Name: 脓毒症诱导的小鼠废用肌病的临床前模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T13:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 1 s
Description: 了解脓毒症诱导肌病机制的小鼠临床前模型，结合盲肠结扎穿刺与后肢悬吊技术。该模型模拟脓毒症患者卧床导致的肌肉废用，为研究肌肉功能障碍及评估治疗策略提供可重复平台。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R21 AG072011 项目资助，项目负责人：OL。

本研究的实验方案已经佛罗里达大学动物护理与使用委员会（IACUC）审查并批准（编号：#202200000227）。实验选用17周龄雄性C57BL/6J小鼠，体重范围为27 g至34 g。本方案中所述实验操作流程和时间线如图1所示。如图所示，整个实验周期共计11天。动物于第0天接受存活手术（CLP/假手术），随后进行为期4天的液体支持和镇痛治疗。第4天开始实施后肢悬吊（HLS），持续7天。终末实验于第11天进行。所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。
1. 盲肠结扎穿刺术（CLP）
<ol>
	<li>从商业来源获得动物后，应在进行CLP（或假手术）手术前，让其在动物设施中适应至少1周。这有助于最大限度减少与运输相关的应激。</li>
	<li>按照当地IACUC指南将小鼠进行群养。 
	注意：一般情况下，每笼最多饲养5只小鼠，直至手术当天。使用标准鼠笼，尺寸为宽7.25英寸、长11.75英寸、高5英寸，垫料为玉米芯 bedding。维持12小时光照与12小时黑暗循环，光照时间为早上7点至晚上7点。饲养环境温度保持在20–22 °C，相对湿度（RH）维持在30%–60%之间。 随意摄取 确保可自由获取标准饲料和水。</li>
	<li>为进行CLP操作，将动物置于诱导室中，使用异氟烷（2.5%，500 mL/min）进行麻醉。用镊子夹捏足掌以确认麻醉深度。当夹捏足掌后无反射性回缩，表明已达到深麻醉状态，此时将动物转移至鼻罩装置以维持麻醉（2.5%，100–125 mL/min）。 
	注意：整个操作过程应采用无菌技术。</li>
	<li>手术期间，涂抹兽用眼用润滑软膏，以保护动物眼睛免受鼻罩可能造成的损伤。</li>
	<li>使用市售脱毛剂清洁手术部位。仅去除下腹部的毛发，避免皮肤过度暴露。 
	注意：也可使用动物毛发剪刀，但需小心操作以避免损伤皮肤。</li>
	<li>手术部位暴露后，用聚维酮碘（或等效的杀菌消毒剂）擦拭三次，每次擦拭后用70%酒精冲洗。</li>
	<li>根据当地IACUC批准的镇痛治疗方案，给予一次剂量为3.25 mg/kg的缓释丁丙诺啡或等效药物。</li>
	<li>将小鼠转移至手术区域。使用粘性手术巾隔离手术部位。在深度麻醉下，用手术刀片沿腹侧正中线做皮肤切口（约2 cm）。
	<ol>
		<li>使用剪刀将皮肤与肌层分离。用手术刀片在肌层上做一个较小的切口（约1 cm）。观察到肠管后，用钝头镊子找到盲肠并将其外置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外翻后，使用无菌5-0聚乳酸羟基乙酸可吸收缝线结扎盲肠。注意结扎部位与盲肠远端之间的距离，该距离将影响感染的严重程度。为重现本文所述结果，应在盲肠远端1 cm处进行结扎。 
	注意：结扎较大的盲肠区域将导致病情加重10.</li>
	<li>使用27 G针头贯穿盲肠进行穿孔，使粪便内容物渗漏。小心地轻轻挤压盲肠，以使粪便内容物外露。进行假手术时，采用相同步骤暴露动物的盲肠，但不结扎也不穿刺盲肠。 
	注意：针头规格直接影响感染的严重程度。为建立低级别感染，建议使用26 G至28 G的针头。请注意，使用较粗的针头规格将导致死亡率升高，动物可能无法耐受后续实验方案中的后肢悬吊阶段。</li>
	<li>将盲肠复位至腹腔内。使用无菌5-0可吸收缝线缝合肌层。使用5-0尼龙不可吸收缝线缝合皮肤。皮肤缝合完成后，给予无菌生理盐水（1&#160;mL&#160;对于雄性为0.5&#160;mL&#160;对于女性 通过 动物背部皮下注射。 
	注意：关闭肌肉层建议采用连续缝合技术，而皮肤层建议采用间断缝合技术。进行存活手术缝合时，请参考并遵守当地实验动物照护与使用委员会（IACUC）的指导原则。</li>
	<li>手术后，将动物单独饲养在清洁的笼具中，并置于设定为 35 °C 的加热垫或加热床垫上。麻醉苏醒后的最初 1 小时内，每 15 分钟观察小鼠一次，之后可将其送回饲养设施。 
	注意：在笼底提供少量饲料，以允许动物存活 随意摄取 食物，同时避免影响手术部位。返回设施后，动物需按照败血症动物评估程序（步骤3）每天检查两次。</li>
	<li>在接下来的四天内提供无菌生理盐水和镇痛支持，以促进手术切口愈合。 
	注意：每日监测剑突表面温度和体重有助于准确记录脓毒症严重程度11.</li>
</ol>
2. 后肢悬吊（HLS）
<ol>
	<li>进行尾部悬吊实验（HLS）时，研究人员必须遵循当地IACUC伦理指南。这包括确保使用适当尺寸的笼具和笼底，这对于在HLS条件下满足动物的运动、进食和饮水习惯至关重要。 
	注意：建议在CLP术后恢复4天，以促进伤口愈合。</li>
	<li>在CLP或假手术后恢复4天后，使用低流量异氟烷（2.5%，100–125 mL/min）对动物进行麻醉。用泡沫胶带将小鼠尾巴固定在一段短金属链上。放置金属链时应使其与尾巴平行，同时用泡沫胶带牢固包裹尾巴和金属链，确保固定稳妥。</li>
	<li>为确保后肢有效悬吊，将金属链连接至笼具中央横杆上的挂钩。此外，在横杆上安装第二个可滑动的小横杆，以增加动物活动的自由度。 
	注意：动物必须能够通过前肢在笼底金属网格上自由移动。</li>
	<li>调整悬吊后肢的高度，防止足垫接触饲料颗粒。在悬吊期间，每天至少两次用手持浸水棉签清洁缝合皮肤周围的剃毛区域。 
	注意：清洁至关重要，可预防手术部位感染，尤其是因体位抬高导致尿液灼伤而引发的感染。</li>
	<li>为确保实验结果可重复，动物应接受为期7天的后肢悬吊。该时长依据既往时间进程研究确定，表明在非败血症条件下，后肢悬吊至少需要此时间才能对骨骼肌产生显著影响12,13。 
