Name: Longa 大脑中动脉闭塞方法的优化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: 学习优化的小鼠大脑中动脉闭塞手术方法，采用改良Longa颈外动脉入路技术，确保完全再灌注。该方案可提高缺血性中风研究的手术准确性与可重复性。

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本工作由克罗地亚科学基金会项目BRADISCHEMIA（UUP-2017-05-8082）资助；GA KK01.1.1.01.0007由欧洲联盟通过欧洲区域发展基金资助，以及根据资助协议编号KK.01.1.1.07.0071，由欧洲联盟通过欧洲区域发展基金资助，项目&#34;SineMozak。博士生Rok Ister和Marta Pongrac的工作得到了克罗地亚科学基金会“青年研究人员职业发展项目——博士生培训”&#34;&#34;的全额支持，该基金由欧洲社会基金通过欧洲联盟资助。实验过程使用安装在手术显微镜上的通用相机支架固定的安卓智能手机进行拍摄。视频材料的剪辑及配音录制均使用Wondershare Filmora视频编辑软件完成。

所有动物操作和实验程序均经萨格勒布大学医学院伦理许可委员会以及克罗地亚共和国农业部科学用途动物保护伦理委员会批准。实验操作依据克罗地亚《动物保护法》（NN 102/17，32/19）、《动物保护法修正案》（NN 37/13）以及《科学用途动物保护指南》（NN 55/13）进行，上述法规与《欧洲实验动物护理与使用指南》（指令 2010/63/EU）一致。
1. 动物和手术部位的准备
<ol>
	<li>将动物放入击晕盒中，使用5%体积的异氟烷与氧气/氮气混合气体（比例为1:2）诱导麻醉。</li>
	<li>目视检查动物的意识状态和呼吸频率后，将其转移至实验室天平上称重。</li>
	<li>通过夹捏后肢趾间皮肤检查反射，以确认麻醉深度适当。</li>
	<li>将动物置于加热手术台上，并将其鼻部置于麻醉面罩中。初始设置手术台温度为36 °C，并根据后续步骤中直肠探头测得的体温调节至维持动物体温在37 °C。在后续所有步骤中，调节异氟烷的体积分数，使动物呼吸频率保持在100次/分钟。 
	注意：所有与动物直接接触的表面和材料在操作前必须彻底消毒。</li>
	<li>在动物眼部涂抹眼膏，以防止脱水和异氟烷气体的刺激。</li>
	<li>将动物仰卧位放置，并在其颈部下方垫一小块由手术胶带制成的枕头，以伸展颈部。</li>
	<li>使用手术胶带固定动物四肢。注意不要过度拉伸前肢，以免意外导致肩关节脱位。</li>
	<li>使用凡士林润滑直肠探头，并将其插入直肠以进行连续体温监测。使用手术胶带将探头与尾巴一同固定。</li>
	<li>术前经腹腔注射生理盐水和布托啡诺（0.5 mg/kg），以维持动物术中充分水化和镇痛。</li>
	<li>使用无线动物电推剪剃除动物颈部区域的毛发。用手术胶带收集所有剃下的毛发。再用剃刀进一步剃除该区域毛发，确保完全无毛。</li>
	<li>根据测得的动物体重和/或年龄选择合适的MCAO栓线。将其从容器中取出，放入培养皿中置于显眼位置。在栓线的硅胶部分滴加一滴生理盐水，以保持其清洁无尘。 
	注意：对于12至16周龄的小鼠，栓线硅胶涂层的厚度应根据制造商的官方建议选择。此外，硅胶涂层的长度应根据拟阻塞的灌注区域大小提前仔细规划（见讨论部分）。</li>
	<li>在手术台上铺上干净的手术单。</li>
	<li>在动物已剃毛的皮肤上滴加一滴碘伏。使用棉签从内向外以环形方式将消毒剂涂抹入皮肤。随后，用浸有乙醇的棉签重复相同操作。每次重复均使用新的无菌棉签，共重复3次。</li>
	<li>在消毒后的未来切口部位涂抹少量利多卡因凝胶，以实现局部伤口镇痛。</li>
</ol>
2. 缺血诱导手术
<ol>
	<li>使用手术刀在已消毒的皮肤上做初始切口。尽量减少皮肤切口的次数，以利于手术伤口的愈合。 
	注意：所有器械必须事先经过灭菌处理。读者应参考所在机构关于使用无菌或外科手套的指导规范。</li>
	<li>使用7号和5号镊子，撕开浅筋膜，并将唾液腺从下方组织中分离。 
	注意：操作时应始终保持镊子闭合前进，移动时再张开以推开组织。这样可以在最小组织损伤的情况下穿过解剖间隙。</li>
	<li>将金属牵开器置于初始位置，同时确保唾液腺不会干扰后续操作步骤。</li>
	<li>使用7号镊子去除深部颈筋膜，并将胸锁乳突肌从颈动脉区域分离，以便重新定位牵开器。</li>
