Name: 通过外膜周围氯化钙和弹性蛋白酶浸润的小鼠腹主动脉瘤模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: 了解利用氯化钙和弹性蛋白酶建立小鼠腹主动脉瘤模型的实验方法。该模型具有高发病率，病理生理变化与人类疾病相似，为研究腹主动脉瘤发病机制和开发治疗策略提供了安全、稳定且可重复的研究工具。

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本工作得到中国国家自然科学基金（编号：82300542、81770471）、四川省科技计划项目（编号：2022YFS0359、2019JDRC0104）以及四川大学华西医院博士后研究项目（编号：2023HXBH108）的资助。资助机构在研究设计、数据收集、分析与解释以及论文撰写过程中均未发挥任何作用。

动物实验方案遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》（NIH出版号86/23，1985年），并经四川大学华西医院 Institutional Animal Care and Use Committee 批准（批准号202311300012）。本研究采用8至10周龄雄性C57/B6J小鼠。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 术前准备
<ol>
	<li>在标准条件（温度 24 °C，湿度 40%-50%，12 小时光照-黑暗循环）下获取实验动物，并给予普通饲料和清洁饮水。</li>
	<li>将棉垫剪成 40 mm × 4 mm 的条状，并与剪刀、镊子及其他手术器械一同灭菌。</li>
	<li>将动物放入麻醉机的诱导室中，使用 3%-3.5% 异氟烷快速诱导麻醉（遵循机构批准的方案）。同时，给予布托啡诺（1 mg/kg，肌肉注射）作为预先镇痛药物。
	<ol>
		<li>当小鼠对疼痛刺激无反应时，将其从诱导室中取出，戴上麻醉面罩，并以 1%-1.5% 异氟烷维持麻醉深度。每 5-10 分钟监测一次呼吸频率和深度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠仰卧置于加热垫上，用胶带固定四肢，并涂抹眼膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>使用电动剃毛器或脱毛膏彻底清除腹部区域的毛发，然后用浸有聚维酮碘和乙醇的棉签以环形方式至少消毒三次。</li>
</ol>
2. 手术步骤
<ol>
	<li>将小鼠置于体视显微镜下。使用剪刀沿腹部正中线做一条长约 2–2.5 cm 的纵向切口。</li>
	<li>通过腹白线（linea alba）进入腹腔，放置牵开器以暴露腹腔，并用生理盐水浸湿的纱布将肠管和结肠推至腹腔右侧。</li>
	<li>使用镊子和棉签钝性分离腹主动脉和下腔静脉（IVC）下方结缔组织及脂肪组织。轻柔地游离腹主动脉，暴露腹主动脉与其上方腰大肌之间的间隙，操作方法如前所述25。
	<ol>
		<li>将灭菌的棉片条插入该间隙，操作时需格外小心，避免损伤腰动脉或腰静脉。无需将腹主动脉与下腔静脉完全分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 0.9 M CaCl2 浸润棉球，将其覆盖于腹主动脉外膜上，作用 15 分钟。在渗透过程中，使用灭菌纱布覆盖腹腔。</li>
	<li>轻柔移除浸有 CaCl2 的棉球，并用 0.9% 生理盐水冲洗渗透区域。</li>
	<li>用 ddH2O 将弹性蛋白酶稀释至 2 mg/mL（8 U/mL）。使用胰岛素注射器将 50 µL 稀释后的弹性蛋白酶滴加至肾下腹主动脉节段，并用棉片条包裹覆盖腹主动脉和下腔静脉。在渗透过程中，使用灭菌纱布覆盖腹腔。假手术组使用 0.9% 生理盐水替代 CaCl2 和 PPE。</li>
	<li>15 分钟后，小心移除纱布和棉片条。将肠管和结肠复位至原始位置，用肠系膜覆盖处理过的主动脉，并润湿肠管以防止粘连。</li>
	<li>使用 6-0 不可吸收聚丙烯缝线分别缝合肌肉层和皮肤。用聚维酮碘和乙醇对术区进行消毒。</li>
	<li>将小鼠置于加热垫上，监测其呼吸状态直至恢复意识。记录手术时间及实验动物数量。根据兽医建议，术后至少连续 3 天皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）作为镇痛治疗。</li>
</ol>
3. 超声检查
<ol>
	<li>术后21天，进行超声检查以评估腹主动脉瘤（AAA）的发生率。</li>
	<li>按照机构批准的方案对小鼠实施麻醉，并按前述方法去除腹部毛发。</li>
	<li>将小鼠置于小动物超声仪的加热垫上。在腹部涂抹超声耦合剂，测量动脉瘤的最大直径以及腹主动脉正常节段的直径。
	<ol>
		<li>计算肾下腹主动脉直径的增加百分比。成功建立AAA模型的标准为：AAA最大直径较肾下腹主动脉正常节段直径增加50%或以上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查结束后，用纸巾擦去残留的超声耦合剂，并将小鼠置于加热垫上直至其完全恢复。</li>
</ol>
4. 腹主动脉取材及病理学实验
<ol>
	<li>在超声检查后的第二天，采用异氟烷过量法处死小鼠（遵循机构批准的实验方案）。</li>
	<li>打开胸腔和腹腔，通过左心室灌注1×PBS，直至肺和肝脏变为白色，操作步骤参照既往文献所述方法27。</li>
	<li>使用数显游标卡尺测量肾下腹主动脉的外部直径。在体视显微镜下取肾下腹主动脉组织，并将血管置于4%多聚甲醛中固定24–48小时。</li>
	<li>清除腹主动脉周围的结缔组织和脂肪组织。将主动脉组织包埋于石蜡中制备切片，按先前描述的方法切成3–5 µm厚的切片18,28。</li>
	<li>按照试剂盒说明书，对脱蜡切片分别进行苏木精-伊红（H&amp;#38;E）、马松三色（Masson's trichrome）和弹性-范吉森（Elastic-Van Gieson, EVG）染色。
	<ol>
		<li>通过H&amp;#38;E染色分析血管结构和炎症情况，利用马松三色染色观察细胞外基质（ECM）降解及胶原纤维，通过EVG染色检查弹性纤维。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Investigating the Molecular Mechanisms Underlying Murine Abdominal Aortic Aneurysm

