Name: 研究小鼠镇痛作用的改良炎症性疼痛模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 了解改良的双后爪角叉菜胶注射炎症性疼痛模型，用于评估小鼠镇痛效果。该方法通过热板测试提高痛阈评估的准确性，为疼痛管理和麻醉药物开发提供更可靠的研究工具。

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我们感谢 Liwen Bianji（Edanz）（www.liwenbianji.cn）的 Lesley McCollum 博士对本稿件初稿的英文文本进行编辑。

实验方案已获烟台大学机构动物护理与使用委员会批准（编号：YTDX20220425）。实验操作遵循美国国立卫生研究院《实验动物使用指南》。
1. 动物
<ol>
	<li>实验使用体重为 20–25 g 的 ICR 雌性小鼠。</li>
	<li>实验开始前，让动物在实验室内环境适应 3 天。</li>
	<li>实验室内保持 12 小时光照-黑暗循环，并为小鼠提供自由饮水和饲料。</li>
</ol>
2. 卡拉胶溶液的制备
<ol>
	<li>称取0.1 g卡拉胶，向试管中加入10 mL无菌生理盐水。</li>
	<li>将0.1 g卡拉胶加入试管中，涡旋振荡30 s。</li>
	<li>收集1%无菌卡拉胶溶液。</li>
	<li>在实验前配制卡拉胶溶液。</li>
</ol>
3. 足底注射角叉菜胶
<ol>
	<li>使用注射器（0.05 mL，29G × ½ 英寸，0.33 mm × 12.7 mm）注射1% 卡拉胶溶液。</li>
	<li>抽取卡拉胶溶液前应充分振荡混匀，确保注射器内无气泡。</li>
	<li>用75%酒精对注射部位（后肢足掌）进行消毒。</li>
	<li>将30 µL6,7的1%卡拉胶溶液皮下注射至后肢足底部位。对照组小鼠注射30 µL生理盐水。
	<ol>
		<li>将针头斜向上刺入后肢足垫组织。保持注射器稳定。</li>
		<li>注射完成后缓慢拔出注射器，并按压注射部位2秒，以防药液渗漏。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 热板实验
<ol>
	<li>在足底注射后3小时进行热板实验。</li>
	<li>清洁并消毒热板表面。</li>
	<li>启动热板仪器。点击 Temperature Mode 按钮，然后点击 CONSTANT ，将温度设定为 55 ± 0.2 °C。</li>
	<li>点击 Start experiment&#160;按钮，再点击 REACH。从饲养容器中取出一只小鼠，轻轻抓住其躯干，将小鼠置于热板中心，然后点击 START。</li>
	<li>观察并记录小鼠对热刺激产生反应时舔舐左后爪（单后爪注射小鼠）或后爪（双后爪注射小鼠）所需的时间。踩下热板脚踏开关，在热板屏幕上读取时间。将疼痛阈值定义为从小鼠放置于热板至舔舐后爪的时间间隔。</li>
	<li>热板实验设定60秒的时间上限4,8,9。若达到该时限，则记录疼痛阈值为60秒。 
	注意：在放入下一只小鼠前，需使用75%酒精清洁热板装置，以避免前一只小鼠残留气味可能带来的干扰。</li>
</ol>
5. 制备 1.5 mg/mL 的塞来昔布混悬液
<ol>
	<li>取一粒含有 200 mg 塞来昔布的胶囊，倒出内容物并研磨成粉末。</li>
	<li>加入 0.5% 羧甲基纤维素钠，定容至 13.3 mL，即为塞来昔布的储备混悬液。</li>
	<li>取 1 mL 塞来昔布储备混悬液，加入 9.0 mL 0.5% 羧甲基纤维素钠，得到浓度为 1.5 mg/mL 的塞来昔布混悬液。</li>
	<li>以 0.2 mL/10 g 的剂量将塞来昔布混悬液经口胃内灌注给予小鼠。 
	注：对于体重为 20–25 g 的小鼠，应选用长度为 4.0–4.5 cm 的灌胃针。</li>
</ol>
6. 评估改良的炎症性疼痛模型
<ol>
	<li>将ICR雌性小鼠随机分为三组：对照组、模型组和塞来昔布组。</li>
	<li>在后肢足底皮下注射30 µL 1%角叉菜胶溶液（单后肢或双后肢）。对照组小鼠注射30 µL生理盐水。</li>
	<li>注射角叉菜胶或生理盐水后立即进行给药处理。塞来昔布组小鼠以30 mg/kg剂量经口灌胃给予塞来昔布；对照组和模型组小鼠经口灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液。</li>
	<li>在注射角叉菜胶后3 h进行热板实验（第2节）。</li>
</ol>
7. 统计学方法
<ol>
	<li>以均值 ± 标准差形式呈现实验结果。使用 Kolmogorov-Smirnov 统计适配性检验进行正态性分布检验。</li>
	<li>采用非配对 t 检验分析两组之间的比较。对于多组比较，采用单因素方差分析，随后进行 Dunnett 检验。认为 p &#60; 0.05 具有统计学显著性。</li>
</ol>

