Name: 缺氧敏感的嵌合抗原受体-T 细胞的生成和功能验证 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 了解利用慢病毒技术生成缺氧敏感型嵌合抗原受体T细胞的方法，验证其在缺氧肿瘤微环境中的选择性杀伤功能。该方案有助于提升CAR-T细胞治疗实体瘤的安全性与疗效。

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本工作获得了中国国家重点研发计划（2016YFC1303402）、国家重大传染病防治科技专项（2017ZX10202102，2017ZX10304402-002-007）以及上海市卫生健康委员会一般项目（201740194）的资助。

本研究中，针对HER2（基因ID：2064）的缺氧敏感型CAR HER2-BBz-ODD与其常规版本HER2-BBz进行了比较。图1A展示了两种CAR的结构示意图，显示HER2-BBz-ODD是在HER2-BBz的基础上，于CD3ξ的C末端添加ODD序列而获得。表达这两种CAR的慢病毒载体的构建以及通过293T细胞转染产生相应慢病毒的方法此前已有描述31。
1. 通过慢病毒感染生成缺氧敏感型CAR-T细胞
<ol>
	<li>在37 °C水浴中快速解冻冻存的人外周血单个核细胞（PBMCs）。将解冻后的PBMCs转移至含有9 mL无血清淋巴细胞培养基的15 mL离心管中，该培养基中添加了400 IU IL-2、5&#160;ng/mL IL-7和10 ng/mL IL-15（人T细胞生长培养基，后文简称TGM）。</li>
	<li>取部分细胞用于计数后，将离心管在300 × g条件下离心5分钟。用TGM重悬沉淀的PBMCs，调整细胞密度为4 × 106 个细胞/mL，并将细胞悬液转移至6孔板中。</li>
	<li>制备抗-hCD3/hCD28包被的免疫磁珠。
	<ol>
		<li>将100 µL小鼠IgG磁珠转移至1.5 mL微量离心管中，使用磁力架以PBS洗涤2次&#160;。</li>
		<li>用100 µL PBS重悬磁珠，加入0.2 µg小鼠抗人CD3抗体和2 µg小鼠抗人CD28抗体。用移液器轻轻混匀，于4 °C轻轻摇动孵育过夜。</li>
		<li>使用磁力架以PBS洗涤磁珠2次&#160;，然后用100 µL PBS重悬磁珠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤1.2中的6孔板加入抗-hCD3/hCD28包被的免疫磁珠，磁珠与细胞的比例为1:1。将培养板置于37 °C、含5% CO2的湿润化培养箱中。</li>
	<li>孵育48小时后，用移液器轻轻混匀细胞，将细胞悬液转移至15 mL离心管中。将离心管置于磁力架上3分钟，然后小心地将上清液转移至新的15 mL离心管中，以去除PBMCs中的免疫磁珠。</li>
	<li>取部分细胞用于计数，然后将PBMCs以每孔5 × 105 个细胞的密度接种于48孔平底板中，每孔加入300 µL TGM。向相应孔中加入200 µL慢病毒原液，并加入硫酸鱼精蛋白至终浓度为10 µg/mL。</li>
	<li>将培养板在32 °C、1,000 × g条件下离心1.5小时，然后用移液器小心吸除并弃去每孔300 µL上清液。随后用移液器每孔加入1 mL新鲜TGM，将培养板置于37 °C、含5% CO2的湿润化培养箱中。</li>
	<li>每2–3天添加新鲜TGM，将细胞密度调整至0.5–2 × 106 个细胞/mL。首先将细胞转移至12孔板，再转移至6孔板。继续培养细胞，直至总体积为4 mL时细胞总数达到6 × 106。 
	注意：同时，按照上述相同步骤对Jurkat T细胞进行CAR转导，唯一区别是将TGM替换为含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基。</li>
</ol>
2. 使用流式细胞术评估 CAR-T 细胞中氧依赖性 CAR 表达
<ol>
	<li>将步骤 1.8 中转导了 CAR 的 T 细胞以每孔 2.5 × 106 个细胞的密度接种至两个 12 孔板中，每孔加入 2 mL TGM 培养基。将其中一个培养板直接放入 37 °C、含 5% CO2 的湿润化培养箱中（常氧条件，标准细胞培养条件为 21% O2）；将另一个培养板放入可移动的 CO2/O2/N2 混合气体培养箱室中，设定 O2 浓度为 1%（低氧条件），然后将该培养箱室置于 37 °C、5% CO2/94% N2 的湿润化培养箱中孵育。</li>
	<li>每隔 24 小时，从低氧或常氧条件下的培养板中收集 5 × 105 个细胞至 1.5 mL 微量离心管中。在 500 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，用移液器将细胞轻柔重悬于 1 mL PBS 中。再重复 PBS 洗涤一次。</li>
	<li>将离心后的细胞沉淀重悬于每管 50 µL FACS 缓冲液（含 2% FBS 的 PBS）中。向每管加入 50 µL 以 1:100 稀释的 PE 标记抗 Flag 抗体（终浓度为 0.2 µg/mL），并通过移液充分混匀。室温避光孵育 20 分钟。</li>
	<li>孵育结束后，向每管加入 1 mL FACS 缓冲液，通过移液充分混匀，然后在 500 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>用移液器小心吸除并弃去上清液，并重复步骤 2.4 一次。</li>
	<li>用移液器小心吸除并弃去上清液。将细胞重悬于 200 µL FACS 缓冲液中，然后将所得细胞悬液转移至 5 mL 流式管中。</li>
	<li>对步骤 2.6 中的细胞悬液进行流式细胞术检测，以确定 CAR 在细胞表面的表达水平。以未转导的 T 细胞作为阴性对照。
	<ol>
		<li>使用 FSC/SSC 和 FSC-A/FSC-H 门控筛选活的单细胞。每个样本采集 1 × 104 个活单细胞事件。首先圈选 EGFP 阳性细胞（慢病毒载体携带的组成型标记，用于指示成功转导的 T 细胞），然后圈选藻红蛋白（PE）阳性细胞（即 CAR 表达细胞），以测定 PE 阳性率及中位荧光强度（MFI）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过蛋白质印迹法分析缺氧条件下CAR修饰的Jurkat T细胞中CAR的表达依赖性