	注意：动物的存活率、不适或痛苦程度将随感染严重程度的增加而上升。</li>
</ol>
3. 脓毒症动物评估
注意：评估动物的临床状况是跟踪盲肠结扎穿刺（CLP）/假手术后严重程度的关键环节。此外，根据机构动物照护与使用委员会（IACUC）的要求，必须设定人道终点以保障动物福利。为解决这些问题并为日常动物护理提供标准，本研究采用改良小鼠脓毒症评分（Modified Murine Sepsis Score, MMSS）进行动物评估的操作指南14。
<ol>
	<li>使用MMSS（补充文件1）对动物进行评估。注意，每个类别的评分为0表示动物健康。根据感染严重程度，每天对动物评分两次，评分范围为0至3。</li>
	<li>为提高准确性，每天测量剑突表面温度和体重两次11,15，并连同MMSS评分表一并记录。 
	注：典型的剑突表面温度和体重波动数据见于补充图1。</li>
	<li>请参考当地IACUC关于人道终点的指导。 
	注：为重现实验结果，以下列标准作为实验终点：（1）体重下降超过基线值的&#62;40%；（2）体温&#60;30 °C，或较前次测量值下降&#62;5 °C；（3）在“对刺激的反应”、“意识水平”或“呼吸质量”中任一项得分为3分；（4）每日总MSSS评分≥17分。此处描述的评估方法适用于术后动物及正常活动的动物。建议避免接触处于后肢悬吊（HLS）状态的动物，以防其后肢与任何表面接触。完成最终评估后，应按照当地动物伦理委员会的建议实施安乐死。</li>
</ol>

Mouse Model for Studying Sepsis-Induced Myopathy with Hindlimb Suspension

<ol><li>Prescott, H. C., Angus, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+recovery+from+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Enhancing recovery from sepsis.</a> JAMA. 319 (1), 62-75 (2018).</li>
<li>Stortz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+clinical+outcomes+and+the+immunocatabolic+phenotype+of+chronic+critical+illness+after+sepsis+in+surgical+intensive+care+unit+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Benchmarking clinical outcomes and the immunocatabolic phenotype of chronic critical illness after sepsis in surgical intensive care unit patients.</a> J Trauma Acute Care Surg. 84 (2), 342-349 (2018).</li>
<li>Laitano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+hindlimb+disuse+on+sepsis-induced+myopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Rep%22%5BJournal%5D)">The impact of hindlimb disuse on sepsis-induced myopathy in mice.</a> Physiological Rep. 9 (14), e14979(2021).</li>
<li>Callahan, L. A., Supinski, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis-induced+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Sepsis-induced myopathy.</a> Crit Care Med. 37, 10 Suppl S354-S367 (2009).</li>
<li>Cuthbertson, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+and+quality+of+life+in+the+five+years+after+severe+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care%22%5BJournal%5D)">Mortality and quality of life in the five years after severe sepsis.</a> Crit Care. 17 (2), R70(2013).</li>
<li>Schmitt, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells+contribute+to+long-term+tissue+repletion+following+surgical+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cachexia+Sarcopenia+Muscle%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells contribute to long-term tissue repletion following surgical sepsis.</a> J Cachexia Sarcopenia Muscle. 14 (3), 1424-1440 (2023).</li>
