Drosophila 转基因的胚胎显微注射

果蝇中的转基因技术对于在个体水平上研究基因功能至关重要。胚胎显微注射是构建转基因果蝇的关键步骤。本文以phiC31整合酶介导的果蝇转基因为例，详细介绍果蝇胚胎显微注射进行转基因的实验方案。

使用研磨器将注射针尖磨成斜面，以减少对胚胎的损伤或降低细胞质的大量泄漏。然而，在研磨过程中，研磨液可能进入针尖内部，且针尖内的研磨液无法自然快速干燥。本方案采用带有压力表的脚踏气泵，在研磨针尖时向针内施加气压。

这可以防止研磨液产生虹吸，从而避免研磨液进入斜面针尖，使内置针头能够用于该方法。首先，用研磨液润湿一块布。将布固定在针头研磨器上，然后使用硅胶毛细管将针头连接至脚踏气泵。

将针头安装到研磨器的针 holder 上。调整针头的角度，使其相对于研磨板弯曲 35 度。使用显微镜下方的粗调旋钮调节针尖位置，直至其位于研磨表面正上方。

接下来，使用脚踏气泵将针头内部压力维持在每平方英寸40磅，然后使用微调旋钮使针头尖端接触研磨板。研磨三到五秒后，当气泡开始从尖端逸出时，卸下针头。接着，用酒精灯的外焰加热200微升移液器。

当移液器吸头开始熔化时，将其拉伸。用剪刀剪掉移液器吸头的封口端。为了去除果蝇胚胎的氯，用毛刷将果蝇从葡萄汁琼脂平板上移除。

用双蒸水在细胞筛中冲洗收集的胚胎。用纸巾将细胞筛擦干，然后将干燥的细胞筛放入含有30%次氯酸钠的培养皿中。手动搅拌细胞筛以确保充分混匀。

用双蒸水冲洗胚胎两分钟，然后用画笔挑出漂浮的胚胎，排列成行，以进行后续的转基因操作。首先，用画笔将去氯的黑腹果蝇胚胎转移至一条长条形的葡萄糖琼脂上。使用解剖针将约60个胚胎沿琼脂条边缘排成一行，使它们的后端朝外。

现在将一段18毫米长的双面胶带沿盖玻片边缘纵向放置。去除背衬后，轻轻将盖玻片压在已对齐的胚胎上。将带有胚胎的盖玻片转移至含有干燥剂的盒子中。

在胚胎上添加卤代烃油。进行显微注射时，首先使用拉长的移液器将两微升 DNA 加入注射针中。将排列好的胚胎连同卤代烃油一起置于倒置显微镜下。

接下来，使用显微操作仪将针头插入胚胎的后端。通过脚踏控制器，小心地将DNA注入胚胎中。完成第一个胚胎的显微注射后，移出针头，然后将其移至下一个胚胎的后端继续操作。

将注射后的胚胎转移至琼脂平板中进行培养。当卵孵化后，准备一个装有食物的小瓶，并向其中加入几滴蒸馏水。

使用体视显微镜和毛笔收集孵化的幼虫，然后将其转移至小瓶中。将小瓶置于25°C、50%至60%湿度条件下培养10天。过度干燥的胚胎会呈现畸形，无法用于显微注射。

干燥不足的胚胎在穿刺时会渗出大量细胞质，从而降低存活率。适当干燥的胚胎在显微注射时即使有渗出也仅少量。用于胚胎显微注射的表达phiC31整合酶的黑腹果蝇品系具有白眼表型。

该基因型的老龄果蝇由于在眼部特异性表达的红色荧光蛋白积累，呈现出粉红色眼睛。成功培育出在ATTP2整合位点携带转基因且具有橙色眼睛的转基因果蝇。