Name: 小鼠胰腺内皮细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 了解从小鼠胰腺中分离内皮细胞的方法，采用温和解离和磁珠分选技术。该方法可高效富集高活性细胞群体，并通过定量PCR和蛋白质印迹验证标记基因，为研究胰腺血管生物学和疾病机制提供可靠技术基础。

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作者感谢 Dr.&#160;感谢希望之城的 Brian Armstrong 和加利福尼亚大学河滨分校的 Mindy Rodriguez 提供的技术支持。本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助（R01 HL145170，授予 ZBC）、艾拉·菲茨杰拉德基金会（授予 ZBC）、希望之城（Arthur Riggs 糖尿病代谢与研究所创新奖）以及加州再生医学研究所（EDU4-12772，授予 AT）提供经费支持。本出版物中报告的研究包括在光镜与数字成像平台完成的工作，该平台由美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助（资助号 P30CA033572）支持。 图1 和 图2 使用 BioRender 制作。

组织分离操作根据希望之城贝克曼研究所动物护理和使用委员会（IACUC，美国加利福尼亚州杜阿尔特）批准的研究方案 #17010 进行。本研究中使用的是在 C57BL/6 背景下、年龄为 8 至 12 周的 Tie-2CreERT2;Rosa26-TdTomato 小鼠品系。在此品系中，内皮细胞（ECs）在给予他莫昔芬诱导后可被 TdTomato 标记，方法如先前所述34。然而，本方案可适用于不同基因型和遗传背景的成年小鼠的各个年龄段。
1. 组织采集（预计时间：1-2 小时）
注意：每只动物的操作时间约为 15 分钟，建议每次解离样本最多合并 3 只动物。
<ol>
	<li>采用过量二氧化碳（CO2）实施安乐死，并通过二次确认确保动物死亡。解剖前，用70%乙醇（EtOH）喷洒整个动物体表，彻底消毒操作区域。</li>
	<li>用大头针固定四肢并拉直。使用手术剪从腹部下端开始，沿中线方向剪开皮肤和腹膜，切口向上延伸至胸腔区域。</li>
	<li>剪开膈肌以暴露肋骨，抬起肋骨以显露心脏。</li>
	<li>将连接注射器（内含冰上预冷的无菌PBS）的针头（25G–30G）插入心脏左心室。</li>
	<li>以5–10 mL/min的速度经心脏灌注PBS。灌注10 mL后停止，或直至肝脏和肾脏颜色变浅为止。</li>
	<li>灌注完成后，定位胰腺（位于胃下方并与十二指肠相连）35（图3A），使用解剖剪和镊子小心将其取出。</li>
	<li>分离后，将胰腺转移至含有10 mL冰上预冷的PBS + 0.2 mg/mL胰蛋白酶抑制剂的50 mL离心管中，置于冰上保存（图3B）。 
	注意：此步骤中最多可将3只小鼠的胰腺合并收集至同一离心管中。样本在冰上保存时间最长不超过2小时。</li>
</ol>
2. 胶原酶制备（预计时间：15–30 分钟）
<ol>
	<li>按以下说明配制溶液和缓冲液。
	<ol>
		<li>消化液：将I型胶原酶加入50 mL离心管中，终浓度为1 mg/mL，溶于杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS 1x（含Ca2+、Mg2+；参见材料表）中，并加入0.001 U/mL DNase I和0.2 mg/mL胰蛋白酶抑制剂。</li>
		<li>终止消化液：磷酸盐缓冲液（PBS 1x，不含Ca2+、Mg2+；本方案中其余所有PBS均为此种；参见材料表），添加5%牛血清白蛋白（BSA）和0.001 U/mL DNase I，或使用DMEM加10%胎牛血清（FBS）和0.001 MU/mL DNase I。</li>
		<li>洗涤缓冲液：PBS 1x中加入0.5%牛血清白蛋白（BSA）、0.001 U/mL DNase I和0.05&#160;mg/mL胰蛋白酶抑制剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>充分溶解缓冲液，并通过0.22 µm滤膜过滤。置于冰上备用。</li>
</ol>
3. 消化（预计时间：40 分钟至 1 小时）
<ol>
	<li>从冰冻的 PBS 中取出胰腺，置于冰上的培养皿中。使用手术剪刀和镊子小心去除多余组织（例如脾脏、脂肪、碎片）（图 3C）。 
	注意：必须去除脂肪，因为过量脂质可能干扰组织消化。</li>