<li>Owen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+muscle+weakness+and+mitochondrial+dysfunction+in+the+absence+of+sustained+atrophy+in+a+preclinical+sepsis+model%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Chronic muscle weakness and mitochondrial dysfunction in the absence of sustained atrophy in a preclinical sepsis model.</a> eLife. 8, e49920(2019).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+implicated+in+sepsis-induced+muscle+weakness+and+ameliorated+with+metformin%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence implicated in sepsis-induced muscle weakness and ameliorated with metformin.</a> Shock. 59 (4), 646(2023).</li>
<li>Granger, J. I., Ratti, P. L., Datta, S. C., Raymond, R. M., Opp, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis-induced+morbidity+in+mice%3A+effects+on+body+temperature%2C+body+weight%2C+cage+activity%2C+social+behavior+and+cytokines+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Sepsis-induced morbidity in mice: effects on body temperature, body weight, cage activity, social behavior and cytokines in brain.</a> Psychoneuroendocrinology. 38 (7), 1047-1057 (2013).</li>
<li>Ruiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+modeling+in+mice%3A+ligation+length+is+a+major+severity+factor+in+cecal+ligation+and+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med+Exp%22%5BJournal%5D)">Sepsis modeling in mice: ligation length is a major severity factor in cecal ligation and puncture.</a> Intensive Care Med Exp. 4 (1), 22(2016).</li>
<li>Laitano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xiphoid+surface+temperature+predicts+mortality+in+a+murine+model+of+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Shock+%28Augusta%2C+Ga%29%22%5BJournal%5D)">Xiphoid surface temperature predicts mortality in a murine model of septic shock.</a> Shock (Augusta, Ga). 50 (2), 226-232 (2018).</li>
<li>Park, S., Brisson, B. K., Liu, M., Spinazzola, J. M., Barton, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+IGF-I+excels+in+promoting+functional+muscle+recovery+from+disuse+atrophy+compared+with+pro-IGF-IA%5BTitle%5D)+AND+%22J+App+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature IGF-I excels in promoting functional muscle recovery from disuse atrophy compared with pro-IGF-IA.</a> J App Physiol. 116 (7), 797-806 (2013).</li>
<li>Spradlin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+muscle+Igf1+exacerbates+disuse+atrophy+weakness+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+App+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deletion of muscle Igf1 exacerbates disuse atrophy weakness in mice.</a> J App Physiol. 131 (3), Bethesda, Md. 881-894 (2021).</li>