<ol><li>Chaikof, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Society+for+Vascular+Surgery+practices+guidelines+on+the+care+of+patients+with+an+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">The Society for Vascular Surgery practices guidelines on the care of patients with an abdominal aortic aneurysm.</a> J Vasc Surg. 67 (1), 2-77 (2018).</li>
<li>Johnston, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suggested+standards+for+reporting+on+arterial+aneurysms.+Subcommittee+on+reporting+standards+for+arterial+aneurysms%2C+ad+hoc+committee+on+reporting+standards%2C+society+for+vascular+surgery+and+north+American+chapter%2C+international+society+for+cardiovascular+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Suggested standards for reporting on arterial aneurysms. Subcommittee on reporting standards for arterial aneurysms, ad hoc committee on reporting standards, society for vascular surgery and north American chapter, international society for cardiovascular surgery.</a> J Vasc Surg. 13 (3), 452-458 (1991).</li>
<li>Bown, M. J., Sutton, A. J., Bell, P. R. F., Sayers, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meta-analysis+of+50+years+of+ruptured+abdominal+aortic+aneurysm+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">A meta-analysis of 50 years of ruptured abdominal aortic aneurysm repair.</a> Br J Surg. 89 (6), 714-730 (2002).</li>
<li>Erbel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esc+guidelines+on+the+diagnosis+and+treatment+of+aortic+diseases%3A+Document+covering+acute+and+chronic+aortic+diseases+of+the+thoracic+and+abdominal+aorta+of+the+adult.+The+task+force+for+the+diagnosis+and+treatment+of+aortic+diseases+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Esc guidelines on the diagnosis and treatment of aortic diseases: Document covering acute and chronic aortic diseases of the thoracic and abdominal aorta of the adult. The task force for the diagnosis and treatment of aortic diseases of the European Society of Cardiology (ESC).</a> Eur Heart J. 35 (41), 2873-2926 (2014).</li>
<li>Wanhainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editor%27s+choice+-+European+Society+for+Vascular+Surgery+%28ESVS%29+2019+clinical+practice+guidelines+on+the+management+of+abdominal+aorto-iliac+artery+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Vasc+Endovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Editor's choice - European Society for Vascular Surgery (ESVS) 2019 clinical practice guidelines on the management of abdominal aorto-iliac artery aneurysms.</a> Eur J Vasc Endovasc Surg. 57 (1), 8-93 (2019).</li>
<li>Veith, F. J., Ohki, T., Lipsitz, E. C., Suggs, W. D., Cynamon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+ruptured+abdominal+aneurysms+with+stent+grafts%3A+A+new+gold+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Treatment of ruptured abdominal aneurysms with stent grafts: A new gold standard.</a> Semin Vasc Surg. 16 (2), 171-175 (2003).</li>
