光片成像揭示啮齿类动物心脏结构

本研究旨在定制一种光片成像系统，用于在细胞水平上研究完整啮齿类动物心脏的心肌结构。我们已建立了一套工作流程，能够以微米级的各向同性分辨率，对从新生到成年阶段的啮齿类动物完整心脏心肌进行探索。本研究填补了高空间分辨率下完整心室内部小梁等复杂心肌微结构研究的空白。

这种成像策略提供了一种无需物理切片即可评估微结构的方法，有助于更深入地理解心脏发育和重塑过程。我们将重点探讨心肌在心脏损伤和重塑过程中的结构变化。首先，将包埋在琼脂糖中的小鼠心脏置于20%甲醇溶液中一小时。

依次将心脏转移至浓度递增的甲醇溶液中进行脱水。脱水过程中，将含有心脏的溶液置于60赫兹的振荡器上。将脱水后的心脏转移至新鲜的100%甲醇溶液中。

将溶液更换为新鲜的100%甲醇后，将心脏置于4°C条件下10分钟。随后吸除溶液，再加入200毫升含5%过氧化氢的甲醇溶液以漂白心脏。

将心脏在溶液中于 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，将样品转移至 100% 甲醇中。孵育后，将其转移至含有 66% 二氯甲烷和 33% 甲醇的溶液中。

心脏应沉入离心管底部。将样品置于混合器上作用三小时，以确保心脏完全解离。最后，将样品在二苯甲酰醚中孵育，以实现折射率匹配。

P1小鼠心脏组织在四天内变为透明，而八周龄小鼠心脏组织在七天内变为透明。首先，启动显微镜的图像采集软件，计算覆盖整个小鼠心脏所需的图像平铺数量。

从第一块区域开始，依次捕获心脏的图像。随后，以相邻区域之间10%的重叠度，顺序捕获其余区域的图像，直至覆盖整个心脏。接着，打开 BigStitcher 插件，并通过图像文件目录导入所有必要的图像区域。

将数据集保存为 HDF5 文件。使用“按规则网格移动图块”功能来排列图块，然后选择用于移动心脏的模式，并设置每个图块之间 10% 的重叠。使用“拼接向导”选项对图块进行拼接。

使用图像融合（Image Fusion）导出拼接后的数据，生成 TIFF 文件。对于样品的多视角去卷积（Multi-View Deconvolution），沿心脏方向利用荧光微珠进行多视角重建的图像配准。沿检测轴扫描心脏组装体，以获取小鼠心脏被照明区域的连续图像。

将小鼠心脏沿 Y 轴旋转 60 度，从多个角度采集后续图像序列。然后打开 BigStitcher 插件，通过图像文件目录导入所有图像。将数据集保存为 HDF5 文件。

选择、检测兴趣点，并手动选取用于配准的感兴趣微球。选择仿射变换模型进行配准，并将点扩散函数（PSF）分配给所有视图。点击多视角去卷积，选择迭代类型为高效贝叶斯方法。

将迭代次数定义为10并执行。最后，单击图像融合以导出TIFF文件。多视角去卷积方法在15小时计算后实现了接近各向同性的分辨率。

基于电调透镜的腋扫光片显微镜能够最大限度地减少离焦背景，提高图像对比度。将拼接技术与轴向扫描光片显微镜相结合，可实现对整个八周龄小鼠心脏的均匀分辨率成像。首先，在柱面透镜的傅里叶平面上安装电控调焦透镜（ETL）。

打开ETL驱动器的外壳并取下盖板。将ETL驱动器插入工作站的USB端口，然后使用HIROSE电缆将驱动器与ETL连接。

接下来，安装镜头驱动控制器软件。将操作模式和软件更改为模拟模式，以便通过DAC卡生成的触发信号来控制ETL。在sCMOS相机的软件中，将采集模式切换为外部触发模式。

为同步系统，根据可接受的信噪比设定曝光时间。在 Lab View 程序 Trigger Generator.vi 中生成方波和三角波触发信号以实现同步。沿 X 轴扫描激光束，并沿 Y 轴激活像素，以生成二维图像。

图像中对角线上更亮且更清晰的荧光小球表明实现了精确同步。接下来对心脏进行成像。