Name: 用于确定狨猴卵巢周期阶段的血液采样和激素测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 了解狨猴血液采样与激素测量技术，用于精准预测排卵日期和确定卵巢周期阶段。该方法通过测量孕酮、雌二醇和绒毛膜促性腺激素水平，提高生殖管理效率，为转基因狨猴制备和雄性生殖细胞研究提供重要技术支持。

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我们感谢申春申、Akutsu Hiroko、Sugiki Fumiyo、Hashimoto Yuuna、Naritomi Hina、Sakamoto Yuuki&#160;和Horigome Mikiko在建立本实验方案以及日常狨猴护理工作中提供的支持；感谢峰重贵对稿件提出的修改意见；感谢阿部裕子及Aiba实验室成员分享合子采集技术；感谢CIEA分享其在狨猴饲养与实验方面长达40年积累的经验与信息。本研究由AMED、JST和KAKENHI资助，项目编号分别为JP19gm6310010、JP20gm6310010、JP21gm6310010和JP22gm6310010（AMED），JPMJPR228B（JST），20H05764、20H03177和22K18356（KAKENHI）。

所有涉及狨猴的研究方法均遵循高伦理标准和福利规范，并已获得国家儿童健康与发育中心机构动物护理和使用委员会的批准。实验所用动物为单只饲养或成对饲养（一雌一雄），每日光照12小时。
1. 血液采样&#160;股静脉
<ol>
	<li>准备一支1 mL注射器（短型更易操作），安装25 G针头，针刃朝上。为避免血液堵塞，用200 µL未稀释的肝素钠溶液冲洗注射器：将肝素吸入注射器内，反复抽拉数次使其均匀涂布内壁，然后将肝素溶液排出。 
	注意：由于常需更换新注射器，建议额外准备若干已肝素化的注射器。</li>
	<li>准备好吸水棉和酒精棉片。打开可调光源，照亮用于放置狨猴采血区域的位置。</li>
	<li>准备固定装置（420 × 85 × 85 mm，图1A），该装置为市售产品（详见材料表）。将固定装置的海绵绑带打开，放入狨猴，使其仰面朝上进入装置内。 
	注意：狨猴在固定装置中通常较为安静，可能无需进行固定适应性训练。</li>
	<li>捕捉狨猴，将其插入圆筒部分，并通过压紧海绵绑带加以固定。将用于采血的腿置于另一条腿之上（图1A）。用非优势手握住双腿，中指和无名指分别插入每条腿内侧以固定，其余手指置于外侧辅助固定。 
	注意：捕捉狨猴时建议佩戴防咬手套。若无固定装置，应在麻醉状态下或由另一人协助固定狨猴后进行采血。</li>
	<li>检查股静脉是否在大腿根部可见。如不可见，可通过触诊定位搏动的动脉，并以此为标志判断静脉位于其内侧走行（图1B-D）。 
	注意：建议使用台灯照明并剃除局部毛发以提高可视性。也可用酒精棉片擦拭皮肤以增强静脉可见度。三角区内的淋巴结常靠近静脉，呈深蓝色类似静脉。如何区分两者详见“代表性结果”部分。</li>
	<li>使用酒精棉片对穿刺部位进行消毒。将针头针刃朝上，以15°–20°角刺入皮肤。为防止采血过程中针头滑出血管，应稳定持注射器的手，例如将其支撑于另一只手上。</li>
	<li>轻柔回拉活塞以产生负压（图1E），同时将针尖缓慢前推。一旦血液进入注射器，保持针尖位置不动，直至采集到所需体积（500–700 µL）。
	<ol>
		<li>若无血液进入注射器，应更换穿刺位置。若拔针时有血液流出，需对穿刺点施加压力止血3分钟。止血完成后，重新开始穿刺操作。</li>
		<li>若采血过程中血液流入中断，可缓慢将针尖向前推进后再回撤，以重新定位血管，可能恢复血流。若仍无效，则拔出针头，更换新的注射器重新穿刺。 
		注意：当同侧腿部难以采血时，可尝试使用对侧大腿进行采血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>拔针时用小指轻压穿刺点，随后立即用吸水棉签对穿刺部位加压3分钟以彻底止血。将注射器倒置，轻轻混匀血液与肝素。 
	注意：若采集动脉血，应在冷敷条件下延长加压时间（5分钟），并仔细确认出血完全停止，以防血肿形成，严重时可能导致致命后果。</li>
	<li>确认出血停止后，松开海绵绑带，一手握住动物腰部，另一手从背部穿过并握住其腋下，旋转动物使其安全脱离装置。</li>
	<li>将狨猴放回笼中。为减轻应激并便于后续重复采血，可给予其喜爱的食物（如饼干、棉花糖或海绵蛋糕）。定期检查是否出现血肿。 
	注意：若早期发现血肿，应立即加压包扎以防止进一步扩大。若发现较晚，可能需要手术清除血肿，并结扎股动脉及进行输血治疗9,13。</li>
	<li>将针头从注射器上取下，以防溶血。然后沿1.5 mL微量离心管内壁缓慢排出采集的血液。 
	注意：采集的血液可在4 oC保存最多24小时，之后进行血浆分离以测定P4/E2水平。</li>
</ol>
2. 血浆分离及激素水平测定
<ol>
	<li>将血液在1.5 mL离心管中于4 oC条件下以1,100 × g离心5分钟。</li>
	<li>小心吸取分离出的血浆（上清液）至新的离心管或样品杯中，避免混入血细胞（沉淀物）。</li>
	<li>使用ELISA试剂盒或全自动分析仪测定P4和E2水平。若血浆量不足以进行全自动分析仪检测，可使用样本稀释液进行稀释。 
	注意：使用全自动分析仪检测时，仅测定P4水平需血浆量&#62;175 µL，同时测定P4和E2水平则需血浆量&#62;250 µL。</li>
</ol>
3. 使用尿液绒毛膜促性腺激素检测来判断排卵和妊娠
注意：狨猴的绒毛膜促性腺激素（CG）水平可使用免疫层析试剂盒检测，用于判断排卵和妊娠。在排卵情况下，可在排卵前0-2天获得阳性结果；在妊娠情况下，可在妊娠第15-20天至约第100天期间检测到阳性结果。该检测仅需少量尿液（90 µL）（一滴尿液约30 µL）。
<ol>
	<li>托盘法：若同一笼内饲养超过两只动物，应在前一天将目标狨猴（或其他动物）转移至另一笼中。在前一晚或开灯前将干净的托盘放置于笼底。由于夜间膀胱内的尿液不会排出，因此通常在开灯后不久即可从膀胱排尿。 