	<li>将修整好的小鼠胰腺转移至含有 1 mL 消化液的 5 mL 离心管中。</li>
	<li>将离心管置于冰上，用解剖剪将胰腺组织剪切成细小的可移液片段，例如 0.5 mm 或 1 mm 大小。将裂解物转移至 50 mL 离心管中，并保持在冰上。</li>
	<li>将额外的胰腺组织加入最初用于剪切胰腺组织的 5 mL 离心管中，并加入额外的 1 mL 胶原酶。根据需要对多个胰腺样本重复此步骤。</li>
	<li>向该 5 mL 离心管中加入 2 mL 胶原酶溶液，以冲洗残留的胰腺组织，并将其转移至 50 mL 离心管中。每 3 个胰腺的总胶原酶体积应为 5 mL，单个胰腺则为 3 mL。</li>
	<li>所有样本完成机械解离后，将含有匀浆组织裂解物的 50 mL 离心管转移至 37 °C 水浴中，孵育 10 分钟。 
	注意：在此过程中切勿剧烈震荡或涡旋组织混合物，以免导致腺泡组织破裂，释放大量内源性酶和 DNA。</li>
	<li>从水浴中取出离心管，轻轻旋转混匀，再放回水浴中继续孵育 10 分钟（总时间：20 分钟）。 
	注意：在 37 °C 水浴中的总时间不得超过 30 分钟，以避免过度消化。</li>
	<li>将离心管置于冰上，使匀浆物依靠重力自然沉降。沉降完成后，将上清液通过 70 µm 滤膜过滤，并加入 5 mL 终止消化液。</li>
	<li>向剩余沉淀中加入 1 mL 消化液，使用 18G 针头吹打重悬。</li>
	<li>将剩余的匀浆物通过滤膜过滤，并用额外的 5 mL 终止消化液冲洗滤膜。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 300 x g 离心 10 分钟，收集细胞。用移液器彻底吸除上清液，将细胞沉淀置于冰上保存。</li>
	<li>用 1 mL 洗涤缓冲液重悬细胞沉淀，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>取少量重悬的细胞沉淀（10 µL），按 1:1 比例与台盼蓝混合，使用细胞计数仪进行细胞计数并测定细胞活力。</li>
</ol>
4. 内皮细胞（EC）富集（预计时间：2-3 小时）
<ol>
	<li>每计数 1 × 107 个细胞加入 1 µL 抗 CD31-biotin 抗体，在 4 °C 条件下于旋转仪上孵育 30 分钟（约每 3 个胰腺加入 5 µL）。</li>
	<li>每管加入 20 µL 抗生物素微珠，在 4 °C 条件下于旋转仪上孵育 40 分钟。</li>
	<li>在磁力架上安装分选柱支架并插入分选柱，用 3 mL 洗涤缓冲液平衡分选柱。</li>
	<li>将样品加入分选柱中，总共用 9 mL 洗涤缓冲液洗涤。 
	注意：若细胞浓度过高，需在另一管中用额外 2 mL 洗涤缓冲液稀释细胞。每次向分选柱中加入 1 mL 样品，以防止柱子堵塞。</li>
	<li>将分选柱从支架上取下，放入一个 15 mL 离心管中。向分选柱中加入 5 mL 洗涤缓冲液，使用推杆将细胞从柱中推出，并收集洗脱液（含富集的内皮细胞，EC）。</li>
	<li>将流穿液和洗脱液/EC 组分在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 10 分钟。按步骤 3.13 的方法计数细胞并测定细胞活力。</li>
	<li>通过定量 PCR（qPCR）检测流穿液和 EC 组分，验证内皮细胞的富集效果。使用 NK6 同源框 1（Nkx6.1）作为内分泌细胞的通用标志物，血小板和内皮细胞黏附分子（Pecam1）作为内皮细胞（EC）的标志物33。使用 36B4（Rplp0，酸性核糖体磷蛋白 p0）作为基因表达归一化的内参对照。 
	注意：在此步骤中收集的样品可用于蛋白质或 RNA 分析。</li>
</ol>
5. 培养 pECs
<ol>
	<li>配制 M199 培养基。向 M199 培养基中添加胎牛血清（FBS）至终浓度为 20%，并添加青霉素-链霉素至终浓度为 0.1%。</li>
	<li>用 I 型胶原蛋白（1 mg/mL 溶于 0.1 M 乙酸）包被一个 60 mm 细胞培养皿，在室温下静置 30 分钟。</li>
	<li>去除 I 型胶原蛋白溶液，用 1× PBS 洗涤培养皿两次。加入 2 mL 预先配制的 M199 培养基，将培养皿置于标准细胞培养孵箱（5% CO2，37 °C）中孵育 5 分钟。</li>
	<li>细胞分离后，将分离的细胞接种至预热的 M199 培养基培养皿中。在培养条件下维持细胞生长约 14 天，每 2–3 天更换一次培养基。</li>
</ol>