<ol>
	<li>将第1部分中经CAR转导的Jurkat T细胞以每孔5 × 105个细胞的密度（500 µL培养体积）接种于两块48孔板中，使用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基。</li>
	<li>对于其中一块板，在实验孔中加入CoCl2，使其终浓度分别为0 µM、50 µM或200 µM，随后将该板置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中（常氧条件）。对于另一块板，不添加CoCl2，并在转移至同一培养箱前，将其放入一个可移动的CO2/O2/N2培养箱腔室中，预设O2浓度为1%（低氧条件）。</li>
	<li>培养24小时后，将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。在500 × g条件下离心5分钟。先用1 mL移液器完全吸除上清液，再用100 µL移液器彻底去除残留液体，然后将细胞沉淀重悬于50 µL 1× SDS-PAGE上样缓冲液中。</li>
	<li>将样品置于沸水浴中加热10分钟。立即置于冰上冷却30秒，随后在16,000 × g条件下离心30秒。</li>
	<li>取30 µL澄清后的样品，加入厚度为1.5 mm的10孔10% SDS-PAGE凝胶的每个加样孔中。先以80 V电压电泳30分钟，然后将电压升至100 V，继续电泳1.5小时。</li>
	<li>电泳结束后，采用标准湿转法将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上，电流设定为400 mA，转膜时间为1小时。</li>
	<li>用封闭缓冲液（含5%脱脂奶粉（w/v）的PBST（PBS + 0.05% Tween-20））在室温下封闭膜1小时。随后，切取分子量介于30 kD至40 kD之间的条带用于检测GAPDH上样对照，切取50 kD至70 kD之间的条带用于检测CAR分子。</li>
	<li>分别将30–40 kD和50–70 kD的膜条带置于3 mL封闭缓冲液中，与小鼠抗GAPDH抗体（1:2,000稀释）和小鼠抗Flag抗体（1:2,000稀释）孵育，可在室温下孵育2小时，或在4 °C下过夜孵育。</li>
	<li>在室温下，使用平台摇床以PBST洗涤膜3次，每次5分钟。</li>
	<li>将膜条带在3 mL封闭缓冲液中与HRP标记的山羊抗小鼠二抗（1:5,000稀释）在室温下孵育1小时；随后用PBST洗涤5次，每次10分钟。</li>
	<li>使用HRP底物孵育膜以显影，然后利用化学发光成像仪观察检测到的蛋白条带。</li>
</ol>
4. 体外 缺氧敏感型CAR-T细胞介导的细胞毒作用的氧依赖性评估
<ol>
	<li>第0天，在两个黑色平底96孔细胞培养板中，每孔接种1 × 104个靶细胞（SKOV3-Luc细胞），每孔体积为200 µL，使用含10% FBS的DMEM培养基。</li>
	<li>第1天，小心从每孔上清液中移除100 µL。在含10% FBS的100 µL DMEM培养基中，按效应细胞与靶细胞比例为1:1、2:1和4:1加入CAR-T细胞或未转导T细胞。</li>
	<li>将一块培养板置于21% O2&#160;环境中，另一块置于1% O2&#160;环境中，使用可移动的CO2/O2/N2培养箱腔室，操作如步骤2.1所述。 
	注意：若无可移动的CO2/O2/N2培养箱腔室，可在培养基中添加CoCl2以模拟缺氧条件。</li>
	<li>第2天，共培养24小时后，使用移液器小心将全部上清液（约150–200 µL）转移至新的U型底96孔板中。储存于-20 °C，用于后续细胞因子检测，操作按第5节所述程序进行。</li>
	<li>向第4.4步中的黑色平底96孔板各实验孔中加入60 µL 1×被动裂解缓冲液。然后将板置于摇床上，振荡30分钟，以确保细胞充分裂解。</li>
	<li>向各实验孔中加入60 µL萤火虫荧光素酶底物，并立即使用酶标仪测定荧光素酶活性。</li>
	<li>使用公式（1）计算归一化细胞毒性（%）： 
	归一化细胞毒性（%） = 100 - <img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/66697/66697eq01.jpg" style="margin: auto;" /> ×100&#160; &#160; （1）</li>
</ol>
5. 缺氧敏感型CAR-T细胞分泌IL-2和IFN-γ的检测
<ol>
	<li>第0天，用包被缓冲液将IL-2或IFN-γ捕获抗体稀释至1:250。每孔加入100 µL稀释后的抗体至96孔ELISA板中，并于4 °C孵育过夜。 
	注意：包被缓冲液的配制方法为将7.13 g NaHCO3和1.59 g Na2CO3溶于1 L蒸馏水中，调节pH至9.5。</li>
	<li>第1天，通过用力将板倒扣以去除未吸附的捕获抗体，然后用200 µL洗涤缓冲液（含0.05% Tween 20的PBS）洗涤各孔3次。</li>
	<li>每孔加入200 µL检测稀释液（含10% FBS的PBS），室温孵育1小时。</li>
	<li>用力将板倒扣弃去液体，然后用200 µL洗涤缓冲液洗涤各孔3次。</li>
	<li>将步骤4.4中冷冻的上清样品/板于室温解冻。完全解冻后，用检测稀释液稀释样品和标准品。每孔加入100 µL稀释后的样品或标准品至包被好的ELISA板中，室温孵育2小时。 
	注意：检测IL-2时建议进行10倍稀释，检测IFN-γ时建议进行50倍稀释。</li>
	<li>用力将板倒扣去除样品和标准品，然后每孔用200 µL洗涤缓冲液洗涤5次。</li>
	<li>用检测稀释液将IL-2检测抗体或IFN-γ检测抗体/链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SAv-HRP）按1:250比例稀释，配制成工作浓度的检测溶液。每孔加入100 µL工作浓度检测溶液，室温轻度振荡孵育1小时。</li>
	<li>弃去溶液，用200 µL洗涤缓冲液洗涤各孔7次。</li>
	<li>每孔加入100 µL底物试剂，室温避光孵育30分钟。</li>
	<li>每孔加入50 µL终止液（1 M H2SO4），立即使用酶标仪在450 nm波长处读取吸光度。</li>
</ol>