	<li>重新调整牵开器位置，使其位于胸锁乳突肌下方，以暴露颈动脉区域。</li>
	<li>切除肩胛舌骨肌，以便清晰观察并更方便地接近颈动脉区域。</li>
	<li>将颈总动脉及其分支从包裹在颈动脉鞘内的颈静脉和迷走神经中游离出来。 
	注意：必须小心去除该筋膜，避免损伤迷走神经或引起明显出血。
	<ol>
		<li>用镊子夹住颈动脉三联结构外侧的颈动脉鞘，轻轻向外牵拉，以清晰辨认动脉、神经、静脉及周围所有血管分支。</li>
		<li>在向外牵拉筋膜的同时，使用5号镊子将颈总动脉（CCA）从邻近的神经和静脉中分离，直至分支点以及跨越CCA上方的甲状腺上静脉处。</li>
		<li>使用弯头7号镊子将CCA下段完全从下方组织和筋膜中分离，确保其已准备好供后续步骤夹闭。</li>
		<li>沿CCA分支点以上区域向头侧推进，使用两把镊子撕开颈动脉鞘。</li>
		<li>同样地，将颈动脉鞘的游离端分别向内侧和外侧牵拉，精确地将颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）从筋膜及周围组织中分离。</li>
		<li>使用弯头7号镊子将ECA和ICA从下方组织中完全游离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在颈总动脉及其两个分支已妥善分离后，用弯头7号镊子提起颈外动脉（ECA），并用N0型自闭合镊子夹闭。</li>
	<li>小心将N0型自闭合镊子放低至手术台面。 
	注意：如需调整ECA的夹闭位置，有时需略微松开镊子，并将ECA分支点向尾侧推动。此时应确保ECA夹闭点与分支点之间保留超过1 mm的ECA长度。</li>
	<li>在ECA被N0型镊子牢固夹闭并固定后，将两根编织丝线从ECA后方穿过。 
	注意：头侧丝线用于结扎打结，必须置于夹闭点的头侧。</li>
	<li>将头侧丝线完全打结固定（此为永久结扎），然后用剪刀剪除多余线头。</li>
	<li>将尾侧丝线打成一个松结作为固定结。 
	注意：该结应靠近ECA分支点，并保持松散状态，以便MCAO线栓通过。</li>
	<li>使用血管微夹夹闭颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA），以防止动脉切开后出血。 
	注意：必须确保用于CCA的微夹具有足够夹持力，因为CCA是一条搏动性强、血流量大的动脉，若夹闭不牢，可能导致严重出血，甚至动物死亡。</li>
	<li>使用显微弹簧剪，在ECA夹闭点正下方做一小段动脉切开。 
	注意：切口应足够大，以便线栓的硅胶部分进入，但不应超过ECA周长的一半，以免影响N0型镊子的夹持张力。</li>
	<li>沿ECA的走向角度，将线栓从动脉切开处向近心端（即朝向CCA方向）插入，穿过ECA分支点处的松结，并进入CCA管腔内。</li>
	<li>收紧固定结，使其紧贴线栓的硅胶部分。 
	注意：此步骤需格外小心，因线栓在最后操作过程中容易从ECA中途滑脱，一旦滑出，重新插入将非常困难。</li>
	<li>小心打开ICA的微夹并将其移除。</li>
	<li>在线栓部分插入ECA并已固定的情况下，完成整个动脉切开，使带有MCAO线栓的ECA残端完全游离。此时松开并移除N0型自闭合镊子。</li>
	<li>用一对5号镊子牢固夹住ECA残端并轻微提起。同时用另一把镊子固定已部分插入的线栓，缓慢下压并轻柔牵拉ECA残端，使线栓前端朝向ICA方向。切勿夹持线栓的硅胶部分。</li>
	<li>用镊子固定线栓，缓慢将其沿ICA向Willis环方向推进。 
	注意：ICA的第一个分支点也是操作者最容易错过目标MCA分支点的位置。因此，需以轻微外侧角度推进线栓，以引导其进入MCA分支。通过这种轻微外侧角度的推进，线栓可避开翼腭动脉（PPA），更有可能进入Willis环（图1）。</li>
</ol>
<img alt="大脑动脉解剖图，显示PPA、ICA、CCA、ECA标签，供教学参考。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66720/66720fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：大脑中动脉闭塞线栓通过翼腭动脉分支点的示意图。 正确的线栓推进方式（左侧）是将MCAO线栓调整方向，使其紧贴颈内动脉（ICA）的侧壁，并远离翼腭动脉（PPA）的分支点。若未做到这一点（右侧），线栓可能进入PPA，从而无法引起脑卒中。在此情况下，线栓无法推进至应有位置，手术者应撤回线栓，直至其末端在ICA分叉处可见，然后重新开始推进线栓。绿色动脉代表后交通动脉（PcomA），在小鼠中大多不开放。图示使用BioRender.com制作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66720/66720fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="21">