Streamlining Mouse Pancreatic Endothelial Cell Extraction for Disease Studies

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种富集和分离胰腺内皮细胞（pECs）的实验方案。与以往从其他组织或器官中分离内皮细胞（EC）的方案类似，本方案主要包括三个关键步骤：物理性解离、酶消化以及基于抗体的内皮细胞富集。为应对胰腺组织处理过程中的独特挑战，我们在方案中引入了若干关键改进和关键步骤：1）采用温和的一步式胶原酶消化法，并缩短孵育时间；2）添加较高浓度的DNase和胰蛋白酶抑制剂，以最大限度减少DNA污染和内源性酶消化，这些因素可能干扰抗体结合，从而降低内皮细胞的富集效率和细胞活性；3）在消化步骤后进行细胞计数，以调整加入样本的抗体用量，从而优化内皮细胞的富集效果。在优化该方案的过程中，我们测试了先前研究中使用的其他酶类，例如胰蛋白酶28、IV型胶原酶31，以及不同的消化温度（如4 °C）和不同的孵育时间（表1）。我们发现，I型胶原酶在37 °C下消化20分钟是小鼠pEC分离的最佳条件，因此本研究采用此条件。尽管在灌注过程中加入抗凝剂可能提高整体细胞活性，但常用的抗凝剂（如EDTA或肝素）可能干扰某些酶的活性，例如用于细胞解离的胶原酶以及qPCR中使用的逆转录酶。为避免这些抗凝剂带来的意外或不利影响，本方案采用不含Ca2+和Mg2+的PBS进行灌注。
我们专注于开发一种从完整小鼠胰腺中富集内皮细胞（EC）群体的方案，该方案将包括胰岛内EC和外分泌组织中的EC，从而获得更高的产量。在本方案中，我们在解离步骤中合并了3只动物的胰腺，平均获得约2.0 × 106个活细胞的单细胞悬液。我们也测试了单只小鼠胰腺的样本，可获得约75万个细胞。值得注意的是，当调整为处理单个动物时，应使用较少的解离液（每胰腺3 mL解离液）。本方案中的一个关键步骤是彻底修剪并清除附着在胰腺上的任何残留脂肪（图3B）。脂肪组织污染会影响胶原酶消化过程，干扰胰腺单细胞解离步骤，降低后续富集步骤中的细胞活力38。此外，为了富集胰腺内皮细胞（pECs），我们使用了一种广谱EC表面标志物PECAM1/CD31。通过使用PECAM1/CD31抗体，我们能够显著富集内皮细胞组分，基因表达分析结果也证实了这一点。在本方案开发过程中，我们还测试了CD144抗体的适用性，该抗体也常用于分离内皮细胞13。然而，我们未能成功富集pECs（数据未显示）。有趣的是，免疫荧光染色显示，在胰腺组织中，CD31在所有内皮细胞中均有表达，而CD144抗体似乎仅标记胰岛内的内皮细胞（图5A）。此外，我们分析了来自C57BL/6小鼠胰岛的公开单细胞RNA测序数据（GSE128565）37，发现约50%的胰岛内皮细胞同时表达Cdh5（VE-Cad）和Pecam1，其余胰岛内皮细胞仅表达Cdh5或Pecam1（图5B）。因此，我们推测CD31抗体更适用于pEC的分离，而CD144抗体在此用途中的有效性尚需进一步研究。此外，市面上已有与磁珠偶联的抗CD31抗体，可将两步抗体结合步骤简化为一步操作。
如所示，我们通过qPCR、免疫印迹、流式细胞术和免疫荧光染色来验证分离得到的内皮细胞（EC）组分。可以预见，这些组分还可用于其他检测，例如（单细胞）RNA测序（(sc)RNA-seq）和质谱分析。本实验方案的一个局限性在于，我们尚未能实现稳定的继代培养并进行功能检测。鉴于已知分离的小鼠内皮细胞的继代培养具有挑战性，这一领域仍有待未来进一步探索。一种可能的解决方案是引入大T抗原（large T antigen），该抗原已被用于永生化原代细胞39。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）的最新进展及其应用已实现了对胰腺细胞40，尤其是胰岛细胞41的高分辨率分析。然而，大多数现有研究集中于内分泌细胞群体，并采用不能有效保留内皮细胞（ECs）的组织解离方案。因此，ECs在捕获的全部细胞群体中通常比例极低，仅占3%–5%42,43,44。最近一项方案通过两步酶消化与失活处理，结合荧光激活细胞分选步骤，可使ECs在全部胰腺细胞中占比达到12%45。与该方案互补，我们的方案提供了一种简化的操作流程，若研究重点为ECs，则可能更具成本效益且技术要求更低。尽管本方案目前仅在小鼠胰腺中经过验证，但其可扩展并适用于从其他生物体（包括人胰腺）中分离ECs。