Functional Validation of Hypoxia-Sensitive CAR-T Cells for Selective Tumors

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<li>Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T%3A+What+is+next%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">CAR-T: What is next.</a> Cancers. 15 (3), 663(2023).</li>
<li>Barsan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+utilisation+and+outcomes+across+refractory%2C+first+relapse+and+multiply+relapsed+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+A+retrospective+analysis+of+real-world+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22eClinicalMedicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns.</a> eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+virus+delivery+of+dual+CAR+targets+of+CD19+and+BCMA+as+well+as+immunomodulators+to+enhance+therapeutic+efficacy+in+solid+tumors+combined+with+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex virus delivery of dual CAR targets of CD19 and BCMA as well as immunomodulators to enhance therapeutic efficacy in solid tumors combined with CAR-T cell therapy.</a> Front Oncol. 12, 1037934(2022).</li>
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<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+in+tumor+immune+microenvironment+and+its+optimization+from+CAR-T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression in tumor immune microenvironment and its optimization from CAR-T cell therapy.</a> Theranostics. 12 (14), 6273-6290 (2022).</li>
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<li>Martinez, M., Moon, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells+for+solid+tumors%3A+New+strategies+for+finding%2C+infiltrating%2C+and+surviving+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CAR T cells for solid tumors: New strategies for finding, infiltrating, and surviving in the tumor microenvironment.</a> Front Immunol. 10, 128(2019).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