	注意：早晨开灯前进入房间可能会干扰群体的睡眠周期。通常在开灯后约30分钟内可完成尿液采集。</li>
	<li>挤压法：准备好已清洗的托盘用于尿液收集。找到狨猴的膀胱后，用手指全长从前方及两侧小心地轻轻挤压（图1F）。在早晨开灯前立即收集尿液。 
	注意：若因膀胱无尿导致采集失败，可等待一段时间后再尝试。注意不可用力过大，以免损伤动物。</li>
	<li>采集后立即取尿液样本加入免疫层析检测试剂盒的加样孔中。依据生产商说明书，在10分钟后读取结果。</li>
</ol>
4. 卵母细胞、受精卵和胚胎采集过程中卵巢周期阶段的控制与确定
<ol>
	<li>从卵巢中收集生发泡（GV）卵母细胞
	<ol>
		<li>在黄体期末期（即黄体期开始后 ≥10 天），向肌肉注射 3 µL 浓度为 0.263 mg/mL 的氯前列醇（一种合成的 PGF2α 类似物），用 150 µL 生理盐水稀释后注射14（图 2），以重置卵巢周期。 
		注意：配制较大体积的稀释液可能更为方便，因为稀释后的氯前列醇在 +4 °C 下至少可稳定保存数周。</li>
		<li>次日（第 1 天），通过检测孕酮（P4）水平是否下降来确认卵泡期的开始。 
		注意：已有文献报道，注射氯前列醇可在 24 小时内显著降低 P4 水平（通常 &#60;10 ng/mL）3。</li>
		<li>从第 1 天起，每隔 2 天注射一次 FSH（25 IU，肌肉注射），共注射 5 次（第 1、3、5、7 和 9 天）。第 10 天下午注射 hCG（75 IU，肌肉注射）。</li>
		<li>第 11 天，在麻醉条件下通过卵泡穿刺法从卵巢中收集 GV 卵母细胞，操作参照文献方法15,16。 
		注意：有时排卵会早于预期发生。因此建议从第 8 天起检测绒毛膜促性腺激素（CG）水平。若 CG 检测呈阳性，应在当天进行 GV 卵母细胞的收集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中期 II（MII）卵母细胞、受精卵及早期胚胎的收集
	<ol>
		<li>按照步骤 4.1.1 所述方法，使用氯前列醇重置卵巢周期。</li>
		<li>次日（第 1 天），通过检测 P4 水平是否下降来确认卵泡期的开始。</li>
		<li>若需收集受精卵和胚胎，从第 6 天起将雌性狨猴与雄性狨猴同笼饲养以进行交配。</li>
		<li>从第 7 天起，检测雌性狨猴的血液中 P4/E2 水平及尿液中 CG 水平。CG 的检出提示将在数日内（通常为次日）发生排卵。当 P4 水平较前一日升高、E2 水平较前一日降低时，从输卵管中收集 MII 卵母细胞或胚胎第 0 天（E0）的受精卵17,18。</li>
		<li>对于胚胎收集，根据目标发育阶段，在适当时间点按照文献所述方法进行冲洗，可从输卵管中回收 E1–E3 阶段（1–8 细胞期）胚胎17,18，或从子宫中回收 E5–E10 阶段（8 细胞期至囊胚期）胚胎19,20,21,22。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Assessing Ovarian Cycle in Marmosets by Blood Collection and Hormone Analysis

<ol><li>Kholkute, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+progesterone+levels+throughout+the+ovarian+cycle+of+the+common+marmoset+%28Callithrix+jacchus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Primates%22%5BJournal%5D)">Plasma progesterone levels throughout the ovarian cycle of the common marmoset (Callithrix jacchus).</a> Primates. 25 (1), 123-126 (1984).</li>
<li>Harding, R. D., Hulme, M. J., Lunn, S. F., Henderson, C., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+progesterone+levels+throughout+the+ovarian+cycle+of+the+common+marmoset+%28Callithrix+jacchus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Primatol%22%5BJournal%5D)">Plasma progesterone levels throughout the ovarian cycle of the common marmoset (Callithrix jacchus).</a> J Med Primatol. 11 (1), 43-51 (1982).</li>
<li>Gilchrist, R. B., Wicherek, M., Heistermann, M., Nayudu, P. L., Hodges, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+follicle-stimulating+hormone+and+follicle+populations+during+the+ovarian+cycle+of+the+common+marmoset%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Changes in follicle-stimulating hormone and follicle populations during the ovarian cycle of the common marmoset.</a> Biol Reprod. 64 (1), 127-135 (2001).</li>
