高估身体下部（尾侧半部）的贡献，同时低估上部（头侧）部分的贡献。其次，门静脉结扎可能导致肠道及其他腹腔器官的静脉充血。因此，应在门静脉结扎后立即采集血液，以避免因肠系膜系统回流受阻以及肠道屏障可能受损而产生的非目标代谢产物混入样本。第三，由于该方法属于非存活性/终末性操作，无法在不同时间点连续采集血样以监测生物学上的时间动态变化。与心脏穿刺这一获取全身循环血液的常用且可靠的方法相比，本方法的优势在于保留了完整的膈肌，使动物能够持续自主呼吸。根据我们的经验，保持&#160;膈肌完整对于&#160;经&#160;门静脉和下腔静脉进行序贯性静脉采血&#160;至关重要。

短链脂肪酸（SCFA）是一类由肠道微生物群产生的主要代谢产物。它们在肠道微生物组与其他远端器官相互作用中发挥关键作用1 已得到相关研究的描述支持&#160;它们如何调节炎症、通过特异性受体传递信号，以及作为底物参与&#160;细胞代谢2,3,4,5近期研究&#160;我们课题组已提出，短链脂肪酸（SCFAs）是关键因素 体内 肺部免疫稳态的炎症调节因子 体内 通过肠-肺轴6,7. 其他研究已描述其通过肠-脑轴对代谢产生的功能影响8,9总体而言，众多研究团队正在积极深入地探究短链脂肪酸（SCFAs）对宿主生理学和病理学的影响，涵盖多种疾病过程。
乙酸盐（C2）、丙酸盐（C3）和丁酸盐（C4）是主要的短链脂肪酸（SCFAs），由肠道微生物群在盲肠和大肠中通过可摄入膳食纤维的发酵产生。这三种短链脂肪酸&#160;也可直接从饮食中获取，其中只有&#160;乙酸盐可由哺乳动物细胞产生。短链脂肪酸在结肠中被吸收，并部分被肠上皮细胞利用（作为能量来源、用于局部组织的免疫调节以及维持肠道&#160;屏障功能）。它们还通过肠系膜静脉系统进入门静脉10。丁酸盐主要被肠上皮细胞消耗，丙酸盐主要在肝脏中被利用11,12，&#160;而乙酸盐进入外周循环后，已被报道可作用于肌肉和脂肪组织13,14。
全面评估短链脂肪酸（SCFA）的产生、吸收及其功能活性，需要了解结肠腔内、门静脉循环及外周血中的SCFA水平。这可以通过在同一动物中同时或依次从门静脉（PV）和体循环采集血液来实现。由于SCFA具有挥发性15，测定排出的粪便颗粒中的SCFA水平可能&#160;无法准确反映结肠内的实际水平。此外，与结肠内容物的测定相比，门静脉中SCFA的水平可能更能准确反映宿主吸收的稳态水平与肠道微生物组在整个结肠长度上不均一产生的SCFA水平之间的净平衡&#160;11。因此，门静脉中的SCFA水平对于研究SCFA对宿主生理和病理的影响（超出其在肠道内的局部作用）可能更具相关性和适用性。
为了协调并近乎同步地采集门静脉（PV）和体循环血液，应保持膈肌完整，以维持正常的血液循环并支持自主呼吸。因此，下腔静脉（IVC）是采集体循环血液同时获取PV血液的理想部位。该IVC血液还可用于其他用途，例如检测循环细胞因子以评估全身性炎症。
目前，仅有少数几种方法可用于从较大啮齿类动物的体循环和门静脉（PV）采集血液16,17。传统方法需要对大鼠的血管进行插管，但在小鼠中实施这些技术上较为困难。此外，这些方法采集的血液最大量通常不超过 0.3 mL18。
本文介绍了一种简化在同一小鼠中先后经下腔静脉（IVC）和门静脉（PV）进行双重采血过程的新方法&#160;。该方法的独特之处在于门静脉采血前，先在肝门附近结扎门静脉。该操作可扩张门静脉管径，从而显著提高采血成功率，并将最大可采集血量增至0.5 mL。

<table><tbody><tr><td>2,2,2 三溴乙醇，97%（Avertin）</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T48402-25G</td><td>麻醉剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡注射液 0.3 mg/mL</td><td>PAR Pharmaceutical&amp;nbsp;</td><td>NDC 42023-179-05</td><td>镇痛剂</td></tr><tr><td>敷料镊</td><td>Miltex&amp;nbsp;</td><td>6-100</td><td>解剖&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Graefe 镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5136</td><td>解剖&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>肝素钠 1000 USP 单位/mL</td><td>Hikma</td><td>NDC 0641-0391-12</td><td>血液样本注射器/管肝素化</td></tr><tr><td>Prolene 7-0</td><td>Ethicon</td><td>8696G</td><td>门静脉结扎</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>F.S.T</td><td>14058-11</td><td>解剖&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>学生型 Halsted-Mosquito 止血钳</td><td>F.S.T&amp;nbsp;</td><td>91308-12</td><td>解剖&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>手术胶带&amp;nbsp;</td><td>3M Transpore</td><td>1527-1</td><td>小鼠肢体固定</td></tr><tr><td>U-100 胰岛素注射器 28G 1/2</td><td>EXEL</td><td>26027</td><td>血液样本采集&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