安全性问题是任何CAR-T细胞疗法推进至临床应用时必须解决的重要问题。利用肿瘤细胞或肿瘤微环境（TME）的独特特性已成为当前研究的主要方向，聚焦于开发可选择性靶向肿瘤组织的CAR-T细胞。设计一种缺氧敏感型CAR-T是该方向中颇具吸引力的策略，目前已有多种方法正在探索中，包括本研究中所提出的方法——将CAR元件与天然存在的缺氧感应ODD蛋白结构域融合。另一种方法是用缺氧反应元件（HRE）替代常用于驱动CAR表达的组成型启动子，此前的研究已表明该方法具有前景。人们认为，将HRE与ODD元件（野生型或经过工程化改造、可实现更严格表达调控的版本）相结合，是构建缺氧可诱导型CAR的最优设计方案。
本方案概述了生成和验证缺氧敏感型CAR-T细胞的实验步骤。实施本方案时需考虑若干关键因素。首要因素是建立缺氧条件。在两种常用方法中，向培养基中添加CoCl2在以往的缺氧相关研究中被广泛采用，主要因其操作简便32,33。然而，该方法无法准确测量其所模拟缺氧程度。相比之下，使用可移动的CO2/O2/N2混合气体培养箱具有优势，因其可精确设定O2浓度，因而适用于对CAR-T细胞缺氧敏感性的精细分析。值得注意的是，不同类型的实体瘤以及肿瘤进展的不同阶段，其内部缺氧水平存在差异34，而本方案中仅以1% O2为例。研究人员应根据实际需求调整氧浓度为最佳实践。若仅能采用CoCl2方法，我们建议在实验中设置一系列CoCl2浓度梯度，以模拟不同的氧水平。
选择合适的方法来检测缺氧依赖性CAR表达是另一个关键考虑因素。尽管在CAR结构优化过程中，对转导CAR的Jurkat T细胞进行免疫印迹分析是一种便捷的选择，但通过流式细胞术分析氧浓度对转导CAR的人外周血单个核细胞（PBMCs）表面CAR表达的影响，才是最终的验证手段。最佳方案是研究CAR表达在从缺氧状态转变为常氧状态过程中的动态变化，正如我们此前使用改良版缺氧敏感性CAR（即HiTA-CAR35）所进行的实验。这将进一步证实CAR表达的缺氧限制特性。
为了验证缺氧敏感型CAR-T细胞的功能，本方案中所述的细胞毒性检测采用携带萤火虫荧光素酶的靶细胞。该基于报告基因的检测方法可替换为其他杀伤效果评估方法，例如CCK8法或实时细胞分析（RTCA）法，后者可使用未经修饰的肿瘤细胞。RTCA分析还具有可检测CAR-T细胞实时杀伤动力学的优势。为测定CAR-T细胞引起的特异性细胞毒性，应将未转导的外周血单个核细胞（PBMCs）作为对照。较高的PBMC转导效率是可取的，以避免实验组与对照组之间检测到的细胞毒性差异源于效应细胞添加量不同所导致的非特异性杀伤。
该方案存在若干局限性。低氧条件可能影响靶细胞和T细胞的存活率。36,37，这引发了人们对与CAR-T细胞介导的细胞毒性无关的细胞死亡可能干扰实验结果解读的担忧。建议在实验开始前确保CAR-T细胞和靶细胞均具有良好的活力，以避免或尽量减少此类问题。还应注意 体外 验证并不能保证成功 体内 翻译。 在体 评估始终是必要的&#160;确认缺氧敏感型CAR-T候选细胞是否能够避免靶向表达目标抗原的正常组织