<li>Gromoll, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+subclass+of+the+luteinizing+hormone%2Fchorionic+gonadotropin+receptor+lacking+exon+10+messenger+RNA+in+the+New+World+monkey+%28Platyrrhini%29+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">A new subclass of the luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor lacking exon 10 messenger RNA in the New World monkey (Platyrrhini) lineage.</a> Biol Reprod. 69 (1), 75-80 (2003).</li>
<li>Müller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chorionic+gonadotrophin+beta+subunit+mRNA+but+not+luteinising+hormone+beta+subunit+mRNA+is+expressed+in+the+pituitary+of+the+common+marmoset+%28Callithrix+jacchus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Chorionic gonadotrophin beta subunit mRNA but not luteinising hormone beta subunit mRNA is expressed in the pituitary of the common marmoset (Callithrix jacchus).</a> J Mol Endocrinol. 32 (1), 115-128 (2004).</li>
<li>Pacchiarotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+stimulation+protocol+in+IVF%3A+an+up-to-date+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ovarian stimulation protocol in IVF: an up-to-date review of the literature.</a> Curr Pharm Biotechnol. 17 (4), 303-315 (2016).</li>
<li>Ezcurra, D., Humaidan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+luteinising+hormone+and+human+chorionic+gonadotropin+when+used+in+assisted+reproductive+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">A review of luteinising hormone and human chorionic gonadotropin when used in assisted reproductive technology.</a> Reprod Biol Endocrinol. 12, 95(2014).</li>
<li>Lopez-Gatius, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+response+to+prostaglandin+F%282alpha%29+in+lactating+dairy+cows%3A+A+clinical+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Ovarian response to prostaglandin F(2alpha) in lactating dairy cows: A clinical update.</a> J Reprod Dev. 68 (2), 104-109 (2022).</li>
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<li>Schultz-Darken, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+collection+and+restraint+techniques+used+for+common+marmosets+%28Callithrix+jacchus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Sample collection and restraint techniques used for common marmosets (Callithrix jacchus).</a> Comp Med. 53 (4), 360-363 (2003).</li>
<li>Hopper, J. Common marmosets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHopper%2C+J+%22Handbook+of+Exotic+Pet%22">Handbook of Exotic Pet</a>. Kubik, M. , 27-42 (2020).</li>