<li>Golledge, J., Thanigaimani, S., Powell, J. T., Tsao, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+management+of+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and management of abdominal aortic aneurysm.</a> Eur Heart J. 44 (29), 2682-2697 (2023).</li>
<li>Wanhainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editor%27s+choice+--+European+Society+for+Vascular+Surgery+%28ESVS%29+2024+clinical+practice+guidelines+on+the+management+of+abdominal+aorto-iliac+artery+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Vasc+Endovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Editor's choice -- European Society for Vascular Surgery (ESVS) 2024 clinical practice guidelines on the management of abdominal aorto-iliac artery aneurysms.</a> Eur J Vasc Endovasc Surg. 67 (2), 192-331 (2024).</li>
<li>Golledge, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+an+effective+drug+therapy+for+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Lack of an effective drug therapy for abdominal aortic aneurysm.</a> J Intern Med. 288 (1), 6-22 (2020).</li>
<li>Li, R., Liu, Y., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+advances+in+drug+therapy+for+abdominal+aortic+aneurysms+over+the+past+five+years%3A+An+updated+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Research advances in drug therapy for abdominal aortic aneurysms over the past five years: An updated narrative review.</a> Int J Cardiol. 372, 93-100 (2023).</li>
<li>Lysgaard Poulsen, J., Stubbe, J., Lindholt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+used+to+explore+abdominal+aortic+aneurysms%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Vasc+Endovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Animal models used to explore abdominal aortic aneurysms: A systematic review.</a> Eur J Vasc Endovasc Surg. 52 (4), 487-499 (2016).</li>
<li>Sénémaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+relevance+and+recent+advances+of+animal+models+of+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational relevance and recent advances of animal models of abdominal aortic aneurysm.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 37 (3), 401-410 (2017).</li>
<li>Patelis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+the+research+of+abdominal+aortic+aneurysm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models in the research of abdominal aortic aneurysm development.</a> Physiol Res. 66 (6), 899-915 (2017).</li>
<li>Golledge, J., Krishna, S. M., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for abdominal aortic aneurysm.</a> Br J Pharmacol. 179 (5), 792-810 (2022).</li>
<li>Deng, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urokinase-type+plasminogen+activator+plays+a+critical+role+in+angiotensin+II-induced+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Urokinase-type plasminogen activator plays a critical role in angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm.</a> Circ Res. 92 (5), 510-517 (2003).</li>