	<li>缓慢推进MCAO线栓穿过Willis环，直至感觉到突然增加的阻力。 
	注意：此时应观察线栓剩余的长度。在成年小鼠中，线栓应能轻松地从颈内动脉（ICA）分叉点继续推进至少7 mm。</li>
	<li>扎紧固定结，以确保在缺血期间线栓不会移位。</li>
	<li>移除颈总动脉（CCA）夹，并记录时间。 
	注意：此时间点标志着缺血开始。</li>
	<li>将MCAO线栓的游离端盘绕放置于颈动脉三角与同侧胸锁乳突肌之间的沟槽内，避免其突出于手术切口外。</li>
	<li>移除金属牵开器，将手术切口边缘拉近对合。静置手术区域数秒钟，使组织恢复至解剖位置。</li>
	<li>使用手术胶带闭合切口，以便在缺血结束后快速重新打开切口。 
	注意：若研究人员希望动物在缺血期间苏醒，建议缝合切口，以防切口过早裂开。</li>
</ol>
3. 缺血期
<ol>
	<li>使用 MRI 或其他定量灌注测量方法验证手术成功。 
	注意：若进行 MRI 扫描，灌注加权成像（PWI）应显示大脑中动脉广泛区域的严重缺血，而弥散加权成像（DWI）应勾画出由于细胞水肿导致表观弥散系数（ADC）降低的区域。</li>
	<li>将动物放入清洁笼具中，直至缺血期结束。</li>
</ol>
4. 纤维撤出手术
<ol>
	<li>在预定的缺血时间结束前约5分钟，将动物重新置于手术台上并固定。</li>
	<li>移除缠绕的胶带闭合物，并用金属丝牵开器重新打开手术切口。</li>
	<li>松开MCAO线栓的自由端，使其脱离周围组织以及固定结扎线的末端。</li>
	<li>使用N0型镊子夹住并轻轻向腹侧牵拉ECA残端边缘，使其受到张力。小心地将夹持镊子逐渐下移，操作方式类似于第一次手术步骤。 
	注意：操作者必须避免夹住固定结，否则将导致结无法解开。</li>
	<li>再次使用微血管夹夹闭CCA。</li>
	<li>使用5型镊子松开固定结，以便撤出线栓。 
	注意：开始松解结的最佳方法是持续夹住结直至其分解为单独部分，然后将线头推向结的方向。</li>
	<li>缓慢撤出MCAO线栓，直至硅胶部分开始从ECA残端露出。略微收紧固定结，为完全撤出线栓做好准备。</li>
	<li>当接近线栓的硅胶末端时，收紧固定结，使其在一次操作中将MCAO线栓推出并同时闭合ECA残端。在线栓完全滑出后，彻底扎紧结。</li>
	<li>打开并同时移除夹持镊子和CCA夹。 
	注意：这标志着缺血期的结束和再灌注过程的开始。</li>
	<li>移除金属丝牵开器，再次将手术切口边缘对合。</li>
	<li>从切口边缘开始缝合手术切口，完全闭合伤口，确保无皮下组织外露。 
	注意：所需缝线数量取决于手术切口的大小。</li>
	<li>使用酒精擦拭片清洁并消毒手术部位。</li>
</ol>
5. 术后护理
<ol>
	<li>将动物放入清洁的笼子中，使其从麻醉状态自然苏醒。</li>
	<li>将颗粒饲料置于笼底以便取食，并用饮用水将饲料颗粒润湿。另取一小培养皿盛装饮用水，一同放入笼内底部。</li>
	<li>在接下来的48小时内，每24小时通过腹腔注射0.25 mL生理盐水配制的布托啡诺（0.5 mg/kg）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。作者与本作品中提及的任何商业名称和商标均无关联。

大脑中动脉阻塞（MCAO）是一种对操作者要求极高且对动物造成显著损伤的手术操作。因此，研究人员必须制定标准操作流程，以最大程度降低卒中严重程度、减少手术失败率，并改善术后动物的福利状况。本MCAO实验方案重点阐述了在小鼠上实施该操作时需要考虑的一些关键环节。