<li>Harlow, C. R., Hearn, J. P., Hodges, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovulation+in+the+marmoset+monkey%3A+endocrinology%2C+prediction+and+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Ovulation in the marmoset monkey: endocrinology, prediction and detection.</a> J Endocrinol. 103 (1), 17-24 (1984).</li>
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<li>Summers, P. M., Wennink, C. J., Hodges, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloprostenol-induced+luteolysis+in+the+marmoset+monkey+%28Callithrix+jacchus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cloprostenol-induced luteolysis in the marmoset monkey (Callithrix jacchus).</a> J Reprod Fertil. 73 (1), 133-138 (1985).</li>
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<li>Summers, P. M., Shephard, A. M., Taylor, C. T., Hearn, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cryopreservation+and+transfer+on+embryonic+development+in+the+common+marmoset+monkey%2C+Callithrix+jacchus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">The effects of cryopreservation and transfer on embryonic development in the common marmoset monkey, Callithrix jacchus.</a> J Reprod Fertil. 79 (1), 241-250 (1987).</li>
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<li>Barrett, J., Abbott, D. H., George, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+cues+and+the+suppression+of+reproduction+in+subordinate+female+marmoset+monkeys%2C+Callithrix+jacchus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Sensory cues and the suppression of reproduction in subordinate female marmoset monkeys, Callithrix jacchus.</a> J Reprod Fertil. 97 (1), 301-310 (1993).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

寻找静脉是采血过程中最关键的一步。根据解剖学观察，本方案推荐将股三角区近端区域作为狨猴采血的便捷部位。利用该区域可方便地从较大静脉中进行采血。然而，即使采用本方案，仍有可能误伤动脉。一旦发生动脉损伤，建议持续压迫止血超过&#62;5分钟，以防止血肿形成。此外，在压迫的同时，使用冰块冷敷穿刺部位也具有辅助效果。血肿可使用肝素（例如：Tensolvet 5.000 I.E. 凝胶）进行治疗。大多数血肿在接受连续3至4天的肝素治疗并口服0.05 mL美洛昔康（0.5 mg/mL，p.o.）后可自行消退。在大腿近端区域，动脉位于静脉的外侧。而在远端区域，静脉与动脉之间的距离更近，重叠程度更大，且动脉位于静脉的腹侧。根据这种位置关系，从大腿近端区域采血发生动脉损伤的风险可能更低。
此外，近端区域的股静脉较粗且位置表浅，便于使用针头进行定位。然而，从远端区域采血的优势在于可以保留近端部位的完整性，即使采血过程中静脉受损，仍可立即在同一肢体的近端部位进行重复穿刺。这是因为受损部位远端的静脉通常无法立即再次穿刺。但如果采血失败，可从另一条腿的近端部位进行重复采样。
狨猴的循环血量约为 25 mL（70 mL/kg）23。一只 350 g 的狨猴在采集 2 mL 血液后需要 1 周时间恢复，该采血量相当于总血容量的 7.5%6。从股静脉采集 500–700 µL 血液可轻松完成。当需要多次采血时，建议采集较少的血量，并使用稀释缓冲液用于自动分析仪。
尽管采血通常不使用麻醉，但对于初学者而言，对麻醉状态下的动物进行采血可能比对清醒动物采血更容易。然而，在采血过程中使用麻醉需谨慎，因为麻醉可能影响血液成分的测定值。在通过激素水平测定卵巢周期阶段的相关研究中，有报道称使用阿法沙龙（alfaxalone）会导致孕酮（P4）检测值异常升高24，这是由于抗P4抗体与阿法沙龙（一种P4衍生物）之间发生了交叉反应所致。