<li>Gertz, S. D., Kurgan, A., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneurysm+of+the+rabbit+common+carotid+artery+induced+by+periarterial+application+of+calcium+chloride+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Aneurysm of the rabbit common carotid artery induced by periarterial application of calcium chloride in vivo.</a> J Clin Invest. 81 (3), 649-656 (1988).</li>
<li>Chiou, A. C., Chiu, B., Pearce, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+aortic+aneurysm+produced+by+periarterial+application+of+calcium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Murine aortic aneurysm produced by periarterial application of calcium chloride.</a> J Surg Res. 99 (2), 371-376 (2001).</li>
<li>Zhang, S., Cai, Z., Zhang, X., Ma, T., Kong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcium+phosphate-induced+mouse+abdominal+aortic+aneurysm+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A calcium phosphate-induced mouse abdominal aortic aneurysm model.</a> J Vis Exp. (189), e64173(2022).</li>
<li>Isenburg, J. C., Simionescu, D. T., Starcher, B. C., Vyavahare, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+stabilization+for+treatment+of+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Elastin stabilization for treatment of abdominal aortic aneurysms.</a> Circulation. 115 (13), 1729-1737 (2007).</li>
<li>Anidjar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase-induced+experimental+aneurysms+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Elastase-induced experimental aneurysms in rats.</a> Circulation. 82 (3), 973-981 (1990).</li>
<li>Bhamidipati, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+murine+model+of+aortic+aneurysms+using+peri-adventitial+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase.</a> Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).</li>
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<li>Origuchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneurysm+induced+by+periarterial+application+of+elastase+heals+spontaneously%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Angiol%22%5BJournal%5D)">Aneurysm induced by periarterial application of elastase heals spontaneously.</a> Int Angiol. 17 (2), 113-119 (1998).</li>
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<li>Zhu, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+new+abdominal+aortic+aneurysm+model+in+rats+by+a+retroperitoneal+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Establishment of a new abdominal aortic aneurysm model in rats by a retroperitoneal approach.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 808732(2022).</li>
<li>Bi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+rabbit+model+of+abdominal+aortic+aneurysm+via+a+combination+of+periaortic+calcium+chloride+and+elastase+incubation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a novel rabbit model of abdominal aortic aneurysm via a combination of periaortic calcium chloride and elastase incubation.</a> PLoS One. 8 (7), e68476(2013).</li>