胰腺是代谢调控和内环境稳态的关键器官，具有高度血管化的结构。胰腺兼具内分泌和外分泌功能，分别负责调节血糖水平和消化酶的分泌。这两个功能区通过广泛的胰腺血管网络相互连接，促进氧气、激素和酶的交换与运输。尤为重要的是，这一致密的毛细血管网络深入朗格汉斯岛（Islet of Langerhans）——胰腺内负责内分泌功能的一类激素调控细胞群，其主要由分泌胰高血糖素的α细胞、分泌胰岛素的β细胞以及分泌生长抑素的δ细胞组成1,2。尽管胰岛仅占胰腺总质量的1–2%，却接收了约20%的总血流量3，凸显了胰岛血管系统的重要性。胰腺毛细血管主要由高度 fenestrated（有孔）的内皮细胞（ECs）构成，这些细胞周围被壁层周细胞（mural pericytes）包绕。这些毛细血管内皮细胞在胰岛的发育、成熟及功能（或功能障碍）中发挥关键作用，并与多种内分泌和外分泌细胞之间形成密切的交互作用4（图1）。
在1型和2型糖尿病中均观察到内皮功能障碍，这两种疾病是最常见的由胰岛功能障碍引起的病症5,6。糖尿病可导致胰岛微血管密度和形态的改变7。此外，胰腺癌是一种高度侵袭性肿瘤，有时可表现为糖尿病，其特征是微血管密度高但灌注不良8。鉴于内皮细胞（ECs）在正常和病变胰腺组织中具有关键的结构和功能作用，迫切需要研究胰腺内皮细胞（pECs）在发育、生理和病理过程中的作用，以揭示驱动健康或疾病状态的机制。
已开发出多种从不同小鼠（例如脑9,10、肺11、心脏12、肝脏13、骨骼肌14和脂肪组织15）及人类（例如脑16、内脏脂肪组织17,18、周围神经19、肺20,21,22和肠系膜动脉23）组织中分离内皮细胞（ECs）的实验方案。这些方案通常包括使用酶消化法（例如胶原酶、胰蛋白酶24、分散酶24,25和Liberase26），随后进行基于抗体的富集步骤。此外，这些方案往往依赖于在37 °C下以高浓度酶长时间消化，并伴随剧烈震荡（表1）。由于胰腺具有独特的特性，包括其富含大量内源性消化酶，因此现有方案无法直接用于分离胰腺内皮细胞（pECs）。首先，胰腺的细胞外基质（ECM）组成与其他组织不同。虽然胶原酶常用于内皮细胞的分离，但其存在多种亚型，对不同组织具有特异性的解离能力，因此需要优化选择。其次，对于pEC的分离尤为关键的是，胰腺内源性酶的释放和激活会显著干扰分离过程。因此，必须谨慎操作以尽量减少外分泌腺泡细胞（zymogens、蛋白酶和RNase的主要来源27）的破裂，否则可能引发进一步的细胞损伤，导致细胞存活率降低，并整体影响细胞回收效率27,28,29。
为应对这些挑战，我们借鉴了现有的内皮细胞（EC）分离方案，并建立了一种适用于从小鼠胰腺中分离内皮细胞的新方案&#160;。具体而言，本文描述了一个工作流程（图2），该流程采用I型胶原酶（通常用于肺组织内皮细胞的分离）、较低的消化温度且不进行振荡（以防止胰腺酶原的激活），并添加DNase30,31,32（以防止DNA诱导的细胞凋亡并提高细胞活力），以及针对CD3133（PECAM1，一种泛内皮细胞标记物）的抗体。该方案可获得从小鼠胰腺中分离出的内皮细胞群体，可用于基因表达谱分析和蛋白质检测。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>25G 针头</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q712-03-AA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 离心管</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>14282300</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 滤网</td><td>Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD31 生物素标记抗体</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>REA784</td><td></td></tr><tr><td>热激处理的牛血清白蛋白</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白（来自小牛皮）</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C9791</td><td>实验方案中的贴壁试剂</td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原酶&amp;nbsp;</td><td>Worthington Bio</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Countess 自动细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>D1306</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>一次性安全手术刀</td><td>Myco Instrumentation</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>260913&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (含 Ca²⁺, Mg²⁺)</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td></td><td></td><td>维持在 37 &amp;deg;C、5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>M199 培养基</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td></td></tr><tr><td>MACS 多功能支架配 QuadroMACS 分离器&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>抗生物素磁珠</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>用于评估细胞形态</td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R 摇床&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab56299</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (10X) (不含 Ca²⁺, Mg²⁺)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507-XB</td><td></td></tr><tr><td>引物 36B4 小鼠正向</td><td>IDT</td><td></td><td>AGATTCGGGATATGCTGTTGGC</td></tr><tr><td>引物 36B4 小鼠反向&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC</td></tr><tr><td>引物 Kdr 小鼠正向&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCAGAATCCTCTTCCATGC</td></tr><tr><td>引物 Kdr 小鼠反向</td><td>IDT</td><td></td><td>AAACCTCCTGCAAGCAAATG</td></tr><tr><td>引物 Nkx6.1 小鼠反向&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>CACGGCGGACTCTGCATCACTC</td></tr><tr><td>引物 Nxk6.1 小鼠正向</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCTACTTTAGCCCCAGCG</td></tr><tr><td>引物 PECAM1 小鼠正向</td><td>IDT</td><td></td><td>ACGCTGGTGCTCTATGCAAG</td></tr><tr><td>引物 PECAM1 小鼠反向</td><td>IDT</td><td></td><td>TCAGTTGCTGCCCATTCATCA</td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>无 RNase 水</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>无菌 12&quot; 长镊子</td><td>F.S.T</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>无菌精细镊子</td><td>F.S.T</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>无菌精细剪刀</td><td>F.S.T</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿 2 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Fisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Corning</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>10109886001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VE-钙黏蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胰腺内皮细胞的分离