MCAO 手术中栓线的选择会影响所诱导脑卒中病灶的大小和位置，因此是该操作中的关键步骤11。由 Doccol 率先开发的硅胶包被栓线显著降低了栓线诱导出血的发生率，取得了重大进展12。然而，硅胶包被栓线具有多种尺寸和长度，这为新研究人员在为实验动物选择合适的栓线时带来了挑战。尽管栓线制造商通常会提供根据动物体重选择合适直径栓线的指导建议，但硅胶包被的长度通常被认为取决于操作者的个人偏好，且应仅基于操作者的技术水平进行选择。在本研究中，我们主张尽量缩短硅胶包被的长度，以确保所诱导的脑卒中病灶仅局限于大脑中动脉（MCA）供血区域，从而提高实验的可重复性。图4 显示，大脑后动脉（PCA）是颈内动脉（ICA）的第一个颅内分支，负责供应脑部后部区域，包括海马的部分区域。近期针对小鼠的显微CT研究表明，在 MCA 分支点之前，ICA 还发出另外三个较小的分支13。按其分支顺序排列的下丘脑动脉（HTA）、腹侧被盖动脉（VTA）和脉络膜前动脉（AChA）结构精细且存在个体差异，显著增加了个体间和个体内变异程度8。此外，显微CT研究显示，在小鼠中，MCA 与 PCA 分支点之间的平均距离约为 1.7 mm，明显短于大多数商用栓线的硅胶包被长度14。由于操作者在推进栓线时唯一可获得的反馈是在栓线到达 MCA 分支点时阻力突然增加，因此栓线硅胶包被的尾端长度决定了 MCA 区域缺血的程度，并可能根据硅胶包被长度的不同，进一步影响 AChA、VTA、HTA 甚至 PCA，从而引入与预期 MCAO 模型相悖的变异性。因此，为了保证实验的可重复性以及术后动物的健康状况，操作目标应仅为实现 MCA 的闭塞。Doccol 提供的 MCAO 栓线其硅胶包被长度范围为 1 至 2 mm，但我们的经验表明，使用 1–2 mm 的包被长度常常导致假手术结果，未能成功诱导脑卒中。术中 MRI 扫描显示，栓线在到达 MCA 分支点后会继续向前推进达 2 mm，进入大脑前动脉（ACA），才会向操作者提供明显的阻力反馈。基于此，我们强烈建议使用硅胶包被长度为 2 至 3 mm 的栓线，这种规格可减少海马区域在脑卒中病灶中的受累程度，相较于使用更长硅胶包被的 MCAO 栓线更具优势。
该操作的第二个关键步骤是正确放置大脑中动脉阻塞（MCAO）线栓，以实现大脑中动脉（MCA）的完全闭塞。操作者常遇到的一个问题是线栓误入颈内动脉（ICA）的第一个分支——蝶腭动脉（PPA），因为在推进过程中几乎无法获得线栓是否走偏的反馈信息。因此，我们建议以轻微侧向角度推进线栓，使线栓的硅胶涂层尖端偏离PPA的分叉点，从而更有可能进入ICA的颅内段。图1 如方案部分所述，观察线栓尾端剩余长度对于判断其位置是否合适至关重要。如果线栓自ICA分叉点起无法插入至少7 mm，操作者应撤回线栓并重新尝试。在插入线栓过程中施加任何不必要的力量都可能导致出血并使操作失败。为此，可采用连续激光多普勒血流监测来确认线栓位置是否正确。
在缺血期间确保颈总动脉（CCA）血流畅通是本方案中的另一个关键步骤。与大多数描绘小鼠具有完整Willis环的示意图相反，研究表明，小鼠的后交通动脉（PcomA）通常并非双侧通畅，当缺血期间颈总动脉保持闭塞时，无法可靠地向Willis环的同侧供血15,16。在这些情况下，即使研究者仔细选择了合适硅胶涂层长度的线栓，脑卒中范围仍可能累及整个半球或仅限于大脑中动脉（MCA）区域，具体取决于PcomA的通畅性，从而导致梗死体积出现不可控的变异。因此，我们对操作流程进行了改进，在插入阻塞性MCAO线栓后，立即要求操作者移除颈总动脉夹。这些改进可提高手术的精确性和可重复性，同时降低实验结果的异质性。方法的标准化将进一步提高实验成功率和结果的可比性，并增强研究结果的转化潜力17。
该技术最主要的局限性在于，手术后颈外动脉（ECA）仍处于结扎状态，这可能会在动物恢复期间加重其病情18。迄今为止，我们在尝试修复ECA的同时保持手术成功率方面尚未成功。这仍是该方法未来改进的潜在方向。此外，尽量缩短颈总动脉（CCA）夹闭的时间是一个挑战，但对防止脑卒中过程中非大脑中动脉（MCA）区域的参与至关重要。由于这可能成为操作者间和操作者内变异的来源，建议测量CCA夹闭的持续时间，从而可能使研究人员在统计学上至少解释部分观察到的脑梗死体积的总体变异。另一方面，操作者的技能和经验在缩短CCA结扎时间及整体手术时长方面起着关键作用11。
该方法具有重要意义，因为它能够使研究人员选择性地阻断大脑中动脉（MCA），从而实现再灌注的突然发生并具有高度可控性。与目前可用的方法相比，该方法更准确地模拟了血管内取栓术及其随后的再灌注损伤，为建立可重复且具有临床相关性的动物缺血/再灌注损伤模型提供了详细方案。

脑卒中是导致死亡的第二大原因，也是导致死亡和残疾的第三大原因1。通过&#160;其病因不同，脑卒中可分为缺血性和出血性，其中缺血性脑卒中在临床实践中更为常见。缺血性脑卒中是由于向脑组织供血的动脉发生阻塞，导致脑组织缺血、细胞死亡和炎症反应。自溶栓治疗和机械取栓等再灌注疗法问世以来，脑卒中的治疗已取得重大进展。然而，所有再灌注疗法均存在加重患者病情的风险，可能引发通常所说的再灌注损伤。2再灌注损伤的确切机制尚不明确，需要通过临床前研究来确定其潜在原因和预防措施。为此，建立一个与缺血性卒中后相符合的再灌注损伤动物模型变得至关重要。