从小鼠下腔静脉依次采集血液，随后采集门静脉血，以评估肠道微生物代谢物

Sequential Blood Collection from Inferior Vena Cava Followed by Portal Vein to Evaluate Gut Microbial Metabolites in Mice

肠道微生物产物不仅可在肠道内局部发挥作用，还可被吸收进入循环系统，从而对多种远端器官系统产生影响。短链脂肪酸（SCFA）是肠道微生物在发酵不可消化膳食纤维过程中产生的一类代谢物，目前已被广泛认知&#160;作为肠道微生物组通过肠-肺轴、肠-脑轴及其他肠-器官轴影响肠外器官系统的重要介导因子。短链脂肪酸（SCFAs）从结肠经肠组织吸收，&#160;门静脉（PV）。随后它们经过肝脏，并在脑、肌肉、脂肪组织和肺等不同器官中被消耗。短链脂肪酸（SCFAs）最易在排出的粪便中检测，但更准确的测量结果来自结肠内粪便内容物。本文提出，采集单个受试者的门静脉及体循环血浆样本可能更有利于研究&#160;吸收、运输及小鼠体内短链脂肪酸（SCFAs）的系统水平。我们介绍一种从门静脉（PV）和下腔静脉（IVC）高效采血的新技术，可从门脉循环和体循环中采集相对大量的血液。该方法通过结扎门静脉实现，从而允许&#160;用于静脉导管（PV）的扩张或增粗，因其通过回流来自汇入其中的肠系膜静脉的血液而充盈。采用该方法后，我们成功提高了采血成功率以及总采血量（从下腔静脉（IVC）可采集至多0.3 mL，从PV可采集至多0.5 mL）。

采用上述方法，我们可以在同一只小鼠中依次从下腔静脉（IVC）和门静脉（PV）采集血液样本，成功率超过95%。采集到的血液样本平均体积分别为：IVC 0.25 mL，PV 0.35 mL。
采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），我们测定了粪便、门静脉血和下腔静脉血中短链脂肪酸（SCFAs）的浓度，从而能够追踪乙酸盐（C2）、丙酸盐（C3）和丁酸盐（C4）从结肠腔（由肠道细菌发酵产生）向体循环吸收和转运的过程。
具体而言，在这些实验中，我们研究了膳食纤维摄入对小鼠短链脂肪酸（SCFAs）生成的影响。我们给小鼠喂食高纤维饮食（35% 纤维）1 周或 2 周，并与喂食无纤维饮食的小鼠进行比较。我们预期并观察到高纤维组中纤维发酵菌群的分类群有所增加（数据未显示）。接下来，我们检测了结肠内容物、门静脉（PV）血液以及全身循环（下腔静脉，IVC）血液中的 SCFAs 水平（由密歇根大学代谢组学核心设施通过气相色谱-质谱法（GC-MS）定量）3（图 2）。尽管我们在门静脉样本中能够检测到随着膳食纤维摄入而出现的 SCFAs 水平一致升高，但与门静脉和下腔静脉血液中的测量结果相比，结肠粪便样本中 SCFAs 的测量值在不同小鼠之间差异更大（乙酸、丙酸和丁酸在结肠粪便与门静脉/下腔静脉血液中的比较见 图 2）。这种变异性可能是由于 SCFAs 在粪便中分布不均，也可能反映了肠道上皮对 SCFAs 吸收的个体差异。然而，就研究 SCFAs 对宿主肠外生理功能影响而言，门静脉及外周循环中的 SCFAs 水平可能更具研究相关性。
通过比较门静脉（PV）与全身下腔静脉（IVC）血液中的短链脂肪酸（SCFA）水平，我们还能够观察肝脏对乙酸盐和丙酸盐的吸收情况（图 2A、B）。乙酸盐在经肝脏后仍保留在全身循环血液中的比例（相较于门静脉）高于丙酸盐（超过50%的门静脉乙酸盐进入外周循环，而丙酸盐则不足30%）。这与以往研究结果一致：丙酸盐主要被肝脏吸收或利用，进入全身循环的量较少；而乙酸盐则可能在外周其他组织（如肌肉组织）中被吸收或利用13，20（图 2A、B）。然而，先前多个研究团队的工作表明，进入全身循环的丙酸盐水平仍足以显著影响远端器官的生理与病理过程21，22，23，24。
此外，我们发现门静脉和系统循环血液中的丁酸浓度远低于丙酸，尽管粪便中丁酸和丙酸的浓度相当接近。这些结果证实了以往的研究，即结肠中由肠道菌群产生的丁酸大部分被吸收，并被肠上皮细胞局部利用。11 (图 2C)。
通常，在进行腹部解剖时，可观察到门静脉（PV）的管径小于下腔静脉（IVC）（图3A）。然而，在门静脉周围缝线结扎（位置约在肝门下方4 mm处）并完成血管结扎后，门静脉会扩张，其直径几乎达到结扎前下腔静脉的原始大小（图3B）。如图所示，门静脉结扎后，下腔静脉出现轻微塌陷（图3B）。总体而言，该方法有助于最大限度地从小鼠门静脉收集血液。根据我们的经验，先采集门静脉血液再采集下腔静脉血液所获得的效果并不理想，原因是我们在采集门静脉血液后观察到下腔静脉发生明显塌陷。
<img alt="显示门静脉解剖结构和血流路径的肝静脉结扎示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66673/66673fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：门静脉（PV）结扎。 缝线穿过十二指肠静脉与脾静脉之间的门静脉后方。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66673/66673fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较粪便、门静脉血和血浆中C2、C3、C4水平的箱线图；分析纤维饮食的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66673/66673fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：粪便、门静脉（PV）血液和体循环静脉血中短链脂肪酸（SCFA）的浓度。 测定了三组不同实验小鼠的SCFA水平，包括无纤维饮食2周组（n=10只小鼠）、高纤维饮食1周组（n=9只小鼠）和高纤维饮食2周组（n=7只小鼠）。（A） 乙酸（C2），（B） 丙酸（C3）和（C） 丁酸（C4）。粪便中SCFA水平以每毫克粪便材料中的nM表示（左侧Y轴），门静脉和下腔静脉（IVC）血浆中SCFA水平以µM表示（右侧Y轴）。图中数据以均值±标准差（SD）表示。统计分析采用双尾非参数Mann-Whitney检验，p值&lt;0.05被认为具有显著性。p值表示方式如下：*p &lt; 0.05；**p &lt; 0.01；***p &lt; 0.001；****p &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66673/66673fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠肝门静脉结扎；标注的示意图显示手术步骤和解剖结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66673/66673fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：在距肝门下方4 mm处结扎后，小鼠门静脉（PV）发生扩张和膨胀。（A）门静脉结扎前的PV和下腔静脉（IVC）；（B）门静脉结扎后的PV和IVC。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66673/66673fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