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<li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+CaCl2-induced+aortic+inflammation+and+subsequent+aneurysm+formation+by+the+CCL3-CCR5+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Prevention of CaCl2-induced aortic inflammation and subsequent aneurysm formation by the CCL3-CCR5 axis.</a> Nat Commun. 11 (1), 5994(2020).</li>
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<li>Freestone, T., Turner, R. J., Higman, D. J., Lever, M. J., Powell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+hypercholesterolemia+and+adventitial+inflammation+on+the+development+of+aortic+aneurysm+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Influence of hypercholesterolemia and adventitial inflammation on the development of aortic aneurysm in rabbits.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17 (1), 10-17 (1997).</li>
<li>Carsten, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastase+is+not+sufficient+to+induce+experimental+abdominal+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Elastase is not sufficient to induce experimental abdominal aortic aneurysms.</a> J Vasc Surg. 33 (6), 1255-1262 (2001).</li>
<li>Yue, J., Yin, L., Shen, J., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+murine+abdominal+aortic+aneurysm+rupture+model+using+elastase+perfusion+and+angiotensin+II+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">A modified murine abdominal aortic aneurysm rupture model using elastase perfusion and angiotensin II infusion.</a> Ann Vasc Surg. 67, 474-481 (2020).</li>
<li>Ailawadi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+experimental+aortic+aneurysm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Gender differences in experimental aortic aneurysm formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (11), 2116-2122 (2004).</li>
<li>Furubayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+chymase+in+the+progression+of+abdominal+aortic+aneurysms+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertens+Res%22%5BJournal%5D)">The significance of chymase in the progression of abdominal aortic aneurysms in dogs.</a> Hypertens Res. 30 (4), 349-357 (2007).</li>
<li>Bi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+modified+rabbit+model+of+abdominal+aortic+aneurysm+induced+by+topical+application+of+porcine+elastase%3A+5-month+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Vasc+Endovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Performance of a modified rabbit model of abdominal aortic aneurysm induced by topical application of porcine elastase: 5-month follow-up study.</a> Eur J Vasc Endovasc Surg. 45 (2), 145-152 (2013).</li>
<li>Wu, X. F., Zhang, J., Paskauskas, S., Xin, S. J., Duan, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+estrogen+in+the+formation+of+experimental+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Surg%22%5BJournal%5D)">The role of estrogen in the formation of experimental abdominal aortic aneurysm.</a> Am J Surg. 197 (1), 49-54 (2009).</li>