Dual Hind Paw Injection for Enhanced Analgesic Testing

<ol><li>Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+used+to+evaluate+pain+behaviors+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methods used to evaluate pain behaviors in rodents.</a> Front Mol Neurosci. 10, 284(2017).</li>
<li>Menéndez, L., Lastra, A., Hidalgo, A., Baamonde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+hot+plate+test%3A+a+simple+and+sensitive+method+for+detecting+central+and+peripheral+hyperalgesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Unilateral hot plate test: a simple and sensitive method for detecting central and peripheral hyperalgesia in mice.</a> J Neurosci Methods. 113 (1), 91-97 (2002).</li>
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<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+analgesic+actions+of+bufotenine+through+inhibiting+lipid+metabolism+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and analgesic actions of bufotenine through inhibiting lipid metabolism pathway.</a> Biomed Pharmacother. 140, 111749(2021).</li>
<li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinociceptive+and+anti-inflammatory+potentials+of+Akebia+saponin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Antinociceptive and anti-inflammatory potentials of Akebia saponin D.</a> Eur J Pharmacol. 845, 85-90 (2019).</li>
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</ol>

作者无任何潜在的利益冲突需要披露。

疼痛是由组织损伤或伤害引发的一种保护性反应。然而，它也会对生活质量产生负面影响10。因此，有效镇痛药物的开发以及疼痛机制的探索仍是当前研究的热点领域。疼痛评估方法在镇痛药物的研发过程中起着关键作用。单侧后肢足底注射角叉菜胶是热板试验中的一种经典方法。本文所介绍的通过双侧后肢足底注射角叉菜胶建立的改良模型，为研究潜在治疗药物缓解疼痛的疗效提供了可靠的方法。