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在癌症治疗中取得了重大突破。自2017年美国食品药品监督管理局（FDA）批准首个用于治疗晚期/耐药性淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病的CAR-T疗法以来1,2,3，全球已有10种靶向CD19或B细胞成熟抗原（BCMA）的CAR-T疗法获得批准4。然而，尽管已有大量研究，将CAR-T疗法在血液系统恶性肿瘤中所展现的显著疗效成功复制到实体瘤治疗中，仍面临巨大挑战5,6,7,8。
免疫抑制性肿瘤微环境（TME）是导致CAR-T细胞在实体瘤治疗中疗效不佳的主要原因。由于营养物质不足、缺氧、酸性pH值以及代谢废物的积累，TME会阻碍CAR-T细胞的活性与存活9,10,11,12。此外，浸润的免疫抑制性细胞如调节性T细胞（Tregs）、髓系来源的抑制性细胞（MDSCs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）也加剧了这一不利环境。这些细胞与肿瘤细胞共同分泌免疫抑制性细胞因子，进一步抑制进入肿瘤组织的CAR-T细胞功能13,14。
除了治疗效果不理想外，CAR-T细胞在应对实体瘤时的另一个致命弱点是安全性问题15,16。安全性问题的根源在于，迄今为止已鉴定的肿瘤特异性抗原（TSA）均未严格局限于肿瘤细胞。换句话说，作为CAR靶点的肿瘤相关抗原（TAA）尽管在肿瘤细胞中表达水平较高，但通常也在正常组织中表达17。因此，当CAR高效识别正常组织时，可能导致CAR-T细胞意外激活，从而引发“靶向肿瘤、误伤正常组织”（on-target, off-tumor）效应，造成细胞因子释放综合征（CRS）、CAR-T细胞相关脑病综合征（CRES）18以及其他不良后果19。
已探索多种策略以避免此类效应，包括降低CAR的亲和力，使CAR-T细胞能够根据靶向肿瘤相关抗原（TAA）的表达水平区分肿瘤细胞与正常细胞；为CAR-T细胞配备关闭开关，例如自杀基因或清除标记，以便在发生意外激活时促进其清除；将CD3ζ信号与共刺激信号分置于两个CAR分子中，从而需要同时结合才能有效激活CAR-T细胞；利用基于合成Notch（synNotch）的回路，使CAR-T细胞的活性仅限于同时表达两种不同TAA的靶细胞；以及通过设计调控机制，使CAR的表达能够响应微环境变化，从而赋予CAR-T细胞对肿瘤微环境（TME）的敏感性20,21,22,23,24,25,26。
上述TME敏感性策略中的一个关键考虑因素是，由于肿瘤细胞的快速增殖，肿瘤微环境（TME）中氧含量较低。肿瘤细胞对缺氧的适应依赖于缺氧诱导因子-1（HIF-1）的激活，HIF-1是一种异源二聚体转录因子，由一个可诱导的亚基HIF-1α和一个组成型表达的亚基HIF-1β组成27。在常氧条件下，HIF-1α蛋白通过其氧依赖性降解结构域（ODD）发生泛素化并迅速被蛋白酶体降解28。当细胞内氧气供应受限时，HIF-1得以稳定，并通过结合缺氧反应元件（HREs）激活其下游靶基因的转录29。鉴于ODD和HRE作为氧敏感元件的特性，它们已被用于实现CAR在缺氧TME中的条件性表达30。本文提供了一项实验方案，重点介绍缺氧敏感型CAR-T细胞的表型与功能特征鉴定方法，此前简要描述了CAR的设计及其细胞制备流程。该方案旨在为利用缺氧响应性CAR构建具有受限脱靶毒性的CAR-T细胞提供实用指导。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>QSP</td><td>509-GRD-Q</td><td>上清液和细胞收集&lt;br/&gt; 实验方案步骤 2,3,4</td></tr><tr><td>10% ExpressCast PAGE</td><td>NCM biotech</td><td>P2012</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>NCM biotech</td><td>20220812</td><td>细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 4</td></tr><tr><td>10 mL 移液器</td><td>Yueyibio</td><td>YB-25H</td><td>移液操作&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr><tr><td>10x TRIS-甘氨酸-SDS 电泳缓冲液</td><td>Epizyme</td><td>3673020</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>上清液和细胞收集&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; EasYFlask</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td>细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3,4</td></tr><tr><td>4x 蛋白质 SDS PAGE 上样缓冲液</td><td>Takara</td><td>9173</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>6 孔平底组织培养板</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>T 细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr><tr><td>96 孔黑色平底组织培养板</td><td>Greiner</td><td>655090</td><td>细胞毒性检测&lt;br/&gt; 实验方案步骤 4</td></tr><tr><td>96 孔 ELISA 板</td><td>Corning</td><td>3590</td><td>ELISA&lt;br/&gt; 实验方案步骤 5</td></tr><tr><td>96 孔板振荡器</td><td>QILINBEIER</td><td>MH-2</td><td>振荡&lt;br/&gt; 实验方案步骤 4</td></tr><tr><td>96 孔 U 型底组织培养板</td><td>Thermo Scientific</td><td>268200</td><td>上清液收集&lt;br/&gt; 实验方案步骤 4,5</td></tr><tr><td>抗 FLAG 抗体</td><td>Sigma</td><td>F1804-50UG</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>国药集团</td><td>10010061</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>二氧化碳培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>360</td><td>细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1,2,3,4</td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>Hausser scientific</td><td>1492</td><td>细胞计数&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1,3,4</td></tr><tr><td>CELLection Pan Mouse IgG 试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>11531D</td><td>小鼠 IgG 磁珠&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002432</td><td>细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1,3,4</td></tr><tr><td>化学发光凝胶成像系统</td><td>BIO-RAD</td><td>12003154</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>氯化钴溶液 (0.5 M)</td><td>bioleaper</td><td>BR4000203</td><td>缺氧条件&lt;br/&gt; 实验方案步骤 2,3,4</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-103-CV</td><td>细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 4</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Sartorius</td><td>PRACTUM612-1CN</td><td>称重&lt;br/&gt; 实验方案步骤 5</td></tr><tr><td>FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td>细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3,4</td></tr><tr><td>GAPDH 