大脑中动脉闭塞（MCAO）是研究缺血性脑卒中最常用的动物模型。该模型主要在啮齿类动物中实施，迄今为止科学文献中已描述了多种不同的操作变体3,4。其中两种主要类型为Koizumi法和Longa法，也称为颈总动脉（CCA）和颈外动脉（ECA）入路变体，其技术上的主要区别在于插入线栓时的动脉切开部位5,6。在我们最近的研究中，通过in vivo血管灌注监测发现，只有Longa法才可真正被视为脑缺血/再灌注模型7。该操作包括将线栓插入颈外动脉（ECA），经颈内动脉（ICA）推进，并固定于大脑中动脉（MCA）分叉处，以诱导脑组织缺血。在设定的缺血时间结束后，撤出线栓以实现再灌注，从而模拟一过性脑缺血过程。脑卒中发生后，研究中最常采用的主要结局指标是梗死灶体积，可通过ex vivo组织学方法或in vivo脑部扫描进行测量。MCAO模型面临的主要挑战在于其可重复性较低，这归因于不同变体、不同操作者以及不同个体之间的变异，其中个体间差异在临床前脑卒中研究中构成了重要限制因素4。
此外，啮齿类动物在大脑中动脉阻塞（MCAO）后，梗死区域相对于啮齿类动物脑的大小而言非常广泛。同时，尽管脑的海马后部区域主要依赖于来自大脑后动脉（PCA）的血流供应，而非大脑中动脉（MCA），这些区域仍常常被纳入梗死范围8。与文献中描述的Koizumi法和Longa法类似，由于小鼠Willis环存在不完全通畅&#160;，在缺血期间颈总动脉（CCA）保持结扎状态，导致诱导的缺血区域远比预期广泛5,6,9。即使在缺血结束后重新开放或修复CCA的方法中，通常30至60分钟的缺血时间仍会导致非MCA供血区域发生不可逆的组织损伤10。此外，与预期相反，先前的研究表明，栓线硅胶涂层的长度对梗死体积并无影响11。然而，关于栓线硅胶涂层长度的选择，迄今仅在缺血期间结扎CCA的模型中被探讨过。
本方法的目标是改进小鼠的Longa MCAO方法，使缺血期间颈总动脉（CCA）的血流保持持续通畅，从而提高大脑中动脉阻塞（MCAO）的选择性，并确保术后梗死区域完全再灌注。这些改进将显著有利于针对小鼠缺血-再灌注损伤的纵向研究，降低死亡率并减少个体间差异。

<table><tbody><tr><td>10g/100ml 聚维酮碘皮肤溶液</td><td>生物碱斯科普里</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>编织丝线缝合线</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Dafilon 缝线 5/0 DS16</td><td>B. Braun</td><td>C0936154</td><td></td></tr><tr><td>多洛凯因 20 mg/g 凝胶</td><td>贾德兰-加伦斯基实验室</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>2 件</td></tr><tr><td>Dumont #7 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont N0 自锁式镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11480-11</td><td></td></tr><tr><td>Durapore 外科手术胶带 1.25 cm × 9.1 m</td><td>3M</td><td>7100057169</td><td></td></tr><tr><td>Durapore 外科胶带 2.5 cm × 9.1 m</td><td>3M</td><td>7100057168</td><td></td></tr><tr><td>外部恒温器</td><td>Petnap</td><td>1012536</td><td></td></tr><tr><td>Halsey持针器</td><td>精细科学工具</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>精细科学工具</td><td>18000-50</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>精细科学工具</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷 USP</td><td>Piramal