</ol>

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

研究腹主动脉瘤（AAA）的分子机制需要稳定的动物模型。因此，自20世纪60年代Economou等人首次建立该模型以来，已开发出多种AAA动物模型29。在这些模型中，氯化钙（CaCl2）因成本低、操作简便且可重复性好，常被用于啮齿类动物。然而，研究表明，血管周围CaCl2渗透法在诱导AAA形成方面并不稳定。Bi等人和Freestone等人报道，即使将AAA形成的判定标准定义为腹主动脉正常节段直径增加20%，也只有约60%的大鼠成功形成AAA。两项研究均指出，仅对腹主动脉周围单次孵育0.5 mol/L CaCl2 20分钟，并未观察到动脉瘤的形成13,19,26,30。
此外，目前已有文献中对于CaCl2渗透的最佳浓度、作用时间及后续观察时长尚无统一共识11。因此，弹性蛋白酶诱导的腹主动脉瘤模型成为研究腹主动脉瘤时使用频率位居第二的啮齿类动物模型。然而，主动脉内灌注PPE与较高的围手术期及术后死亡率相关，最高可达40%。此外，在PPE诱导的腹主动脉瘤模型中已观察到显著的性别差异，雌性小鼠的主动脉直径增加百分比较雄性小鼠低得多11,20,25,31,32,33。
为解决这些局限性，研究人员引入了一种改良的弹性蛋白酶诱导腹主动脉瘤模型，该方法通过血管周围渗透弹性蛋白酶实现，是一种可行且侵入性更小的替代方案。然而需要注意的是，采用该方法建立的动脉瘤形成率和直径稳定性均低于腔内灌注胰蛋白酶弹性蛋白酶法11,12,21,22。因此，有研究者提出将外膜外应用 CaCl2 与弹性蛋白酶孵育相结合，在兔体内建立腹主动脉瘤模型，该方法已被证明具有操作简便、效果显著且可重复性高的优点26。
同时，另一项研究通过联合使用胰弹性蛋白酶（PPE）灌注和氯化钙（CaCl2）孵育在大鼠中建立了腹主动脉瘤（AAA）模型，结果表明PPE + CaCl2模型具有较高的存活率、较高的动脉瘤形成率以及良好的可重复性25。然而，目前尚无关于如何在小鼠中应用腹主动脉周围PPE + CaCl2浸润法建立AAA模型及其相关结果的文献报道。
本文表明，采用该方案后，腹主动脉瘤（AAA）的发生率以及主动脉直径增大的百分比保持稳定，且无围手术期死亡，超声和组织学检查证实了这一结果。此外，该方案能有效诱导出与人类腹主动脉瘤相似的形态学和病理学改变。进一步地，该方案的平均手术时间控制在1小时以内，包括15分钟的CaCl2渗透和15分钟的PPE孵育。该手术方案稳定且易于实施，所需材料易于获取。这些优势表明其在未来基础研究中具有潜在应用价值。
在PPE或CaCl2诱导的腹主动脉瘤（AAA）动物模型中，动脉瘤形成率存在差异，目前的化学诱导模型无法保证100%成功建立AAA11,12,13。尽管在PPE或CaCl2浸润后可观察到与AAA相关的病理改变，如慢性炎症、内膜/中膜增厚、弹性纤维断裂、钙化以及管腔内血栓形成，但由于化学刺激作用时间有限，且刺激停止后无持续效应，主动脉扩张或动脉瘤的形成可能倾向于自发愈合12,23。此外，建立AAA的手术操作难以完全标准化，可能导致腹主动脉暴露范围存在差异，从而影响动脉瘤的形成。然而，即使在建模未成功的个体小鼠中，腹主动脉直径仍表现出显著的44%扩张，表明该方法虽未必始终符合腹主动脉瘤的诊断标准，但仍可在腹主动脉中诱导出明显的扩张。 
尤为重要的是，本方案涉及多个关键步骤。首先，在建立小鼠腹主动脉瘤（AAA）模型过程中，充分暴露肾下腹主动脉至关重要。最大限度地分离腹主动脉周围的结缔组织和脂肪组织，有助于氯化钙（CaCl2）和弹性蛋白酶更好地渗透至肾下腹主动脉的中膜层，从而提高动脉瘤的形成率22。此外，在CaCl2渗透后，可能更易于分离结缔组织和脂肪组织。因此，若初始周围组织解剖效果不理想，建议在CaCl2渗透后继续分离腹主动脉邻近的结缔组织。然而，暴露腹主动脉存在损伤腰动脉和腰静脉的固有风险，可能导致术中或术后严重出血甚至致命后果。因此，在清除腹主动脉周围结缔组织和脂肪组织时必须格外谨慎。本方案中的另一个重要步骤是将腹主动脉与下腔静脉（IVC）分离。既往研究和实验结果一致表明，是否将下腔静脉从腹主动脉上解剖分离，对动脉瘤的形成并无影响，因此在本操作中无需进行此步骤18,22。
本研究存在若干局限性。首先，缺乏关于不同时期腹主动脉瘤发生率及腹主动脉病理变化的基线数据。此外，未评估参与腹主动脉瘤（AAA）发展的重要生物标志物水平，例如MMP2、MMP9、TIMP1和SMA。其次，该方法此前尚未在小鼠中应用，且缺乏与其他常用模型（尤其是单独使用PPE或CaCl2的方法）的横断面比较，以评估动脉瘤形成及病理特征。第三，该方法诱导的腹主动脉瘤缺乏人类腹主动脉瘤的若干特征，包括动脉粥样硬化和壁内血栓形成。此外，本方法所使用的CaCl2和弹性蛋白酶浓度以及浸润时间，与以往研究中采用的参数略有差异。作者计划在今后的研究中通过实验手段解决这些问题。
该方案的另一个局限性在于其在较大动物模型（如猪或犬）中的适用性。目前，单独使用弹性蛋白酶、胶原酶或CaCl2等化学试剂尚未证明能够在非啮齿类动物（兔除外）中诱导腹主动脉扩张达50%。只有化学试剂联合血管成形术或其他外科手术的方法，在犬和猪中显示出诱导动脉瘤形成的潜力11,34。既往研究还表明，在弹性蛋白酶诱导的兔腹主动脉瘤模型中，经过5个月的随访观察，动脉瘤出现了再生迹象35。尽管Bi等人已利用该方案在兔中成功诱导出腹主动脉瘤，但仍需进一步研究以验证其在猪或犬中的有效性及长期结局26。
最后一个局限性在于仅使用了雄性小鼠，因为使用弹性蛋白酶在雌性小鼠中诱导腹主动脉瘤（AAA）与较低的动脉瘤形成率和主动脉扩张百分比相关11,13,33,36。然而，Xue 等人的研究表明，仅通过血管周围应用弹性蛋白酶即可在雌性小鼠中实现90%的AAA发生率。这表明本方案在雌性小鼠中也可能有效22，尽管仍需进一步研究以确认其有效性。还需要注意的是，血管结构和弹性纤维的损伤仅发生在被CaCl2和弹性蛋白酶浸润的一侧，而由于与下腔静脉（IVC）位置邻近，其对侧未出现病理改变。然而，如前所述，这些因素并不影响AAA的发生率或在AAA发展过程中腹主动脉尺寸增加的百分比。
综上所述，本论文介绍了一种新型、安全、稳定且可重复的小鼠腹主动脉瘤（AAA）模型，该模型具有较高的AAA发生率、显著的腹主动脉扩张以及类似于人类AAA所观察到的病理生理学改变。尽管存在一定的局限性，这一小鼠AAA模型在探究AAA分子机制以及开发针对该疾病患者的有效治疗策略方面具有重要潜力。

腹主动脉瘤（AAA）是指腹主动脉直径增加超过50%，或最大主动脉直径超过3 cm。该疾病具有重大生命威胁，一旦动脉瘤破裂，死亡率约为90%1,2,3。目前，开放性手术修复和腔内主动脉修复术（EVAR）是AAA患者仅有的可用干预手段4,5,6。然而，尚无充分证据支持药物治疗在抑制动脉瘤形成或延缓无手术指征患者腹主动脉扩张速度方面的有效性7。尽管如此，一些非特异性治疗措施，包括持续监测动脉瘤最大直径、控制血压、抗血小板治疗以及他汀类药物的使用，仍被用于尽可能降低动脉瘤突然破裂及潜在心血管和神经系统事件的风险。然而，抗血小板药物和他汀类药物在预防动脉瘤破裂中的作用仍存在争议，需要进一步研究加以明确5,7,8,9,10。