在本研究中，我们发现单后肢足底注射卡拉胶的小鼠并未出现痛阈降低。然而，在其他研究中，该方法在热板试验中导致了痛阈的显著下降11,12。既往研究与本研究结果之间的差异，可能归因于实验中使用了不同的动物种类13,14,15,16。另一种可能的解释是，我们观察到单后肢足底注射卡拉胶的小鼠经常抬起注射侧足或轻踏热板，以避免热刺激。而痛阈的评估需观察小鼠对注射侧足的典型伤害性反应，如舔舐或抖动足部。因此，我们得到了阴性结果，表明单后肢足底注射卡拉胶模型的痛阈并未显著降低。双后肢足底注射卡拉胶的小鼠则无法通过抬起足部或轻踏热板来规避热刺激。此时，痛阈的判断标准为任一后肢出现舔舐或抖动反应，更能真实反映小鼠的伤害性感受反应。
为了验证改良后炎症性疼痛模型的优越性，分别对单侧后肢足底或双侧后肢足底注射卡拉胶的小鼠给予口服塞来昔布治疗。与本研究的假设一致，塞来昔布在改良的炎症性疼痛模型中表现出镇痛作用，但在单侧后肢足底注射卡拉胶的模型中则未显示出任何效果。该结果表明，改良的炎症性疼痛模型可用于潜在镇痛药物的可靠筛选。
本研究存在一些局限性。在热板试验中已使用了多种不同的小鼠品系。不同小鼠品系对热刺激的反应可能存在差异。本实验仅采用ICR小鼠来验证假设。因此，该改良方法是否能够准确且一致地检测其他小鼠品系在热板试验中的痛阈，仍有待进一步确定。此外，我们未设计预实验来评估小鼠的痛阈，因而未排除痛阈较高的个体。然而，这一局限性也可能被视为本改良方法的一项优势：它不仅简化了镇痛试验的操作流程，而且更真实地反映了小鼠在热板试验中的反应范围。另外，后肢足爪体积的测量有助于确认炎症的诱导效果，并验证非甾体抗炎药（NSAIDs）的镇痛作用。但根据我们的经验，小鼠足爪体积的测量并不容易。由于小鼠足爪过小，难以获得精确的测量值。因此，本研究未设计针对炎症后足爪体积变化的考察。
综上所述，通过上述步骤建立的双后足注射角叉菜胶的炎症性疼痛模型，能够可靠地测定小鼠的热伤害感受阈值。此外，在给予镇痛药物后，疼痛阈值的升高具有统计学意义。该改良的炎症性疼痛模型适用于潜在镇痛药物的筛选。同时，该方法还可用于疼痛生物学研究、新药开发及临床治疗，为疼痛管理提供新的思路和解决方案。

疼痛是全球范围内的一个公共卫生问题。它由有害的热、机械或化学刺激引发。由于伦理方面的顾虑，很难在人类身上开展疼痛研究。因此，使用动物疼痛模型是理解疼痛机制和研发治疗方法的关键途径1。热板试验已被广泛用于评估热伤害感受和痛觉过敏2。目前，热板试验中常用的炎症性疼痛模型是通过向一只后肢足底皮下注射角叉菜胶来建立的。例如，为研究载有罗替戈汀的微球的抗伤害感受作用，研究人员通过单侧后肢足底注射建立动物炎症性疼痛模型3。为评估儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂对小鼠热伤害感受的影响，研究人员将角叉菜胶注射至右侧后肢足底区域4。为探究大洋海神草（Posidonia oceanica (L.) Delile）提取物的镇痛作用，研究人员通过向小鼠右侧后肢足底注射角叉菜胶建立炎症性疼痛模型5。然而，我们实验室的研究发现，单侧后肢注射角叉菜胶的小鼠在热板试验中会抬起其受累足爪以避免热刺激，从而不准确地延长了动物对热刺激的反应时间。因此，我们推测，采用单侧后肢注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型无法准确反映热痛阈值。为此，我们优化了该方法，通过将角叉菜胶注射至双侧后肢足底，建立了一种改良的炎症性疼痛模型。
接受双后爪注射角叉菜胶的小鼠无法同时避免双侧后爪的热刺激。疼痛阈值定义为将小鼠放置于热板上至其舔舐任一后爪所需的时间。结果证实，改良后的炎症性疼痛模型更适用于评估伤害性温度阈值。这可能提高热板实验在镇痛药物研发中的有效性。