<li>Shrum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+scoring+system+to+evaluate+sepsis+severity+in+an+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A robust scoring system to evaluate sepsis severity in an animal model.</a> BMC Res Notes. 7 (1), 233(2014).</li>
<li>Mai, S. H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+temperature+and+mouse+scoring+systems+as+surrogate+markers+of+death+in+cecal+ligation+and+puncture+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med+Exp%22%5BJournal%5D)">Body temperature and mouse scoring systems as surrogate markers of death in cecal ligation and puncture sepsis.</a> Intensive Care Med Exp. 6 (1), 20(2018).</li>
<li>Vankrunkelsven, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+muscle+weakness+in+a+mouse+model+of+critical+illness%3A+does+fibroblast+growth+factor+21+play+a+role%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Development of muscle weakness in a mouse model of critical illness: does fibroblast growth factor 21 play a role.</a> Skelet Muscle. 13 (1), 12(2023).</li>
<li>Supinski, G., Stofan, D., Nethery, D., Szweda, L., DiMarco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apocynin+improves+diaphragmatic+function+after+endotoxin+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Apocynin improves diaphragmatic function after endotoxin administration.</a> J Appl Physiol. 87 (2), Bethesda, Md. 776-782 (1999).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+leads+to+impaired+mitochondrial+calcium+uptake+and+skeletal+muscle+weakness+by+reducing+the+micu1%3Amcu+protein+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Shock+%28Augusta%2C+Ga%29%22%5BJournal%5D)">Sepsis leads to impaired mitochondrial calcium uptake and skeletal muscle weakness by reducing the micu1:mcu protein ratio.</a> Shock (Augusta, Ga). 60 (5), 698-706 (2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+NAT10+protects+against+sepsis-induced+skeletal+muscle+atrophy+by+inhibiting+ROS%2FNLRP3%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting NAT10 protects against sepsis-induced skeletal muscle atrophy by inhibiting ROS/NLRP3.</a> Life Sci. 330, 121948(2023).</li>
<li>Mankowski, R. T., Laitano, O., Clanton, T. L., Brakenridge, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+and+treatment+strategies+of+acute+myopathy+and+muscle+wasting+after+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinical+Med%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology and treatment strategies of acute myopathy and muscle wasting after sepsis.</a> J Clinical Med. 10 (9), 1874(2021).</li>
<li>Oliveira, J. R. S., Mohamed, J. S., Myers, M., Brooks, M. J., Alway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hindlimb+suspension+and+reloading+on+gastrocnemius+and+soleus+muscle+mass+and+function+in+geriatric+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Effects of hindlimb suspension and reloading on gastrocnemius and soleus muscle mass and function in geriatric mice.</a> Exp Gerontol. 115, 19-31 (2019).</li>