稳定的腹主动脉瘤（AAA）动物模型对于研究AAA的发病机制至关重要，目前已提出多种方法用于建立此类模型11,12,13。目前，氯化钙（CaCl2）、弹性蛋白酶、血管紧张素II（Ang II）、异种移植以及转基因模型已被用于建立啮齿类动物AAA模型11,12,13。其中，Ang II最常用于小鼠模型，而CaCl2和弹性蛋白酶也广泛应用于小鼠和大鼠11,12,13,14。Ang II诱导的AAA模型是唯一能够诱导出接近人类AAA病理特征的动脉粥样硬化病变的动物模型，该模型操作简便、可重复性强，且无需开腹手术11,12,13。然而，与CaCl2或弹性蛋白酶诱导的模型相比，Ang II诱导的动脉瘤位置不确定，常出现在降主动脉或肾上腹主动脉，且破裂风险较高11,12,13,14。在基因缺陷型小鼠中，Ang II诱导的AAA模型动脉瘤发生率可高达100%，而在C57BL/6小鼠中仅有39%发生动脉瘤，且获得基因缺陷型小鼠的时间和经济成本较高13,15。
最初由 Gertz 等人提出，采用 CaCl2 诱导颈动脉动脉瘤形成，随后由 Chiou 等人改良，建立了小鼠腹主动脉瘤（AAA）模型16,17。然而，尽管 CaCl2 能够诱导弹性纤维断裂、血管炎症及细胞外基质降解，但缺乏人类 AAA 的多个特征，包括动脉粥样硬化性血栓形成、管腔内血栓（ILT）以及动脉瘤破裂12,18。此外，腹主动脉周围应用 CaCl2 的成瘤率和直径增加百分比仍不稳定13,19。1990 年，Anidjar 等人首次建立了通过管腔内灌注猪胰弹性蛋白酶（PPE）诱导 AAA 的模型，随后 Bhamidipati 等人报道了在小鼠模型中采用外膜周围 PPE 渗透的方法20,21。目前，大多数弹性蛋白酶诱导的 AAA 动物模型均采用 Bhamidipati 的方案，因其具有可行性且创伤较小。然而需要注意的是，该方法诱导的 AAA 发生率和最大直径通常较低，且低于主动脉内灌注 PPE 的效果。此外，通过腹主动脉周围应用弹性蛋白酶诱导的动脉瘤具有自发愈合的倾向11,12,20,21,22,23。
为解决这些局限性，Tanaka 等人提出了一种联合方法，涉及管腔内 PPE 灌注与 CaCl₂2 通过浸润法建立大鼠AAA模型，获得了满意的结果24此外，Zhu 等人证明了 PPE + CaCl2 与单用PPE组和PPE联合BAPN组相比，该模型具有更高的存活率和更高的动脉瘤形成率25该联合方法还表现出良好的稳定性和可重复性。此外，Bi 等人成功建立了兔腹主动脉瘤模型。 通过 腹主动脉周围 CaCl₂ 联合应用2 以及弹性蛋白酶孵育。第5天的平均扩张比为65.3% ± 8.9%，第15天进一步增加至86.5% ± 28.7%，第30天显著上升至203.6% ± 39.1%26然而，目前尚无文献报道通过联合使用腹主动脉周围 CaCl₂ 应用与 Ang II 输注在啮齿类动物中诱导腹主动脉瘤（AAA）的方法。2 以及弹性蛋白酶的应用。
本论文介绍了一种通过联合使用外膜周围氯化钙（CaCl2）和弹性蛋白酶浸润建立小鼠腹主动脉瘤（AAA）模型的标准方案。后续部分提供了详细的手术操作步骤，并展示了小鼠AAA模型的代表性结果。

<table><tbody><tr><td>麻醉机</td><td>RWD</td><td>R550</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>江苏恒瑞医药股份有限公司</td><td>220608BP</td><td>1ml: 1mg</td></tr><tr><td>C57BL/6JGpt 雄性小鼠</td><td>集萃药康</td><td>N000013</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td>100 g</td></tr><tr><td>卡洛芬</td><td>MCE</td><td>HY-B1227</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>普通饲料</td><td>多斯实验动物有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数显游标卡尺</td><td>Greener</td><td>IP54</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>津和药业有限公司</td><td>539682</td><td>75%/500 mL</td></tr><tr><td>EVG 染色试剂盒</td><td>Solarbio</td><td>G1597</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Ver 9.0.0</td></tr><tr><td>H&amp;E 染色试剂盒</td><td>Servicebio</td><td>G1076</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>2143420</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>RWD</td><td>R510-22-4</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Masson 染色试剂盒</td><td>Servicebio</td><td>G1006</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Servicebio</td><td>G4702</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Biosharp</td><td>BL539A</td><td>4%/500 mL</td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>猪胰弹性蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1250</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>永安制药有限公司</td><td></td><td>5%/100 mg</td></tr><tr><td>普理灵聚丙烯缝线</td><td>Ethicon LLC</td><td>8709H</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物超声成像系统</td><td>Fujifilm</td><td>Vevo 3100LT</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>超声耦合剂</td><td>Keppler</td><td>KL-250</td><td>250 g</td></tr></tbody></table>