<table><tbody><tr><td>AL204 电子天平</td><td>余恒电池有限公司&amp;nbsp;</td><td>YH-400A</td><td></td></tr><tr><td>羧甲基纤维素</td><td>天津化学有限公司&amp;nbsp;</td><td>20210326</td><td></td></tr><tr><td>卡拉胶</td><td>Sigma，密苏里州，美国</td><td>29H0715</td><td></td></tr><tr><td>塞来昔布</td><td>辉瑞公司</td><td>8142838</td><td></td></tr><tr><td>热板仪&amp;nbsp;</td><td>UGO 公司，意大利</td><td>PB-200&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ICR 雌性小鼠</td><td>济南朋悦有限公司&amp;nbsp;</td><td>SCXK20220007</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>科伦药业有限公司&amp;nbsp;</td><td>H51021157</td><td></td></tr></tbody></table>

一种改良的炎症性疼痛模型用于研究小鼠的镇痛效应

A Modified Inflammatory Pain Model to Study the Analgesic Effect in Mice

热板实验被广泛用于评估小鼠炎症性疼痛的镇痛效果。通常采用在单侧后肢足底注射角叉菜胶来建立炎症性疼痛模型。然而，我们实验室的研究发现，单侧后肢注射角叉菜胶的小鼠在进行热板实验时会抬起后肢以避免热刺激引起的伤害性感觉。由于这一行为反应，&#160;此前的注射方法无法准确反映热痛阈值。因此，我们探索了一种新的方法以解决这一问题。在本研究中，我们对原有方法进行了改进，通过将角叉菜胶同时注射至双侧后肢足底来建立炎症性疼痛模型。结果表明，与单侧后肢注射相比，双侧后肢注射角叉菜胶在热板实验中对诱导炎症性疼痛更为敏感且效果更佳。基于这些发现，我们进一步设计实验，分别对双侧或单侧后肢注射角叉菜胶的小鼠给予口服塞来昔布（30 mg/kg）。热板实验结果显示，塞来昔布可提高双侧后肢注射角叉菜胶小鼠的热痛阈值，但对单侧注射小鼠无此作用。综上所述，我们建立了一种更优的炎症性疼痛模型诱导方法，可用于评估镇痛药物的效果。

炎症性疼痛模型中的痛阈 
采用单侧后肢足底注射卡拉胶建立的炎症性疼痛模型，其痛阈为 32.23 ± 11.11 s，而对照组的痛阈为 27.73 ± 7.08 s。与对照组相比，单侧后肢注射模型的痛阈未显示显著降低（p > 0.05，图 1A）。采用双侧后肢足底注射卡拉胶建立的炎症性疼痛模型，其痛阈为 21.84 ± 5.63 s，而对照组的痛阈为 28.21 ± 8.61 s。与对照组相比，双侧后肢注射模型的痛阈显著降低（p < 0.05，图 1B）。
塞来昔布在不同炎症性疼痛模型中的镇痛作用 
在采用单侧后肢足爪注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型中，塞来昔布组的痛阈（27.01 ± 10.98 s）与模型组（29.77 ± 13.97 s，p &gt; 0.05）相比未见显著升高。与上述结果一致，模型组与对照组（30.94 ± 14.54 s）相比，痛阈亦无显著降低，表明单侧后肢足爪注射角叉菜胶未能成功诱导炎症性疼痛模型（图2A）。在采用双侧后肢足爪注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型中，模型组的痛阈（15.61 ± 4.85 s）较对照组（23.55 ± 3.96 s）显著降低（p &lt; 0.05）。与模型组相比，塞来昔布组的痛阈（20.29 ± 3.10 s）显著升高（图2B）。
<img alt="比较对照组和模型组的痛觉阈值柱状图；包含统计学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66701/66701fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：炎症性疼痛模型中的痛觉阈值。（均值 ± 标准差，n = 15）。（A）采用单侧后肢足底注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型的痛觉阈值。（B）采用双侧后肢足底注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型的痛觉阈值（#P＜0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66701/66701fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="疼痛阈值比较柱状图；塞来昔布在对照组和模型组中的作用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66701/66701fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：塞来昔布在不同炎症性疼痛模型中的镇痛作用（均值 ± 标准差，n = 14）。(A) 塞来昔布在采用单侧后肢足垫注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型中的镇痛作用。(B) 塞来昔布在采用双侧后肢足垫注射角叉菜胶建立的炎症性疼痛模型中的镇痛作用（#P＜0.05，*P＜0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66701/66701fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种改良的炎症性疼痛模型，通过向双后爪注射角叉菜胶来评估镇痛效果。