<li>Ashare, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-1+improves+survival+in+sepsis+via+enhanced+hepatic+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-1 improves survival in sepsis via enhanced hepatic bacterial clearance.</a> Am J Respir Crit Care Med. 178 (2), 149-157 (2008).</li>
<li>Starr, M. E., Saito, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+increase+in+food+spilling+by+laboratory+mice+may+lead+to+significant+overestimation+of+actual+food+consumption%3A+implications+for+studies+on+dietary+restriction%2C+metabolism%2C+and+dose+calculations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related increase in food spilling by laboratory mice may lead to significant overestimation of actual food consumption: implications for studies on dietary restriction, metabolism, and dose calculations.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1043-1048 (2012).</li>
<li>Crowell, K. T., Soybel, D. I., Lang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restorative+mechanisms+regulating+protein+balance+in+skeletal+muscle+during+recovery+from+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Restorative mechanisms regulating protein balance in skeletal muscle during recovery from sepsis.</a> Shock. 47 (4), 463-473 (2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案为建立一种新的脓毒症诱导肌病的临床前模型提供了详细的技术指南。文中详尽描述了所有材料和关键步骤，以便重现该模型。该方法能够再现脓毒症患者中观察到的骨骼肌功能障碍，并突出了失用在加重肌病过程中的关键作用。迄今为止，大多数针对脓毒症诱导肌病的临床前研究并未将失用作为其病理生理过程中的主动组成部分7,8,16,17。尽管本方案主要详细阐述了比目鱼肌的研究结果，但完全可行将离体（ex vivo）评估扩展至其他类型的肌肉，例如趾长伸肌（EDL），并可在多种肌肉群中开展原位（in situ）功能评估。
脓毒症诱导的肌病患者因从脓毒症损伤中恢复而长期卧床不起1。总体而言，75%的幸存者会发展为肌病，常因跌倒或与肌肉无力相关的问题而再次入住重症监护室（ICU）1,3。本研究通过提供一种研究脓毒症诱导肌病的替代工具，旨在解决这一重要空白。
该模型可用于研究脓毒症诱导肌病的发病机制以及缓解症状的新策略。脓毒症诱导肌病的潜在机制包括髓系细胞浸润3、线粒体功能障碍18、活性氧过度产生19以及肌肉再生能力受损6。未来的研究所必须将失用作为肌病的主动组成部分纳入这些通路的分析中，因为失用会加剧脓毒症患者的肌肉萎缩和肌力下降3,20。此外，该模型还允许研究人员进一步探究肌病的关键特征，例如肌肉功能障碍的发生时机。最后，可在模型的时间进程中评估潜在的治疗靶点，以确定能够预防、减轻和/或完全逆转症状的干预策略。
脓毒症诱导性肌病的治疗难点之一在于缺乏有效的骨骼肌恢复策略1,20。一个重新负荷的阶段，即动物从后肢悬吊（HLS）状态中释放，可为重症监护病房（ICU）出院后的患者提供一个尚未被充分探索的宝贵模型。尽管已有研究表明，在健康动物中，后肢肌肉在HLS结束后能够恢复至正常大小和力量21，但在脓毒症背景下，骨骼肌的再生能力受损3,6，导致对康复干预的再生反应无效20。例如，脓毒症与胰岛素样生长因子-1（IGF-1）水平降低相关22，而IGF-1是HLS后肌肉重新负荷过程中正常再生所必需的因子13。引入重新负荷阶段操作简便（即让动物脱离悬吊装置，观察其损伤后的恢复过程），将使研究人员能够探究脓毒症损伤后肌肉再生的潜在机制。此外，还可在此模型中加入康复干预策略，从而提高发现新治疗方法的可能性。
脓毒症的严重程度是本方案中的一个关键方面，因为许多研究人员使用更粗的针头或更宽的结扎范围来诱导更严重的脓毒症。在本文所述的方法中，我们诱导的是较低程度的感染，以模拟轻度至中度的脓毒症。虽然更严重的感染可能导致更显著的萎缩和肌力减弱，但其死亡率也会呈指数级上升。向宿主施加接近致死水平的感染，并不能代表那些在感染后存活但仍受肌病影响的患者情况。最后，可使用抗生素支持治疗以改善重度脓毒症的死亡率。然而，这可能对基础科学研究造成机制上的干扰，并需要增加更多的对照组。