小鼠单克隆抗体</td><td>ABclonal</td><td>AC002</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>凝胶电泳装置</td><td>BIO-RAD</td><td>1645070</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>GloMax 微孔板读数仪</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td>荧光素酶活性测定&lt;br/&gt; 实验方案步骤 4</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Yeasen</td><td>P1126151</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>高速冷冻离心机</td><td>eppendorf</td><td>5810&amp;nbsp;R</td><td>细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr><tr><td>人 IFN-&amp;gamma; ELISA 试剂盒</td><td>BD</td><td>555142</td><td>ELISA&lt;br/&gt; 实验方案步骤 5&lt;br/&gt; 内容物：重组人 IFN-&amp;gamma; 冻干标准品，检测抗体 生物素标记抗人 IFN-&amp;gamma;，捕获抗体 纯化抗人 IFN-&amp;gamma;，酶试剂 链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物 (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>人 IL-2 ELISA 试剂盒</td><td>BD</td><td>555190</td><td>ELISA&lt;br/&gt; 实验方案步骤 5&lt;br/&gt; 内容物：重组人 IL-2 冻干标准品，检测抗体 生物素标记抗人 IL-2，捕获抗体 纯化抗人 IL-2，酶试剂 链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物 (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>R&amp;D systems</td><td>P40933</td><td>T 细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr><tr><td>IL-21</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CC45</td><td>T 细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R&amp;D systems</td><td>P13232</td><td>T 细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1,3,4</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>CAR-Jurkat 构建&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>LSRFortessa</td><td>流式细胞术&lt;br/&gt; 实验方案步骤 2</td></tr><tr><td>荧光素酶检测系统</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>荧光素酶报告基因检测&lt;br/&gt; 实验方案步骤 4&lt;br/&gt; 内容物：被动裂解缓冲液，萤火虫荧光素酶底物</td></tr><tr><td>微孔板读数仪</td><td>BioTek</td><td>HTX</td><td>ELISA&lt;br/&gt; 实验方案步骤 5</td></tr><tr><td>便携式 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>中国创新仪器有限公司</td><td>Smartor118</td><td>缺氧条件&lt;br/&gt; 实验方案步骤 2, 3, 4</td></tr><tr><td>小鼠抗六组氨酸标签抗体</td><td>Sigma</td><td>SAB2702218</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>NcmBlot 快速转移缓冲液</td><td>NCM biotech</td><td>WB4600</td><td>免疫印迹</td></tr><tr><td>NcmECL Ultra</td><td>NCM biotech</td><td>P10300</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3&lt;br/&gt; 内容物：NcmECL Ultra 鲁米诺/增强剂试剂 (A)，NcmECL Ultra 稳定化过氧化物试剂 (B)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NovoNectin 包被的 48 孔平底板</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CH38</td><td>CAR-T 细胞构建&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr><tr><td>OPD (邻苯二胺二盐酸盐) 片剂套装</td><td>Sigma</td><td>P9187</td><td>底物试剂&lt;br/&gt; 实验方案步骤 5&lt;br/&gt; 内容物：OPD 片剂（银箔），尿素过氧化氢片剂（金箔）</td></tr><tr><td>PE 标记抗 DYKDDDDK 抗体</td><td>Biolegend</td><td>637310</td><td>流式细胞术&lt;br/&gt; 实验方案步骤 2</td></tr><tr><td>硫酸鱼精蛋白</td><td>Sigma</td><td>P3369-1OG</td><td>慢病毒感染&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr><tr><td>蛋白质 Marker 10 kDa–250 kDa</td><td>Epizyme</td><td>WJ102</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;纯化 NA/LE 小鼠抗人 CD3 抗体</td><td>BD</td><td>566685</td><td>T 细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr><tr><td>纯化 NA/LE 小鼠抗人 CD28 抗体</td><td>BD</td><td>555725</td><td>T 细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>Millipore</td><td>168627</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRC</td><td>细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Yeasen</td><td>S9129060</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>SKOV3-Luc</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>细胞毒性检测&lt;br/&gt; 实验方案步骤 4</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>NCM biotech</td><td>C125C1</td><td>细胞培养&lt;br/&gt; 实验方案步骤 4</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>国药集团</td><td>30189328</td><td>免疫印迹&lt;br/&gt; 实验方案步骤 3</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>keelrein</td><td>NB014467</td><td>加热&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr><tr><td>X-VIVO 15&amp;nbsp;</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td>无血清淋巴细胞培养基&lt;br/&gt; 实验方案步骤 1</td></tr></tbody></table>