热板试验广泛用于评估小鼠炎症性疼痛中的镇痛效果。一种常用的炎症性疼痛模型通过……诱导产生。

疼痛对生活质量具有负面影响。疼痛评估方法在麻醉药物的研发中起着关键作用。本研究旨在提供一种可靠且更优的方法来评价镇痛效果。热板试验广泛用于评估小鼠炎症性疼痛中的镇痛效果。一种常用的炎症性疼痛模型是通过向一只后肢足底注射角叉菜胶来诱导。我们发现，单侧后肢注射角叉菜胶的小鼠在进行热板试验时会抬起足爪以避免热刺激引起的伤害性疼痛。由于这种反应，注射方法无法准确反映热痛阈值。因此，我们通过向双侧后足掌注射角叉菜胶来建立炎症性疼痛模型，对先前方法进行了改进。结果表明，在热板实验中，与单侧后足掌注射相比，双侧后足掌注射角叉菜胶在诱导炎症性疼痛方面更为敏感，是一种更优的方法。综上所述，我们建立了一种更优的方法来诱导炎症性疼痛模型，以评估镇痛效果。本实验仅使用了ICR小鼠。在今后的研究中，我们将进一步验证该改良方法是否能够准确且一致地检测其他品系小鼠的痛阈。实验开始时，选用体重为20至25克的ICR雌性小鼠。在开始实验前，让动物在实验室内环境适应三天。制备卡拉胶溶液时，称取0.1克卡拉胶。向试管中加入10毫升灭菌生理盐水。向试管中加入0.1克卡拉胶，并涡旋振荡试管30秒。然后收集1%灭菌卡拉胶溶液。首先，取一支注射器注入已配制的1% 卡拉胶溶液。轻轻振荡卡拉胶溶液，并将其吸入注射器中，确保注射器内无气泡。然后用75%酒精对注射部位进行消毒。将针头斜向上刺入后肢足垫，同时保持注射器稳定，注入30 µL的1% 卡拉胶溶液。注射后，缓慢拔出注射器，并按压注射部位2秒，以防止液体渗漏。清洁并消毒热板表面。启动加热板装置，点击温度模式按钮，然后点击恒温，将温度设定为约 55 摄氏度。点击开始实验按钮，再点击达到。现在从饲养容器中取出一只小鼠，轻轻抓住其躯干，将其置于热板的中心位置，然后点击“开始”。观察并记录动物在热刺激下舔舐左后爪或后爪所需的时间。按下热板的脚踏开关，查看热板屏幕上显示的时间，然后将热板实验的时间上限设定为60秒。如果达到上限，则记录疼痛阈值为60秒。服用一粒含有200毫克塞来昔布的胶囊。取出胶囊内容物并研磨成粉末。为制备塞来昔布储备悬液，加入0.5%羧甲基纤维素钠，定容至13.3毫升。取1毫升塞来昔布储备悬液，加入9.0毫升0.5%羧甲基纤维素钠，得到塞来昔布工作悬液。按每10克小鼠体重灌胃给予0.2毫升塞来昔布悬液。将ICR雌性小鼠随机分为三组：对照组、模型组和塞来昔布组。在小鼠后肢足底皮下注射30微升1%的角叉菜胶溶液。注射后，对塞来昔布组小鼠按30毫克/千克剂量进行灌胃给药。在注射角叉菜胶后3小时进行热板实验。单侧后肢注射模型的痛觉阈值与对照组相比未显示显著降低，而双侧后肢注射模型的痛觉阈值与对照组相比显著下降。在单侧后肢足底注射模型中，塞来昔布组的痛阈与模型组相比未见显著升高。然而，在双侧后肢足底注射模型中，塞来昔布组的痛阈表现出显著升高。