该方案演示了一种依次从小鼠门静脉和下腔静脉采集血液的方法，以评估肠道微生物代谢物的产生与吸收情况。

已知肠道微生物产物既可在肠道内局部发挥作用，也可被吸收进入循环系统，其影响可延伸至多个器官和组织……

我们实验室的研究重点是理解肠道微生物组与肺组织之间的相互作用，以及肠道微生物组的组分如何直接影响肺部的免疫和炎症反应。我们特别关注特定代谢产物的作用，即短链脂肪酸。在实验小鼠中，乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸已被证实参与调控多种疾病过程。这些包括2型糖尿病中的脂质代谢、多发性软骨炎、病理性骨丢失、过敏性哮喘以及血脑屏障通透性。测量小鼠排出的粪便颗粒中的短链脂肪酸浓度最为方便。然而，这些粪便中的短链脂肪酸水平并不能可靠地反映结肠内体内实际存在的状况，更重要的是，也无法准确反映进入宿主循环系统的短链脂肪酸情况。我们认为，与粪便样本中测得的浓度相比，门静脉血中短链脂肪酸及其他代谢物的水平能更准确地反映体内稳态浓度。在肝门附近结扎门静脉可扩张门静脉管径，从而显著提高采血成功率，并增加可采集的最大血量。在将小鼠麻醉后，将其仰卧置于加热的手术台面上。涂抹眼药膏，并通过脚趾垫夹捏确认动物已充分麻醉。提起腹部皮肤，使用剪刀从脐部沿中线向剑突方向做纵向切口，并继续向腹部基底部延伸。在不穿孔或损伤肠管、膈肌或肝脏的情况下，对腹膜进行类似的切口。接着，在脐部两侧做全长横向切口以扩大手术视野。然后用浸有温热 PBS 的清洁纱布将大肠和小肠推向右侧，暴露下方的下腔静脉。用棉签轻轻移动手术视野内的肠段，以在肠系膜根部找到门静脉。然后使用解剖显微镜，在靠近肝门处的门静脉后方小心穿过一根7-0聚丙烯缝线。接下来，将一支经肝素处理的1毫升胰岛素注射器上所带的28号半英寸针头插入下腔静脉。采集 0.2 至 0.3 毫升血液样本。将针头保留在下腔静脉内，以避免拔出时引起出血。现在，用 7-0 丙线在门静脉周围轻轻打结。将另一支肝素化胰岛素注射器上连接的28号半英寸针头插入门静脉。回抽以缓慢采集最多0.5毫升门静脉血液。完成采血后，将针头从下腔静脉和门静脉中移除。将血液样本从注射器转移至1.5毫升肝素化离心管中。将离心管置于冰上，以备后续处理。

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