Isolation of Mouse Pancreatic Endothelial Cells

胰腺是维持机体代谢平衡的重要器官，部分原因在于其能够产生胰岛素和胰高血糖素等代谢激素以及消化酶。胰腺也是一个高度血管化的器官，这一特性得益于复杂的胰腺毛细血管网络。这一广泛的毛细血管网络由高度有孔的内皮细胞（ECs）构成，这些细胞对胰腺的发育和功能至关重要。因此，ECs的功能障碍可能在糖尿病和癌症等疾病中导致胰腺功能异常。因此，研究胰腺内皮细胞（pECs）的功能不仅有助于理解胰腺生物学，也有助于相关疾病的病理机制研究。小鼠模型是研究代谢性和心血管疾病的重要工具。然而，由于ECs数量相对较少，且腺泡组织可能释放大量消化酶，导致细胞损伤和得率低，目前尚无详细描述的小鼠pECs分离方案。为应对这些挑战，我们设计了一种富集和回收小鼠pECs的方案，结合了温和的物理和化学解离以及抗体介导的筛选方法。本文所述方案提供了一种从完整小鼠胰腺中提取完整且具有活性的ECs的可靠方法。该方案适用于多种下游检测，并可应用于多种小鼠模型。

按照本方案，可获得约 2 x 106 当合并3只小鼠的胰腺时可获得活细胞，单只小鼠胰腺可获得750,000个细胞。为验证内皮细胞（EC）的富集效果，我们进行了以下分析：1）定量PCR：与流穿组（FT）样本（即未与CD31抗体结合的组分）相比，EC组分中相关标志物的表达水平显著升高 Pecam1 （编码 CD31）和 Kdr （编码VEGFR2），两种内皮细胞标志基因33，以及更低水平的NK6同源框1（Nkx6.1，胰腺内分泌细胞中的一种转录因子（图4A）；2）Western印迹：三个制备样品中的内皮细胞富集组分（pEC-1-3）在预期大小（约130 kDa）处显示出强烈的CD31信号。相比之下，输入样品和流穿样品中的CD31信号极弱。作为阳性对照，pEC细胞系MS1细胞的裂解液也显示出强烈的CD31信号（图4B）；3）台盼蓝染色：我们发现分离细胞的存活率约为50%（图4C)；4）按照已发表的方案进行流式细胞术15 ：通过圈选活细胞群体（图 4D），我们发现CD31+细胞占88%，TdTomato+细胞占76%。值得注意的是，大多数分离的细胞共表达CD31和TdTomato（图4E）。作为阴性对照，未染色的MS1细胞以及与IgG孵育的MS1细胞未显示由CD31标记的活细胞。作为阳性对照，即经CD31染色的MS1细胞，显示出接近100%的活CD31+细胞（图4F）。我们还对分离的细胞进行培养，并参照已发表的方案进行PECAM1的免疫荧光染色36，并对TdTomato进行成像，结果显示分离的细胞中两种标记物均呈现强烈的信号，提示内皮细胞（ECs）的存在（图 4G).
<img alt="胰腺内皮细胞示意图，显示胰岛内内皮细胞的结构与连接。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：胰腺及胰岛血管化的示意图。 胰腺内皮细胞（ECs）和胰岛内ECs的图示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胰腺单细胞样本制备示意图；离心机、CD31-生物素、细胞计数、RNA分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：实验流程概览。1）胰腺解剖，2）机械消化，3）酶孵育，4）离心，5a）去除上清液，以及5b）对细胞沉淀进行二次胶原酶消化并吹打混匀以用于后续步骤6）、7）和8）的过滤、重悬及抗体结合，9）微珠孵育，10）MACS柱富集，11）活细胞计数，以及12）下游分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胰腺收获与分离过程；用于研究的组织制备，逐步实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：组织处理步骤。 分别为（A）腹腔图像、（B）分离后的小鼠胰腺以及（C）修整后的小鼠胰腺图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="内皮细胞中的基因表达分析、流式细胞术和蛋白质检测；图表与显微镜成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4小鼠胰腺分离内皮细胞组分的验证 (A) 对FT样本及通过CD31富集的EC组分进行qPCR。 