缺氧敏感型嵌合抗原受体t细胞的生成与功能验证

Generation and Functional Verification of Hypoxia-Sensitive Chimeric Antigen Receptor-T Cells

大量研究已证实嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面具有广阔前景。然而，实体瘤的治疗仍面临挑战，例如当CAR-T细胞攻击表达靶抗原的正常细胞时可能引发安全性问题。研究人员已探索多种策略以提高CAR-T细胞疗法对肿瘤的选择性。其中一种代表性方法是构建缺氧敏感型CAR-T细胞，该策略通过将氧依赖性降解结构域与CAR组分融合，使CAR仅在缺氧环境——即肿瘤微环境（TME）中高水平表达。本文提供了一种此类CAR-T细胞的制备方案及其功能表征方法，包括利用便携式培养箱建立不同氧浓度条件，以分析CAR表达水平及杀伤能力的变化。所构建的CAR-T细胞预期能够以氧敏感的方式呈现CAR表达和细胞毒性，从而支持其在缺氧的肿瘤微环境与常氧的正常组织之间进行选择性激活的能力。

将HIF-1α的ODD结构域与CAR组分融合是构建缺氧敏感型CAR的主要策略。本研究中分析的缺氧敏感型HER2靶向CAR（命名为HER2-BBz-ODD）即采用该策略，通过将ODD序列插入传统的HER2-BBz结构中而构建（图1A）。在本研究中，我们利用慢病毒转导表达HER2-BBz-ODD CAR或HER2-BBz CAR，并随后在两种细胞类型——人外周血单个核细胞（PBMCs）和Jurkat T细胞中检测了其对氧气浓度的敏感性。
首次检测比较了缺氧条件与常氧条件下CAR的表达情况，该实验分别通过流式细胞术检测CAR转导的外周血单个核细胞来源的T细胞，以及通过蛋白质印迹法检测CAR转导的Jurkat T细胞。在CAR转导的外周血单个核细胞来源的T细胞中，我们观察到HER2-BBz-ODD CAR在1% O2条件下的表达显著高于21% O2条件，表现为CAR阳性细胞比例和中位荧光强度（MFI）均升高（图1B）。对CAR转导的Jurkat T细胞进行的免疫印迹分析也证实了HER2-BBz-ODD在缺氧条件下的诱导表达。
值得注意的是，在此情况下，可通过向培养基中添加化学性缺氧诱导剂 CoCl2，方便地模拟缺氧条件。如图1C所示，我们的免疫印迹结果表明，暴露于50或200 µM CoCl2 可重现暴露于1% O2 的效应，显著诱导 HER2-BBz-ODD CAR 的表达，但不诱导 HER2-BBz CAR 的表达。缺氧敏感型 CAR 的功能表征实验采用外周血单个核细胞（PBMC）来源的 CAR-T 细胞进行。研究中使用携带萤火虫荧光素酶的 SKOV-3 细胞系作为靶细胞。该实验体系使我们能够通过检测靶细胞相关的荧光素酶活性，间接评估共培养的 CAR-T 细胞所介导的细胞毒性作用。
如图1D所示，检测结果表明，无论在常氧还是低氧环境中，HER2-BBz CAR-T细胞均能有效杀伤靶细胞。相比之下，在检测的三种效靶比（E:T）下，HER2-BBz-ODD CAR-T细胞在常氧条件下的细胞毒性均显著减弱。然而，当处于低氧环境时，其细胞毒性显著增强。在CAR-T细胞与靶细胞共培养24小时后，还通过ELISA检测了上清液中IL-2和IFN-γ的水平。对于这两种细胞因子，HER2-BBz-ODD CAR-T细胞在1% O2条件下的分泌水平均高于21% O2，这与细胞毒性结果一致。相反，HER2-BBz CAR-T细胞在1% O2条件下的两种细胞因子分泌水平低于21% O2，表明低氧对细胞活性具有不利影响（图1E）。综上所述，这些结果有力地验证了HER2-BBz-ODD CAR具有低氧敏感的特性。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66697/66697fig01.jpg" /> 
图1缺氧敏感型CAR-T细胞的构建与表征 (A) 缺氧敏感型CAR HER2-BBz-ODD及其常规对照HER2-BBz的设计示意图。两种CAR均包含一个N端CD8信号肽&#945; 信号肽、FLAG标签、靶向人HER2的scFv、CD8铰链区及跨膜区，以及包含4-1BB共刺激结构域和CD3胞内区的部分&#958; 信号结构域、IRES 和 EGFP。HER2-BBz-ODD 与 HER2-BBz 的区别在于将 ODD 结构域融合至 CD3 的 C 末端&#958; 信号结构域，使其在常氧条件下通过促进其依赖泛素的降解而受到低氧依赖性表达调控。B，CHER2-BBz-ODD CAR 的氧依赖性表达评估。B) 在1%或21% O₂条件下培养后，使用人外周血单个核细胞（PBMC）来源的CAR-T细胞进行了一次评估2 分别培养24、48或72小时后，采用流式细胞术检测。C另一种评估使用了转导CAR的Jurkat T细胞，在21% O₂条件下培养24小时后收集细胞裂解物。2，50 或 200 &#181;M CoCl2，或 1% O₂2 并使用Western blotting分析CAR表达，以HER2-BBz CAR转导的细胞作为对照。 (D，E) 体外 不同氧条件下CAR-T细胞的细胞毒性及细胞因子分泌。DCAR-T细胞在1%或21% O₂条件下，按指定效靶比与表达萤光素酶的SKOV3细胞共培养2共培养24小时后，通过检测细胞相关性萤光素酶活性相对于非转导T细胞的变化，确定靶细胞杀伤效率。E收集上清液用于检测分泌的 IL-2 和 IFN-γ&#947;结果显示为平均值 &#177; 扫描电镜（n = 3 名健康供体）（****p < 0.0001） &#60; 0.0001）。缩写：scFv = 单链可变区片段；CAR = 嵌合抗原受体。图示 C 和 D 改编自 Liao 等人。31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66697/66697fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种生成缺氧敏感型嵌合抗原受体（CAR）-T细胞及其功能验证的实验方案。该方案描述了基于慢病毒系统生成缺氧敏感型CAR-T细胞的方法，并对其进行了表征，包括验证缺氧依赖性的CAR表达以及选择性细胞毒性。