尽管这是首个将脓毒症与失用性应激相结合的实验方案，但该模型仍存在局限性。虽然该模型旨在研究后肢，但由于小鼠在笼内仅能依靠前肢移动，导致前肢承受一定程度的过度负荷。此外，倾斜的体位会改变血流动力学反应，这可能限制对该模型全身效应的研究。另外，在后肢悬吊（HLS）和/或盲肠结扎穿刺（CLP）阶段监测食物和水的摄入量，可能为了解该模型中肌肉功能障碍的发展过程提供有价值的信息。然而，测量小鼠的食物摄入量具有挑战性，尤其是在使用颗粒状或磨碎饲料时。通常通过报告饲料重量的变化来量化食物摄入量，但关于食物摄入量的测定仍存在若干需考虑的问题23。如果使用颗粒状或磨碎饲料，必须考虑饲料碎屑，因为这些碎屑可能构成饲喂前后重量差异的重要部分。小鼠常会拾取较小的颗粒或碎片，并将其搬运至笼内的巢穴中。这些微小的碎屑容易与垫料混合，难以察觉。使用带金属网底的笼子可便于收集掉落于底部的碎屑。虽然磨碎饲料可在一定程度上减少食物囤积行为，但可能导致更多洒落；而将水与磨碎饲料混合制成湿糊状饲料虽可减少洒落，但会改变饲料的口感，可能因适口性的变化而影响摄入量。既往一项小鼠研究显示，在手术后第5天，CLP组（使用25G针头）与假手术组的食物摄入量无显著差异24。然而，若将后肢悬吊引入该模型后此模式是否仍然成立，仍有待确定。该模型的另一局限性在于未加入抗生素及静脉液体复苏治疗，以模拟重症监护病房（ICU）患者所接受的临床干预。尽管添加这些治疗措施确实可使模型更贴近临床实际情况，但也会引入需要额外控制的新变量。当前模型已包含大量变量，每增加一个新因素都会提升实验复杂性、所需小鼠数量以及统计分析的难度。例如，尽管使用抗生素在临床上具有相关性，但它可能影响脓毒症反应与恢复过程的多个方面，从而增加对脓毒症后骨骼肌恢复特异性效应解读的复杂性。
尽管存在这些局限性，该模型相较于以往用于研究脓毒症诱导肌病的模型仍具有显著改进。例如，固定、去神经支配以及药物诱导的肢体瘫痪均可导致后肢失用，但这些方法无法模拟患者的实际情况，且缺乏提供治疗后阶段（如重新负荷阶段）的能力。
综上所述，该方案提出了一种研究脓毒症诱导性肌病的新型临床前模型，纳入了以往研究中常被忽视的一个关键因素：失用在加重肌病中的作用。通过模拟患者卧床状态，使后肢处于去负荷状态，该模型再现了导致肌肉萎缩和无力的关键病理特征。这一创新为探索肌病的潜在机制提供了平台，将失用作为一个主动因素，用于研究脓毒症中肌肉功能障碍及潜在治疗靶点。

脓毒症是一种由于免疫反应过度激活而导致多器官系统功能受损的危及生命的疾病，给全球医疗系统带来重大负担1。近年来，由于重症监护病房（ICU）管理水平的提高，与脓毒症相关的院内死亡率有所下降1,2。然而，大约75%在初始脓毒症打击后存活的患者会出现骨骼肌萎缩（例如横截面积减小）和肌力减弱（例如肌肉力量产生能力下降）3,4。这一现象被称为脓毒症诱导性肌病，与身体活动能力受损以及日常生活活动独立性丧失密切相关，导致初次发病后五年内再住院率和死亡率升高5。
由于感染具有侵袭性和全身性，脓毒症患者在重症监护室（ICU）恢复期间往往需要长时间卧床休息。在这种情况下，骨骼肌会经历严重的废用状态，这可能会加剧肌肉萎缩和肌力下降3,4。目前尚无有效疗法能够治疗脓毒症诱导的肌病。现有的用于研究该肌病的临床前模型主要采用盲肠结扎穿刺（CLP）6、盲肠悬液7或注射纯化的脂多糖（LPS）——后者是革兰氏阴性菌细胞壁的一种组分8。尽管这些模型能够成功诱导感染，但除了观察到脓毒症动物自然减少活动外，它们并不能准确模拟脓毒症患者体内所表现出的骨骼肌废用状态9。
本研究的主要目的是详细描述如何正确实施小鼠脓毒症诱导性肌病合并失用模型。我们展示了将盲肠结扎穿刺术（CLP）作为脓毒症模型，与后肢悬吊（HLS）作为失用模型相结合，用于研究小鼠脓毒症诱导性肌病的可行性3。此外，还提供了该模型下肌肉力学的代表性结果以及典型的形态学改变。

<table><tbody><tr><td>4-0 Ethicon 涂层 Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>D5792</td><td>用于肌肉层缝合及盲肠结扎的可吸收缝线。</td></tr><tr><td>4-0 Ethilon 黑色 18&quot;&amp;nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>662G</td><td>用于皮肤层缝合的不可吸收缝线。</td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp; PrecisionGlide 针头 26-28 G</td><td>BD</td><td>305136（适用于27g针头）</td><td>用于穿刺盲肠的针头。</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠&amp;nbsp;</td><td>Jackson Laboratory&amp;nbsp;</td><td>品系 #000664</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Puritan</td><td>S-18991</td><td>用于局部涂抹碘液的拭子。</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>(Leica CM1950)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynarex 聚维酮碘消毒液</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td>用于皮肤和黏膜的局部抗菌液体。</td></tr><tr><td>乙醇 200 证明（100%）</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>用于配制70%乙醇以清洁皮肤。</td></tr><tr><td>后肢悬吊笼具</td><td>定制</td><td>N/A</td><td>这些定制笼具将在论文的视频记录中重点展示。</td></tr><tr><td>Optixcare 眼部润滑膏</td><td>Optixcare</td><td></td><td>在存活手术期间用于眼部保护。