孕酮（P4）和雌二醇（E2）（类固醇激素）在人类和狨猴之间的结构完全相同。因此，可用于人类P4和E2的商用ELISA试剂盒也适用于狨猴的P4和E2检测。人类血液激素检测的外包服务同样可用于狨猴样本。相比之下，促卵泡激素（FSH）、绒毛膜促性腺激素（CG）和抑制素等多肽类激素的氨基酸序列在物种间存在微小差异。对于这些多肽类激素，如果某种试剂盒可同时用于人类以及进化距离较远的物种（如小鼠），则该试剂盒通常也可用于狨猴。在抑制素B的检测中，可使用人/小鼠/大鼠抑制素B（βB亚基）酶联免疫测定试剂盒。
P4 水平升高是排卵（从卵泡期向黄体期转变）的典型特征。尽管个体间存在差异，单独依靠 P4 水平难以精确确定排卵日期，但 P4 水平 &#62;8 ng/mL 可作为排卵发生的粗略指标。更可靠的排卵日期指标是 E2 水平的下降3,17。在 E2 水平下降当天，确实在输卵管中观察到了已排卵的卵母细胞/受精卵（表4）。因此，通过检测 E2 水平可精确定位排卵的确切日期。除了激素水平外，给予 PGF2α 后的天数也可用于预测排卵日（表4）。同样，联合使用 P4 和 E2 水平有助于判断进入卵泡期的时间点，此时 P4 水平显著下降，E2 水平处于最低值。
在狨猴中，由垂体腺释放的是CG而非LH，以诱导排卵。此外，当胚胎附着并植入子宫内膜时，滋养层细胞也会分泌CG。由于狨猴缺乏有功能的LH基因，因此由垂体腺释放CG而非LH来刺激排卵5。一项研究报道，表明排卵发生的E2和CG峰值出现在同一天12。另一项研究报道，平均而言，E2峰值（PGF2α给药后8.6天）早于CG峰值（PGF2α给药后9.3天）25，提示排卵可能在达到CG峰值之前即已发生。与E2不同，CG在接近其峰值时呈脉冲式释放。CG的脉冲式释放平均开始于其峰值前约1天。然而，从首次检测到CG水平上升至E2水平下降之间的时间跨度存在较大变异（图3A和表4）。此外，有研究报道CG在早晨和下午的样本中均可首次检测到25。
据我们所知，目前尚无关于狨猴在一天中特定时间发生排卵的报道。此外，狨猴通常会一次性释放两到三个卵母细胞，因此所有卵母细胞的释放可能持续一定时间。由于绒毛膜促性腺激素（CG）水平在排卵前升高，检测CG可提前预测排卵日期。这一信息对于在排卵当天收集MII期卵母细胞或0天胚胎尤为有用。因此，联合检测血液中孕酮（P4）/雌二醇（E2）水平与CG水平具有重要意义（图3B）。在包括人类在内的大多数灵长类动物中，分娩后一段时间内不会发生排卵。然而，狨猴通常在分娩后约10天即出现产后排卵。因此，下一次分娩通常发生在前一次分娩后约155天左右。这种连续妊娠现象，加上每胎产下双胞胎的特点，使得狨猴具有较高的繁殖力。
激素水平波动因个体而异，有些个体并不具有稳定的周期。一些雌性狨猴表现出持续低水平的P4/E2，这表明其未发生排卵。无排卵周期可能由不成熟、健康问题、应激或优势繁殖雌性对排卵的抑制所致26,27。在作者所在机构中，21只狨猴（&#62;2岁）中有3只在检测激素水平时显示缺乏规律的排卵周期。了解其成因并开发相应的治疗方法，将有助于更有效地在实验中利用动物。曾观察到部分个体黄体期延长至约1个月，并伴随高水平P42。在作者所在机构中，相同个体可反复出现黄体期延长现象。21只狨猴中有2只表现出此种异常。其中一只为单笼饲养，可排除其在黄体期延长期间怀孕的可能性；另一只与经辐射处理的 presumed infertile 雄性配对，因此在黄体期延长期间也不太可能怀孕。即使处于黄体期延长状态，给予PGF2α仍可降低P4水平，并重置卵巢周期。检测性激素水平并了解排卵周期状态，有助于在实验和繁殖中更有效地利用动物。
采集个体血液不仅用于估算排卵日期，也用于血清学检测以辅助诊断。同样，激素水平的测定不仅用于估计排卵日，还用于研究社会互动、儿童发育及疾病。未来，在制备基因编辑的狨猴过程中，有望通过诱导多能干细胞（iPS细胞）发育为卵巢和睾丸。适当的激素水平对于正常发育至关重要。本文所述方案将有助于在狨猴中实现由iPS细胞衍生性腺过程中性激素的测定与调控。

普通狨猴（Callithrix jacchus）是一种小型新世界猴，具有许多与人类相似的特征，其卵巢周期持续26–30天1,2。关于早期发育及基因修饰狨猴生成的研究，需要在卵巢周期的特定阶段采集卵母细胞和受精卵。因此，准确判断周期阶段至关重要，可通过检测血液中孕酮（P4）和雌二醇（E2）的激素水平进行估算2,3。这些激素促进子宫内膜生长，而子宫内膜生长是胚胎着床所必需的。P4由黄体产生，黄体在排卵后立即于卵巢中形成。E2则由卵巢卵泡在脑部下丘脑-垂体复合体分泌的促卵泡激素（FSH）刺激下分泌。随着卵泡成熟，E2水平逐渐升高，并在排卵前达到峰值3。在人类中，高水平的E2通过下丘脑-垂体复合体引发黄体生成素（LH）的脉冲式释放；这种LH激增会诱导排卵。然而，在狨猴中，LH基因在进化过程中发生了退化，排卵转而由垂体分泌的绒毛膜促性腺激素（CG）诱导，CG的结构与LH相似4,5。
卵巢周期可通过激素注射进行控制。在人类中，促卵泡激素（FSH）注射作用于卵巢上的FSH受体，用于促进雌激素合成和卵泡生长6。在卵泡期末期，以人绒毛膜促性腺激素（hCG）替代黄体生成素（LH）进行注射，可刺激人类排卵7。由于hCG可在妊娠早期刺激黄体，增加孕酮（P4）的产生，因此hCG注射也用于治疗人类不孕症。前列腺素F2α（PGF2α）注射可重置卵巢周期8。在家牛中，PGF2α注射被用于缩短黄体期，并同步发情周期，以利于繁殖管理。
尽管狨猴与人类具有相似的生物学机制，使其成为理想的模式动物，但目前仍缺乏描述许多常用技术基本方法的文献。采血是最常用的技术之一9,10,11,12。然而，初学者有时难以找到静脉。因此，本研究对股静脉区域进行了解剖学分析。基于解剖学观察，本方案将股三角近端区域作为易于进行静脉穿刺的部位予以介绍。