缺氧敏感型嵌合抗原受体T细胞的生成与功能验证

大量研究已证实嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面具有广阔前景。然而，治疗……

我们的研究主要聚焦于癌症免疫治疗，特别是基于CAR T细胞的免疫疗法。在过去10年中，我们一直在探索新的策略，以使CAR T细胞能够特异性地靶向肿瘤，同时将副作用降至最低，甚至完全避免副作用。为了提高基于CAR T细胞免疫疗法的安全性和有效性，研究人员持续探索了多种新策略，特别是通过靶向肿瘤微环境来实现，例如本方案中所展示的缺氧条件响应型CAR。有趣的是，最近的研究表明，低氧条件型CAR T细胞不仅显著改善了安全性，还减少了CAR T细胞的耗竭，并增强了其在实体瘤中的疗效。低氧是肿瘤微环境的一个典型特征。本研究旨在帮助癌症免疫治疗领域的研究人员理解低氧敏感型CAR T细胞的概念、其构建方法以及如何建立低氧模型以进行评估。我们的实验室将继续探索构建CAR T细胞的新策略，以提高其肿瘤治疗效果、安全性和成本效益。

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缺氧敏感的嵌合抗原受体-T 细胞的生成和功能验证

本视频展示了一种制备嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术 离体...

一种用于制备嵌合抗原受体T细胞的离体技术

本视频展示了一种用于体外生成肿瘤抗原特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞的技术。将携带转基因RNA的逆转录病毒载体与脾细胞混合，置于添加白细胞介素-2的培养基中，以促进T细胞的存活与增殖。随后将混合物转移至包被有重组人纤维连接蛋白片段的培养板中，并进行离心，以促进病毒与细胞的融合，从而使RNA整合到宿主基因组中，并表达可靶向肿瘤抗原的细胞表面结合型CAR。...

一种体外生成肿瘤特异性嵌合抗原受体T细胞的技术

我们描述了一种定量实时体外细胞裂解检测系统，用于评估靶向液体和实体肿瘤细胞的嵌合抗原受体T细胞的杀伤效力。该方案可扩展用于评估其他免疫效应细胞以及联合治疗方法。...

一种针对实体瘤及血液系统癌细胞的嵌合抗原受体T细胞实时效价检测方法

本方案描述了非侵入性追踪经基因工程改造以表达嵌合抗原受体的T细胞的方法学 体内...

动态成像嵌合抗原受体T细胞与[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描

本方案概述了将目的基因转导至原代人T细胞的过程，确保符合药品生产质量管理规范（GMP）标准。...

一种符合药品生产质量管理规范的基因修饰T细胞制备流程

本文详细介绍了用于临床的嵌合抗原受体T细胞的制备工艺，特别是使用能够进行病毒转导和T细胞培养的自动化细胞处理设备。我们提供了相关建议，并描述了在早期临床试验的工艺开发与实施过程中应注意的潜在问题。...

自动化细胞处理器上的嵌合抗原受体T细胞制备

该方案简化了逆转录病毒载体的制备及小鼠T细胞的转导过程，有助于高效生成小鼠CAR-T细胞。...

高效生成小鼠嵌合抗原受体（CAR）-T细胞

本方案提供了一种简化的流程，用于生成和检测人源嵌合抗原受体调节性T细胞（CAR...

人源嵌合抗原受体调节性T细胞的制备

本方案概述了使用非整合型mRNA生成瞬时嵌合抗原受体（CAR）T细胞以用于癌症免疫治疗的详细步骤，并提供了评估CAR-T细胞及其细胞毒功能的可靠方法。...

一种利用mRNA生成非病毒性短暂嵌合抗原受体T细胞用于癌症免疫治疗的方法

非整倍性会导致基因组不稳定，最终产生具有复杂核型的细胞周期阻滞细胞。本文提供了一种简单便捷的方法，用于分离停止分裂的具有复杂核型的非整倍体细胞。...

生成与分离具有复杂核型的细胞周期阻滞细胞

了解利用慢病毒技术生成缺氧敏感型嵌合抗原受体T细胞的方法，验证其在缺氧肿瘤微环境中的选择性杀伤功能。该方案有助于提升CAR-T细胞治疗实体瘤的安全性与疗效。

缺氧敏感型嵌合抗原受体T细胞的生成与功能验证

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