</td></tr><tr><td>手术刀片 #11</td><td>Fine Science</td><td></td><td>用于皮肤和肌肉切口的刀片。</td></tr><tr><td>Skin-Trac</td><td>Zimmer</td><td>736579</td><td>泡沫胶带，用于将尾巴固定在悬吊装置上。</td></tr><tr><td>SomnoSuite 低流量数字蒸发器</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SS-01</td><td>用于异氟烷麻醉的蒸发器。</td></tr><tr><td>组织浴槽装置&amp;nbsp;</td><td>Aurora Scientific</td><td>型号 800A，双模式肌肉杠杆 300C</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠脓毒症诱导性失用性肌病的临床前模型

A Preclinical Model of Sepsis-Induced Myopathy with Disuse in Mice

脓毒症是院内死亡的主要原因之一。治疗手段的进步使得脓毒症幸存者数量增加。约75%的幸存者会出现肌肉无力和萎缩，从而提高再入院率和死亡率。然而，目前可用的脓毒症临床前模型并未涵盖骨骼肌失用这一脓毒症诱导肌病发生的关键因素。本实验方案的目的是提供一种逐步操作指南，建立一种可模拟长期卧床脓毒症患者临床状况的小鼠模型。本模型采用雄性C57Bl/6小鼠，通过盲肠结扎穿刺术（CLP）诱导脓毒症。CLP术后第4天开始，对小鼠实施后肢悬吊（HLS）7天。实验结果与假手术对照组和/或正常活动（NA）小鼠进行比较。随后解剖肌肉用于 体外 肌肉力学与形态学评估。该模型导致显著的肌肉萎缩和肌力减弱，表现出与脓毒症患者相似的表型。该模型为测试缓解脓毒症诱导性肌病的潜在治疗策略提供了一个平台。

在结果中展示的代表性数据使用了17周龄、体重在27至34 g之间的雄性C57BL/6J小鼠。整个实验方案共需11天完成，包括手术干预（CLP或假手术）、生理盐水和镇痛支持（第0至4天）以及HLS失用处理（第4至11天）。终末实验可在悬吊阶段的任意时间点进行。为了更好地理解该模型对骨骼肌功能的影响，结果汇总了本实验室完成的多项实验数据。除免疫细胞群体的实验在CLP术后第7天进行外，其余各项结果均与在初次手术后第11天接受CLP和/或假手术、HLS和/或正常活动（NA）的匹配动物进行比较。所展示的数据以均值±标准误表示。
典型的生存曲线如图2所示。年轻动物对本实验方案的耐受性相对较好。轻度感染的存活率约为80%至85%。需要强调的是，更严重的损伤将导致更高的死亡率。为了证明CLP手术在诱导感染方面的有效性，图3显示，与假手术动物相比，CLP可导致动物腹腔灌洗液中免疫细胞数量增加。腹腔灌洗样本于CLP术后第7天使用无菌PBS采集，并立即使用Heska Element HT5分析仪进行分析，该分析仪采用激光阻抗法和比色法进行白细胞分类计数。
体重可作为评估模型严重程度的指标，CLP联合HLS通常会导致体重下降11.8% ± 1.4%3。重要的是，当HLS与CLP叠加时，比目鱼肌质量显著降低（图4）。
该模型可促进比目鱼肌横截面积减小3，表现为累积纤维面积曲线向左偏移，提示较小的纤维构成了肌肉切片的主要部分。例如，当CLP与HLS联合使用时，62%的总纤维位于600 µm2至1600 µm2范围内，而接受HLS处理的假手术动物在同一范围内的纤维比例为34%。假手术HLS组的平均横截面积（CSA）为1359 µm2 ± 41 µm2，而CLP HLS组的平均CSA为1233 µm2 ± 67 µm2。这些结果与肌肉萎缩的表现一致。模型对比目鱼肌形态影响的代表性图像见图5。为评估横截面积（CSA），将比目鱼肌置于市售包埋介质（OCT）中，浸入液氮冷却的异戊烷中冷冻后，于-80 °C保存。将包埋在OCT中的肌肉使用冷冻切片机切成10 µm厚的切片，并用苏木精和伊红染色。每只动物约分析1000根纤维，计算其中位面积以测定纤维横截面积。使用美国国立卫生研究院ImageJ软件勾画每张肌肉切片中所有可见纤维的膜边界。
脓毒症诱导性肌病的主要特征之一是肌无力，其在脓毒症患者再入院过程中起着关键作用。该模型表明，失用性因素促进了肌病的发生，这一点在以下情况中可见 图6在经历HLS的脓毒症动物中，可通过比目鱼肌力量产生观察到肌肉无力现象 离体对照组动物（Sham NA）的峰值绝对力为310 ± 14，而接受CLP + NA处理的小鼠峰值绝对力为275.3 mN ± 41.1 mN。然而，当加入HLS后，力量进一步下降至172.2 mN ± 19.11 mN，标志着腓肠肌收缩功能显著下降约40%。为了获取 离体 在施加力量后，分离比目鱼肌。将肌肉置于疏水性培养皿中，用任氏液浸泡，并用不可吸收的丝线缝合固定。随后将其转移至组织浴槽装置中，并在不同频率（5 Hz、15 Hz、30 Hz、50 Hz、80 Hz、120 Hz、150 Hz 和 200 Hz）下进行刺激。
<img alt="小鼠实验时间线示意图；CLP、HLS、NA处理；结果指标：肌肉功能、形态学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66685/66685fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：实验设计。 表示本方案中所述步骤的时间线。第0天：动物接受存活手术（CLP或假手术）；第4天：动物接受后肢悬吊（HLS）或保持正常活动（NA）；第11天：进行终末实验。CLP：盲肠结扎穿刺。HLS：后肢悬吊。NA：正常活动。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/66685fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="随时间变化的生存概率曲线；Kaplan-Meier 法；CLP NA 与 CLP HLS 结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66685/66685fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：雄性 C57Bl6 小鼠（17 周龄）在模型作用下的典型生存曲线代表性结果。 