<table><tbody><tr><td>AIA-360</td><td>Tosoh Corporation</td><td>0019945</td><td>激素测定（P4/E2）</td></tr><tr><td>AIA-PACK DILUENT CONCENTRATE</td><td>Tosoh Corporation</td><td>0020956</td><td>激素测定（P4/E2）</td></tr><tr><td>AIA-PACK SUBSTRATE SET II</td><td>Tosoh Corporation</td><td>0020968</td><td>激素测定（P4/E2）</td></tr><tr><td>AIA-PACK WASH CONCENTRATE</td><td>Tosoh Corporation</td><td>0020955</td><td>激素测定（P4/E2）</td></tr><tr><td>CMS-1</td><td>CLEA Japan</td><td></td><td>狨猴饲料</td></tr><tr><td>Estrumate</td><td>MSD Animal Health</td><td></td><td>PGF2alpha类似物（氯前列醇）</td></tr><tr><td>Gonal-f 皮下注射液 150</td><td>Merck Biopharma Co., Ltd.</td><td></td><td>FSH</td></tr><tr><td>促性腺激素肌肉注射液 1000</td><td>ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>872413</td><td>hCG</td></tr><tr><td>肝素钠注射液 5,000 单位/5 mL</td><td>Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>224122458</td><td>采血</td></tr><tr><td>普通狨猴绒毛膜促性腺激素免疫层析检测试剂盒（Dual Checker）</td><td>CLEA Japan, Inc.</td><td></td><td>测定CG水平</td></tr><tr><td>低轮廓双臂显微镜照明灯 LPF-SD</td><td>SHIOKAZE GIKEN</td><td></td><td>采血用台灯</td></tr><tr><td>狨猴采血固定装置</td><td>JIC Japan</td><td>JM-1006</td><td>采血&lt;br/&gt; http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html&lt;br/&gt; email: vi@jic-japan.jp</td></tr><tr><td>Metacam 0.05%</td><td>Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.</td><td></td><td>血肿治疗</td></tr><tr><td>样品杯，3 mL，聚苯乙烯，适用于Tosoh 360和AIA-600 II，每袋1000个</td><td>Globe Scientific</td><td>110913</td><td>激素测定（P4/E2）</td></tr><tr><td>ST AIA-PACK iE2</td><td>Tosoh Corporation</td><td>0025224</td><td>激素测定（P4/E2）</td></tr><tr><td>ST AIA-PACK iE2 校准品套装</td><td>Tosoh Corporation</td><td>0025324</td><td>激素测定（P4/E2）</td></tr><tr><td>ST AIA-PACK iE2 样品稀释液</td><td>Tosoh Corporation</td><td>0025524</td><td>激素测定（P4/E2）</td></tr><tr><td>ST AIA-PACK PROGIII</td><td>Tosoh Corporation</td><td>0025240</td><td>激素测定（P4/E2）</td></tr><tr><td>ST AIA-PACK PROGIII 校准品套装</td><td>Tosoh Corporation</td><td>0025340</td><td>激素测定（P4/E2）</td></tr><tr><td>ST AIA-PACK PROGIII 样品稀释液</td><td>Tosoh Corporation</td><td>&amp;nbsp;0025540</td><td>激素测定（P4/E2）</td></tr><tr><td>带25 G（0.50 × 25 mm）针头的注射器</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T2525</td><td>采血</td></tr><tr><td>Tensolvet 5.000 I.E. 凝胶</td><td>Dechra Pharmaceuticals</td><td>14033492</td><td>血肿治疗</td></tr><tr><td>TOSOH 多控校准品套装</td><td>Tosoh Corporation</td><td>0015965</td><td>激素测定（P4/E2）</td></tr></tbody></table>

狨猴卵巢周期阶段判定中的采血与激素测定

Blood Sampling and Hormone Measurement for Determining the Stage in the Ovarian Cycle in Marmosets

普通狨猴是一种小型新世界猴。由于其许多生物学机制与人类相似，狨猴在神经科学、再生医学和发育等多个领域的医学与人类生物学研究中具有潜在的应用价值。然而，目前尚缺乏系统描述许多基础实验和操作方法的文献。本文详细介绍了测定狨猴体内性激素（孕酮、雌二醇和绒毛膜促性腺激素）水平的方法。这些激素水平的测定有助于预测卵巢周期所处的阶段，狨猴的卵巢周期通常为26至30天；准确判断周期阶段对于在正确的时间点采集卵母细胞/受精卵，以及为制备宿主雌性个体以培育基因修饰狨猴至关重要。