通过腹膜外氯化钙与弹性蛋白酶渗透建立的小鼠腹主动脉瘤模型

A Mouse Abdominal Aortic Aneurysm Model by Periadventitial Calcium Chloride and Elastase Infiltration

腹主动脉瘤（AAA）是一种与高死亡率相关的危及生命的疾病，其特征是腹主动脉永久性扩张，动脉直径至少增加50%。目前已建立多种AAA动物模型，以模拟其病理生理变化并研究其潜在机制。在这些模型中，氯化钙（CaCl2）诱导和弹性蛋白酶诱导的AAA模型在小鼠中被广泛使用。然而，这些方法存在一定的局限性：传统的管腔内猪胰弹性蛋白酶（PPE）灌注技术难度高，且破裂率较高；而外膜周围给予PPE则结果不稳定。此外，CaCl2诱导的AAA模型缺乏人类AAA的关键特征，如动脉粥样硬化性血栓形成和动脉瘤破裂。因此，联合使用CaCl2和PPE被认为是一种可提高建模成功率并促进动脉瘤直径显著增大的策略。本文提供了一种通过在腹主动脉肾下段周围主动脉浸润PPE和CaCl2建立小鼠AAA模型的完整实验方案。采用该方案，可实现约90%的AAA形成率，且操作简便、可重复性强。进一步的超声成像和组织学实验表明，该模型能够有效模拟人类AAA的形态学和病理学改变。

本研究共纳入24只小鼠，并随机分组：假手术组12只，PPE + CaCl2组12只。所有数据均以均值 ± 标准差表示，除非另有说明。平均手术时间为55.67 min ± 4.08 min。术中无死亡或动脉瘤破裂发生，术后21天内存活率为100%。未观察到严重肠粘连或与腹主动脉解剖相关的并发症。
在PPE + CaCl2组中，12只小鼠中有11只（91.67%）在术后21天发生腹主动脉瘤（AAA），而假手术组未观察到动脉瘤形成。PPE + CaCl2组的肾下腹主动脉平均最大内径为1.29 mm ± 0.18 mm，而假手术组为0.50 mm ± 0.04 mm。PPE + CaCl2组肾下腹主动脉内径的平均增长百分比为99.50% ± 25.42%。PPE + CaCl2组的肾下腹主动脉平均最大外径为1.49 mm ± 0.19 mm，而假手术组为0.61 mm ± 0.04 mm。
假手术组和PPE + CaCl2组腹主动脉在体视显微镜和超声下的代表性图像如图1A、B所示。图1C、D展示了PPE + CaCl2组与假手术组肾下腹主动脉平均最大内径和外径的统计分析结果。进一步的组织学检查显示，H&amp;E染色表明PPE + CaCl2组主动脉壁增厚并伴有炎性细胞浸润，Masson三色染色显示主动脉壁细胞外基质降解及胶原纤维沉积。EVG染色显示弹性纤维断裂（图1E）。
<img alt="显示超声图像、组织切片和直径比较图表的主动脉瘤分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66674/66674fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：通过外膜周围CaCl2和弹性蛋白酶渗透建立的小鼠AAA模型的结果。（A）在体视显微镜下观察的正常腹主动脉和AAA的代表性图像。（B）假手术组（Sham）与PPE + CaCl2组腹主动脉的横断面和纵向超声图像。（C）假手术组与PPE + CaCl2组肾下腹主动脉最大内径的统计分析，****p &lt; 0.0001。（D）假手术组与PPE + CaCl2组肾下腹主动脉外径的比较，****p &lt; 0.0001。（E）腹主动脉的H&amp;E、Masson和EVG染色图像。比例尺：50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66674/66674fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本论文介绍了一种利用氯化钙和弹性蛋白酶建立小鼠腹主动脉瘤模型的实验方案，该方法结合了既往建模技术的优点。此模型可用于研究腹主动脉瘤发生的病理生理机制。

腹主动脉瘤（AAA）是一种与高死亡率相关的危及生命的疾病，其特征是腹主动脉的永久性扩张……

本研究介绍了一种利用氯化钙和弹性蛋白酶建立小鼠腹主动脉瘤模型的实验方案，可用于探讨腹主动脉瘤的病理生理机制。本方案结合了外膜周围应用PPE与氯化钙渗透法的优点，是一种安全、稳定且可重复的小鼠腹主动脉瘤模型，具有较高的腹主动脉瘤发生率，能够显著扩张腹主动脉，并产生类似于人类腹主动脉瘤的病理生理变化。未来，我们的研究团队将致力于与腹主动脉瘤及外周动脉疾病相关的临床与基础研究，特别关注这些疾病的发病机制以及治疗策略的开发。首先，将麻醉后的小鼠仰卧置于加热垫上。剃毛并消毒后，将小鼠置于体视显微镜下。使用剪刀沿腹部正中线做一条长约2至2.5厘米的纵向切口。采用经腹入路，通过腹白线进入腹腔。放置牵开器以暴露腹腔。使用生理盐水浸湿的纱布将肠管和结肠推入腹腔右侧。用镊子和棉签钝性分离肾下腹主动脉和下腔静脉周围的结缔组织和脂肪组织。轻柔地解剖腹主动脉，暴露腹主动脉与上方腰大肌之间的间隙。将灭菌的棉条插入该间隙，注意不要损伤腰动脉或静脉。将浸有0.9摩尔氯化钙的棉球置于腹主动脉的外膜上。15分钟后，移除棉球。用双蒸水将弹性蛋白酶稀释至2毫克/毫升。使用胰岛素注射器，向腹主动脉的肾下段注入50微升稀释后的弹性蛋白酶。用棉垫条包裹腹主动脉和下腔静脉。在渗透过程中，用无菌纱布覆盖腹腔。15分钟后，小心移除纱布和棉垫条，将肠道和结肠复位至原始位置。用肠系膜覆盖处理过的主动脉，并用0.9%生理盐水湿润肠道以防止粘连。使用6/O不可吸收聚丙烯缝线缝合肌肉层和皮肤。将小鼠置于啮齿类动物超声仪的加热垫上。在腹部涂抹超声耦合剂，测量动脉瘤的最大直径以及腹主动脉正常节段的直径。在 Excel 表格中计算肾下腹主动脉增大的百分比。检查结束后，用纸巾擦去残留的超声耦合剂，并将小鼠置于加热垫上直至完全恢复。在PPE联合氯化钙组中，91.67%的小鼠于术后21天发生腹主动脉瘤，而假手术组未观察到动脉瘤形成。与假手术组相比，PPE联合氯化钙组小鼠肾下腹主动脉的平均最大内径显著增大。与假手术组相比，PPE联合氯化钙组小鼠肾下腹主动脉的平均最大外径也显著增大。组织学检查显示，与假手术组相比，PPE联合氯化钙组主动脉壁增厚、炎性细胞浸润、细胞外基质降解、胶原纤维沉积以及弹性纤维断裂。

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