Pecam1 （CD31） Kdr （VEGFR2），以及 Nkx6.1 （胰腺β细胞特异性转录因子）33. * 表示 p &lt;0.05，相较于基于FT的结果 t 检测。n = 3–4 个混合样本，每个样本由 3 只小鼠组成。（B) CD31 的 Western 印迹分析。pEC-1-3 表示来自 3 个独立混合小鼠样本的富集内皮细胞。每泳道上样 30 mg 细胞裂解液，随后进行 Ponceau S 染色。C) 富集的pECs细胞计数及台盼蓝染色进行活力检测。D) 小鼠肺内皮细胞经4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和CD31抗体染色后的流式细胞术设门策略。E) 未染色MS1细胞的流式细胞术直方图（左上），使用AlexaFluor-488二抗染色的MS1细胞（IgG对照；右上），使用CD31染色的MS1细胞（左下），以及分离的小鼠肺内皮细胞（pECs）使用CD31染色的结果（右下）。F通过流式细胞术定量的活细胞百分比。G) CD31表达的免疫荧光（绿色），DAPI复染（蓝色）及内源性TdTomato荧光报告基因（红色）。比例尺 = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示CD31、CD144、DAPI的细胞免疫荧光图像；Cdh5、Pecam1分析的UMAP图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：小鼠胰腺中CD31和CD144的特异性。（A）小鼠胰腺的免疫荧光染色，显示CD31（品红色）和CD144（青色），DAPI复染。图像使用倒置荧光宽场显微镜配备10倍物镜拍摄。比例尺 = 100 µm。虚线标示胰岛区域。（B）单细胞RNA测序（scRNA-seq，GSE128565）检测C57BL6小鼠胰岛内皮细胞中Cdh5和Pecam1表达的均匀流形近似与投影（UMAP）图37。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>酶</td>
			<td>用途</td>
			<td>温度与时间</td>
			<td>参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>单细胞解离，全胰腺内皮细胞富集</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>本实验方案</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>胰岛分离及非酶解离</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase + Trypsin</td>
			<td>小鼠胰腺导管细胞研究</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>胰腺单细胞悬液制备</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase NBI</td>
			<td>胰岛分离</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>腺泡细胞活性悬液制备</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase XI</td>
			<td>胰岛分离</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>单细胞悬液制备</td>
			<td>37 °C, 45 min</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>单细胞悬液制备</td>
			<td>37 °C, 10 min</td>
			<td>25, 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>单细胞解离，全胰腺处理</td>
			<td>4 °C, O/N</td>
			<td>28</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于处理小鼠胰腺样本的各种实验方案摘要。