此外，性激素水平的测定对于内分泌学、动物行为学、早期发育以及生殖生物学研究具有重要意义。本方案详细描述了从股静脉采血、分离血浆用于激素测定、利用尿液和血浆检测绒毛膜促性腺激素水平、通过注射前列腺素F2α类似物重置卵巢周期以缩短并同步周期，以及通过注射促卵泡激素和绒毛膜促性腺激素促进卵泡生长和排卵的方法。采用这些方案，可准确判断卵巢周期的各个阶段，从而及时采集卵母细胞或受精卵。

本研究中所用动物的相关信息列于表1中。
股静脉的解剖学分析 
使用一只实施安乐死的2岁雄性普通狨猴（I 7713M）进行股静脉的解剖学分析。股静脉和股动脉位于股三角区域内。股三角位于腹壁与大腿肌肉之间的交界处（图1B-D）。在大腿根部，一条粗大的静脉穿过倒置三角形的中央，动脉则与之平行走行于静脉的外侧。在远端区域，静脉和动脉逐渐变细并相互重叠，动脉位于静脉的上方（图1D）。
进行采血时，应以静脉为靶点，因为动脉损伤可能导致股动脉血肿，当出血严重时，可引发心血管休克13。尽管可以从股三角区及其远端静脉的任何部位抽取血液，但建议从股三角近端位置进行静脉穿刺，因为该处静脉较粗大，且与动脉的重叠程度较小。此外，近端部位的静脉位置表浅，便于用针头定位。由于股三角内的动脉具有搏动性，有时可通过视觉观察或触诊识别，而静脉则走行于其内侧。因此，观察动脉搏动有助于预测静脉的位置。
此外，在三角区域顶部的皮肤下通常可观察到提示静脉走向的蓝色条纹（图1B、C）。然而，该区域的淋巴结常靠近静脉，且呈深蓝色，外观与静脉相似。幸运的是，可通过其活动性加以区分：静脉位置固定，而淋巴结可移动。因此，动脉的搏动和静脉的蓝色外观是定位静脉的两个主要线索，但在某些情况下可能需要剃除毛发以清晰观察。
卵巢周期阶段的确定 
通过监测六只雌性狨猴（年龄范围为1至3岁）的P4和E2水平，研究卵泡期和黄体期的持续时间。结果显示，卵泡期平均持续时间为11.58天（n = 6，来自四只狨猴），黄体期平均持续时间为16.8天（n = 5，来自三只狨猴）（表2）。以下详细描述其中一只狨猴（I6751F，3岁）的P4和E2动态变化。对该动物在38天内每隔数天进行一次采血及激素水平测定（表3）。
黄体期（第1-10天） 
将测量开始的当天设为第1天。根据孕酮（P4）水平（21 ng/mL），该动物很可能处于黄体期。在第1至第10天期间观察到较高的P4水平（≥21 ng/mL），提示处于黄体期。在第12天，P4水平急剧下降至4 ng/mL，这一显著降低表明已从黄体期过渡至卵泡期。此外，雌二醇（E2）水平从第10天（241 ng/mL）下降至第12天（189 ng/mL）也支持这一转变。
卵泡期（第12–22天） 
进入卵泡期后，孕酮（P4）水平保持较低水平（4–6 ng/mL），直至第19天，随后从第19天至第24天略有上升（第19天为6 ng/mL；第22天为8 ng/mL；第24天为9 ng/mL）。相比之下，雌二醇（E2）水平从第19天（94 ng/mL）显著上升至第22天（322 ng/mL），随后从第22天到第24天下降至158 ng/mL。根据P4水平升高和E2水平下降的趋势，推测排卵发生在第22至24天之间，即从卵泡期过渡到黄体期。
黄体期（第24-36天） 
排卵后，孕酮（P4）水平在第36天之前保持较高水平，随后在第38天下降至3 ng/mL。因此，黄体期向卵泡期的转变很可能发生在第36至38天之间。与此转变一致的是，雌二醇（E2）水平在此期间下降（第36天为2517 ng/mL，第38天为73 ng/mL）。
排卵时间的预测与确定
为了研究尿液绒毛膜促性腺激素（CG）水平与排卵日期之间的关系，准备了七只狨猴（编号1-7）。注射氯前列醇以重置排卵周期（第0天），随后从第7天开始监测血液中孕酮（P4）/雌二醇（E2）水平及尿液中CG水平。尿液在光照后立即收集。血液样本的采集通常在早晨进行。根据已有报道17，当E2水平较前一日显著下降时，认为已发生排卵。在该日，确实在卵巢表面观察到卵泡破裂，并在输卵管中发现受精卵/卵母细胞（表4）。
CG 首次检出时间为第 7 至 11 天（第 7 天，N = 1；第 8 天，N = 2；第 9 天，N = 1；第 10 天，N = 2；第 11 天，N = 1）（表 4）。E2 水平显著下降（提示排卵）出现在首次检出 CG 后 0–3 天内。从首次检出 CG 至 E2 下降的持续时间似乎与首次检出 CG 的时间有关，即首次检出 CG 越早，该持续时间越长（图 3A）。例如，一只动物（编号 1）在第 7 天首次检出 CG 后，于 3 天后出现 E2 信号下降（表 4）。相比之下，另一只动物（编号 2）在第 10 天首次检出 CG 的同时即出现 E2 信号下降。因此，尽管在五只动物中有一只的首次 CG 检出与排卵发生在同一天，但总体而言，排卵发生在首次检出 CG 后的数天内。
用于绒毛膜促性腺激素（CG）检测的狨猴免疫层析试纸条设计为使用尿液进行测试。通常，CG水平的检测需伴随使用血浆测定孕酮（P4）和雌二醇（E2）的水平。若CG检测能够使用血浆而非尿液，将更为便利。为验证这一点，本研究利用上述实验中测定P4/E2水平后剩余的血浆样本进行了检测。血浆和尿液样本均采集自上述实验中四只动物的任一实验日（实验日期在表4中以双星号[**]标示）。使用尿液检测时，四只动物中有两只呈阳性结果（评分分别为5和3），另外两只呈阴性结果（评分为1）。使用血浆检测的结果与尿液检测基本一致（图3B）。然而，血浆检测获得的信号更强。因此，当使用血浆进行检测时，判读时间应早于尿液检测所设定的10分钟。