a-modified-inflammatory-pain-model-to-study-analgesic-effect

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

研究小鼠镇痛作用的改良炎症性疼痛模型

本文描述的 spared nerve injury（SNI）动物模型是一种小鼠模型，通过损伤坐骨神经的胫神经和腓总神经分支，保留剩余的腓肠神经完整，从而建立外周神经病理性疼痛模型。由机械性异常性疼痛引起的行为学改变通过 von Frey...

小鼠中诱导机械性异常性疼痛的 spared nerve injury（SNI）模型

我们描述了一种用于研究小鼠中阿片类药物诱导的痛觉过敏和耐受性发展的方案。该方案基于对未受处理小鼠和经吗啡处理小鼠的热刺激和机械性伤害感受反应的测量，能够定量评估与长期使用阿片类药物相关的疼痛敏感性增加（痛觉过敏）以及镇痛效果的降低（耐受性）。...

利用热刺激和机械性伤害感受模式评估小鼠中吗啡诱导的痛觉过敏和镇痛耐受

神经病理性疼痛是由影响躯体感觉系统的损伤或疾病引起的后果。小鼠神经病理性疼痛的“套管模型”是将聚乙烯套管植入坐骨神经主支周围。使用冯·弗雷丝（von...

小鼠神经病理性疼痛的坐骨神经套管模型

本文中，我们提供了IL4-10重组融合蛋白的制备方法及质量控制的详细步骤。同时，我们还展示了如何在炎症性疼痛的小鼠模型中检测该蛋白缓解疼痛的效果。...

开发用于治疗慢性疼痛的重组蛋白

我们开发了一种诱发性关节炎疼痛的检测方法，并将其与标准化的自发性疼痛测量方法相结合，用于检测不同化学诱导型小鼠关节炎模型中的疼痛。这些方法对不同类型的关节疼痛具有较高的敏感性和可重复性。...

单关节膝痛小鼠模型中疼痛的自发性与诱发性评估

这种改良手术是一种简化的用于小鼠或大鼠的保留神经损伤模型的方法，仅需一次结扎和一次切割即可同时损伤腓总神经和腓肠神经。...

小鼠神经病理性疼痛的改良部分神经结扎手术模型

机械冲突回避实验被用作评估小鼠疼痛敏感性的一种非反射性指标，可用于更好地理解多种小鼠疼痛模型中的情感-动机反应。...

小鼠疼痛行为的机械性避冲突检测法

本文提供了利用尿激酶型纤溶酶原激活物进行韧带内注射，以快速、简便地建立小鼠背痛模型的方法。...

尿激酶型纤溶酶原激活物诱导的小鼠背痛模型

坐骨神经部分结扎可诱导产生持续时间较长的慢性神经病理性疼痛，其特征是对热和机械刺激的反应显著增强。该神经病理性疼痛小鼠模型常用于研究疼痛管理方面的创新疗法。本文详细描述了手术操作步骤，以提高实验的标准化程度和可重复性。...

部分坐骨神经结扎：一种用于研究新型疗法镇痛效果的慢性神经病理性疼痛小鼠模型

本方案描述了如何测量小鼠的膝关节痛觉过敏。我们展示了急性膝关节疼痛小鼠模型以及骨关节炎（OA）模型中的示例。...

使用压力应用测量法评估小鼠膝关节痛觉过敏

了解改良的双后爪角叉菜胶注射炎症性疼痛模型，用于评估小鼠镇痛效果。该方法通过热板测试提高痛阈评估的准确性，为疼痛管理和麻醉药物开发提供更可靠的研究工具。

一种改良的炎症性疼痛模型用于研究小鼠的镇痛效应

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