本方案描述了从小鼠完整胰腺中分离内皮细胞的方法。

胰腺是维持机体代谢平衡的重要器官，部分原因在于其能够产生胰岛素等代谢激素以及……

本研究的目的是加深对胰腺血管系统在正常胰腺生物学功能及疾病发生中作用的理解。通过成功富集内皮细胞组分，我们旨在鉴定血管系统中调控胰腺功能的特异性通路，这些通路未来可能成为靶点，用于在疾病状态下恢复和增强胰腺功能。近年来，内皮细胞功能障碍在胰腺病理过程中的作用日益受到关注。胰腺内皮细胞群体异质性的鉴定，有助于理解内皮细胞与胰腺相互作用在疾病发生或防护中的作用机制。单细胞或单细胞核RNA测序、蛋白质组学和基因组学等组学方法正被用于在细胞水平上研究胰腺。为了在组织或空间水平上获得更深入的认识，目前正采用Visium和Xenium等基于无偏倚和探针技术的新平台进行研究。在本实验方案中，我们描述了一种温和的解离技术，可最大限度减少内源性胰腺酶对细胞活力的降低作用，以及一种磁珠细胞分选方法，用于选择性富集内皮细胞。本方案中的解离与富集策略将有助于进一步研究胰腺内皮细胞的细胞表面标志物及其转录组，而这些研究此前因技术限制而未得到充分探索。首先，将已处死的小鼠置于手术台上。拉伸小鼠的四肢并用针固定。使用手术剪从腹部下端沿中线穿过皮肤和腹膜做一小切口，并向胸部区域延伸。剪开膈肌，抬起肋骨以暴露心脏。将连接有含冰冷无菌 PBS 注射器的 25 至 30 号针头插入心脏左心室。以每分钟 5 至 10 毫升的速度灌注心脏，注射 10 毫升后停止。然后使用解剖剪刀和镊子小心取出胰腺。将胰腺转移至含有10毫升预冷PBS的50毫升离心管中，同时加入胰蛋白酶抑制剂，并将离心管置于冰上。首先，在含有预冷PBS的培养皿中获取小鼠胰腺。使用手术剪刀和镊子仔细去除多余组织。将修整好的胰腺转移至含有1毫升解离液的5毫升离心管中。用解剖剪将胰腺组织剪成细小碎片，期间保持离心管置于冰上。将裂解液转移至置于冰上的50毫升离心管中。加入两毫升胶原酶溶液至五毫升离心管中，以去除任何残留的胰腺组织，并将其转移至50毫升离心管中。将离心管置于37°C水浴中孵育20分钟。将含有组织匀浆的离心管置于冰上，静置沉降。随后将上清液通过70微米滤膜，并加入5毫升解离终止液。使用27号针头，用额外的1毫升解离液吹打重悬剩余的沉淀，并如前所述通过滤膜。将细胞悬液在4摄氏度、300 ×g离心10分钟，然后将沉淀重悬于1毫升洗涤缓冲液中。将一乘以十的七次方个细胞与一微升抗CD31生物素抗体在旋转仪上孵育。加入二十微升抗生物素磁珠，继续孵育四十分钟。然后在磁力架上安装柱分离器支架，并插入分离柱。平衡柱子后，将样品加入柱中，并用总共9毫升洗涤缓冲液进行洗涤。从柱架上取下柱子，放入一个15毫升离心管中。向柱中加入5毫升洗涤缓冲液。使用活塞将柱中的细胞向下推，收集含有内皮细胞的洗脱液。最后，离心流出液和洗脱液组分。重悬后，计数细胞并测定其活力。通过定量PCR分析验证内皮细胞的富集效果，结果显示富集组分中标志基因Pecam1和Kdr的表达水平显著高于流穿样品。在富集组分中，胰腺内分泌细胞转录因子NK6 homeobox 1的表达水平较低。Western blot检测显示，在预期大小处有明显的CD31信号，进一步证实了组分中内皮细胞的有效富集。

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科研

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生物学

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