HLS 在此轻度感染水平下未增加死亡率。CLP NA（n=5），CLP HLS（n=5）。CLP：盲肠结扎穿刺。HLS：后肢悬吊。NA：正常活动。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/66685fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血细胞成分分析；散点图、柱状图；白细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞计数。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66685/66685fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：脓毒症及假手术动物在盲肠结扎穿刺（CLP）术后7天腹腔灌洗液中免疫细胞群体的代表性结果。 CLP组动物的关键免疫细胞群体显著升高，表明轻度至中度CLP方法在诱导脓毒症方面是有效的。数据以均值±标准误表示。WBC：白细胞。NEU：中性粒细胞。LYM：淋巴细胞。MONO：单核细胞。EOS：嗜酸性粒细胞。BAS：嗜碱性粒细胞。CLP：盲肠结扎穿刺（采用非配对t检验）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/66685fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比目鱼肌质量比较图，CLP NA 与 CLP HLS，p=0.0005，柱状图，数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66685/66685fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：比目鱼肌质量的变化。CLP HLS 导致比目鱼肌更显著的萎缩。CLP NA（n = 7），CLP HLS（n = 4）。数据以均值 ± 标准误表示。为模型响应下比目鱼肌质量的代表性结果。CLP：盲肠结扎穿孔。HLS：后肢悬吊。采用非配对 t-test 进行统计分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/66685fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="假手术组与CLP HLS实验结果的累积纤维面积图及肌肉组织学比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66685/66685fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：模型作用下肌肉横截面积的代表性结果。（A）CLP HLS 引发肌肉萎缩，表现为纤维面积向左偏移。数据以均值±标准误表示。显示假手术组与脓毒症动物模型作用下的腓肠肌纤维累积面积。假手术 HLS（n = 3），CLP HLS（n = 4）。（B）假手术组与脓毒症动物腓肠肌的苏木精-伊红染色。CLP：盲肠结扎穿孔。HLS：后肢悬吊。比例尺 = 250 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/66685fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肌肉力量-频率图和条形图，显示假手术NA、CLP NA、CLP HLS组的峰值力量数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66685/66685fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：比目鱼肌力量-频率曲线对模型干预的代表性结果。 （A）绝对力量-频率曲线。CLP HLS导致比目鱼肌的绝对力量和峰值力量显著下降。假手术NA组 n = 3，CLP NA组 n = 3，CLP HLS组 n = 3。（B）不同模型干预下的峰值绝对力量。假手术NA组（n = 3），CLP NA组（n = 3），CLP HLS组（n = 3）。数据以均值±标准误表示。CLP：盲肠结扎穿孔。HLS：后肢悬吊。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/66685fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：典型的剑突表面温度和体重波动。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件1：改良小鼠脓毒症评分（MMSS）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66685/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

该小鼠模型结合了脓毒症损伤与后肢肌肉失用，以模拟典型脓毒症患者长期卧床的特征。此模型显著区别于以往研究脓毒症中肌肉功能障碍的模型，是一种可重复用于探索治疗策略以应对该病症的方法。

脓毒症是院内死亡的主要原因之一。治疗手段的进步使得脓毒症幸存者数量不断增加。约75%的……

我们的研究重点是阐明脓毒症诱导肌病的发病机制。目前的模型忽略了失用性因素，而这一因素对于准确评估脓毒症重症患者至关重要。我们旨在整合这一方面，以建立更为精确的疾病模型。我们通过将盲肠结扎穿刺模型与后肢悬吊技术相结合，显著推动了该领域的发展。这种整合方法使我们能够研究脓毒症的全身性影响以及肌肉失用对脓毒症诱导肌病的作用，从而为理解疾病进展及潜在干预措施提供了更为真实的模型。我们的实验方案在小鼠中结合盲肠结扎穿刺与后肢悬吊，以更准确地模拟人类脓毒症的临床情况。通过模拟脓毒症患者中出现的肌肉萎缩和肌力减弱，我们的方法为研究脓毒症与肌肉功能之间的相互作用提供了全面的模型，有助于更精准地开展针对治疗干预措施的探索。

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