<img alt="显示动物受试者静脉识别和血液采集的采血过程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66691/66691fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：狨猴的血液采集。（A）使用固定器进行血液采集。（B）狨猴的上大腿区域。（C）股三角区及血管结构。股三角内的股动脉通常可见并显示搏动。股静脉的蓝色有时可在三角区近端区域观察到（标示为采血部位）。淋巴结也呈现蓝色，但淋巴结可移动，因其附着于皮肤。（D）安乐死动物大腿的解剖视图。图中标示了动脉、静脉及采血部位。图 B-D 展示的是同一只动物。（E）使用固定器进行血液采集。展示了狨猴腿部的固定姿势及正在抽血的过程。（F）狨猴的尿液采集。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66691/66691fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="激素波动图：月经周期各阶段中黄体酮和雌二醇水平，排卵事件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66691/66691fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：绒猴卵巢周期中 P4、E2 和 CG 水平的典型变化模式。 图中显示了 FSH、hCG 和 PGF2α 注射的时间点。虚线表示注射 PGF2α 后预期的激素变化模式。缩写：P4 = progesterone；E2 = estradiol；CG = chorionic gonadotropin；FSH = follicle-stimulating hormone；hCG = human chorionic gonadotropin；PGF2α = prostaglandin F2α。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66691/66691fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示CG检测与天数关系的图表；对照和尿液/血液CG分析的试纸结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66691/66691fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：通过测定CG水平预测排卵的发生。（A）首次检测到CG（评分 &gt; 1）的日期与排卵前持续时间（E2下降）之间的可能关系。（B）血液血浆可用于免疫层析CG检测。各评分的代表性结果如上图所示。评分在加样后10分钟确定。评分2表示在5分钟内无条带出现，但在10分钟内出现条带。血液采集在尿液采集后立即进行。共检测了四只狨猴（见表S4中的编号1、2、3、5）。本实验所用样本在表4中以双星号标出。血浆使用E2测定所用的稀释缓冲液稀释至50%。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66691/66691fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：本研究中使用的动物。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66691/66691_Table%201v2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：卵泡期和黄体期的持续时间。 期相根据P4水平确定（卵泡期P4 ≤ 8，黄体期P4 > 8）。当在两次测量之间观察到期相变化时，以两次测量日期的中点作为相变时间点。两个相变时间点之间的持续时间被视为卵泡期或黄体期。为确保单一期相持续时间的测量准确性，若同一期相内存在较长（≥7天）的间隔，或存在两次及以上≥6天的间隔（包括跨期相的情况），则该数据不用于分析。仅当同一期相内进行了两次测量时，数据才被采用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66691/66691_240320_Table2_rev.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：一只绒猴38天内P4和E2浓度的检测结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66691/66691_240320_Table3_rev.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4：排卵日的确定与预测。 如果在卵巢中观察到出血部位或破裂部位，则认为存在排卵痕迹。卵母细胞/受精卵指在雌二醇（E2）水平下降当天从输卵管中获取的卵母细胞/受精卵所处的发育阶段。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66691/66691_Table%204_revv2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本方案描述了采集血液和尿液样本以测定孕酮/雌二醇和绒毛膜促性腺激素水平，从而确定卵巢周期阶段的方法。通过激素水平可预测并确定排卵时间，并可通过注射激素来调节卵巢周期和卵母细胞的生长。

普通狨猴是一种小型新世界猴。由于其许多生物学机制与人类相似，狨猴在研究中具有潜在的重要用途……

我们正在研究两个主要方面。首先，我们旨在深入了解包括人类在内的灵长类动物的雄性生殖细胞。我们的研究重点是精原干细胞以及DNA甲基化的建立。其次，我们的目标是开发新的技术以制备基因编辑的狨猴。制备基因编辑狨猴需要大量工作，其中一项挑战是建立更高效的方法来制备基因编辑狨猴。我们的采血方案有助于更轻松地找到静脉，并降低从动脉抽血的风险。此外，该方案还可测量三种激素，从而更准确地预测和确定排卵日期。目前，我们正在开发一种利用iPS细胞在绒猴中生成精子的技术。该技术将有助于生殖细胞的研究以及转基因狨猴的制备。

blood-sampling-hormone-measurement-for-determining-stage-ovarian

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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