小鼠初始CD4⁺ T细胞体外分化为致病性Th17细胞

我们的研究目标是靶向诱导TH17细胞的定向分化，旨在探索一种简单的TH17细胞逆转分化方法，该方法可作为与TH17细胞相关疾病逆向实验的传统条件。许多研究已提及TH17细胞的诱导方法，近期研究则聚焦于小分子抑制剂及其他干细胞通路。然而，几乎所有研究中诱导效率的图谱均未达到50%以上。目前已有多种新技术应用于TH17细胞的筛选与分离，例如流式细胞术、TH17细胞分选以及磁珠分选法。因此，关键在于我们发现了一种通过在培养基中添加不同浓度STAs来诱导TH17细胞分化的简便方法，其分化纯度可接近90%。在本实验室，我们正在研究插入疾病模型中免疫微环境的变化，包括免疫细胞的改变及免疫失衡的纠正等。

首先，将已处死的小鼠仰卧位放置于洁净的实验台上。沿小鼠腹部中线剪开，并逐层分离腹部组织。用镊子轻轻打开大网膜和胃部。

然后轻柔地牵拉附有胃脾韧带的脾脏，钝性分离其周围组织和韧带。为获取完整的脾脏，将一个70微米的细胞滤网置于100毫米的无菌培养皿中。将脾脏置于细胞筛网上，用注射器活塞碾压破碎。加入5至8毫升匀浆冲洗液，推动脾细胞通过滤网进入培养皿中。

将滤液在室温下以450 G离心五分钟，弃去上清液。使用淋巴细胞分离试剂盒中提供的样品稀释液重新悬浮沉淀。在血细胞计数板上计数细胞后，将细胞浓度调整至每毫升2×10⁸个细胞。

在离心管中加入与组织单细胞悬液等量的淋巴细胞分离液。小心地将单细胞悬液缓慢铺加到淋巴ocyte分离液表面，于25°C下以800 G离心30分钟。离心后，从上至下观察离心管中的四层结构。

使用移液器小心地将环状乳白色淋巴细胞层吸入另一支试管中。向试管中加入10毫升清洗液以混匀细胞。将细胞悬液在250 ×g条件下离心4至5分钟。

弃去上清液，将沉淀重悬于10毫升RPMI 1640培养基中用于细胞计数。首先，制备浓度为每毫升1×10⁸个细胞的小鼠脾脏单细胞悬液。在0.1至2毫升的体积中，向样品加入50微升大鼠血清。

将样品转移至一个5毫升的聚苯乙烯圆底管中。向样品中加入50微升分离试剂盒。充分混匀，并在室温下孵育7.5分钟。

每毫升加入 50 微升的去除非目标细胞混合液。充分混匀后孵育 2.5 分钟。同时，涡旋振荡磁珠以确保均匀分散。

向样品中加入 75 µL 磁珠。充分混匀，孵育 2.5 分钟。用 RPMI 1640 培养基将样品补至终体积 2.5 mL，并反复混匀数次。

然后将离心管放入磁力架中静置2.5分钟。拿起磁力架，连同离心管一起连续平稳地翻转。将富集的细胞悬液倒入新的离心管中。

使用血细胞计数板确定细胞数量。在分离前后对初始CD4+T细胞进行流式细胞术分析。门控后，将细胞悬液转移至新的离心管中。

在400 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于200至500微升添加了10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中。每1毫升细胞培养物中加入2微升白细胞激活剂混合液，并混匀。

将细胞置于37摄氏度、含饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养4至6小时。首先，从预先包被了抗CD3抗体的24孔板中移除PBS。用TH17细胞培养基重悬经富集的小鼠脾脏初始CD4+ T细胞，并将其接种至预先包被了抗CD3抗体的24孔板的不同孔中。

向培养板的其余孔中分别加入TH0细胞培养基、经典非致病性TH17培养基和经典致病性TH17培养基作为对照。每孔加入1 µL抗CD28溶液。将细胞置于37°C、5% CO₂培养箱中培养5天。

第二天，用新鲜培养基更换一半的细胞培养上清液。第五天在光学显微镜下观察细胞。收集各组的细胞上清液，并在负80摄氏度下冷冻保存。

初始CD4+ T细胞在TH0培养基和TH17分化培养基中培养五天后，在两种培养基中均呈现成簇生长。流式细胞术分析显示，在新型TH17细胞培养基的刺激下，90%的初始CD4+ T细胞成功分化为致病性TH17细胞。