Critical Care</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>激光多普勒监测仪</td><td>穆尔</td><td>MOORVMS-LDF2</td><td></td></tr><tr><td>金属宠物加热垫</td><td>Petnap</td><td>1012525</td><td></td></tr><tr><td>微型Vannas弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>迷你蜂鸟牵开器</td><td>精细科学工具</td><td>17000-01</td><td></td></tr><tr><td>Recugel 眼膏</td><td>Bausch&amp;amp;Lomb</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>S&amp;amp;T B-1 血管微型钳&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>00396-01</td><td>2 件</td></tr><tr><td>S&amp;amp;T 微型夹持施力镊子</td><td>精细科学工具</td><td>00071-14</td><td></td></tr><tr><td>施瓦茨微型持针器</td><td>精细科学工具</td><td>18052-01</td><td></td></tr><tr><td>Stemi DV4 体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>000000-1018-453</td><td></td></tr><tr><td>3 mm × 75 mm 加强型无菌胶带皮肤闭合贴</td><td>3M</td><td>7100236545</td><td></td></tr><tr><td>直组织镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11023-10</td><td></td></tr><tr><td>SZX 支架臂</td><td>Olympus</td><td>SZ2-STS</td><td></td></tr><tr><td>Tec III 300 系列校准蒸发器</td><td>Vaporizer Sales and Service 公司</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>通用支架类型 2</td><td>奥林巴斯</td><td>SZ2-STU2</td><td></td></tr><tr><td>VetFlo 六通道麻醉工作站</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-1225</td><td>适用于O2/N2混合气体调节</td></tr></tbody></table>

longa 大脑中动脉阻塞法在完全再灌注中的优化

Optimization of the Longa Middle Cerebral Artery Occlusion Method for Complete Reperfusion

大脑中动脉阻塞模型是研究缺血性脑卒中的主要动物模型。尽管该模型已在研究中使用了三十多年，但其标准化程度仍显不足。该手术主要在大鼠和小鼠上进行，而由于小鼠体型更小且更为脆弱，操作难度较大。与Koizumi法通过颈总动脉插线不同，Longa法通过颈外动脉插线是目前唯一能够确保缺血后完全再灌注的血管内线栓脑卒中模型。这一特点对于研究再灌注现象具有重要意义。本文所展示的手术改良方法可确保在整个缺血期及再灌注开始后，颈总动脉的血流持续通畅。这些改良的目的是在缺血期间，选择性地阻塞大脑中动脉，同时保持其近端分支的灌注不中断。此外，再灌注的启动迅速且可精确控制，从而更准确地模拟人类医学中的血管内取栓治疗。本文通过提供这一全面的视频文章，旨在帮助新外科医师的培训，并推动科学界内手术操作的标准化。

术中或术后磁共振成像（MRI）扫描，特别是灌注加权成像（PWI）和/或弥散加权成像（DWI）扫描（图2），可为手术成功提供明确证据。术中PWI显示同侧大脑中动脉（MCA）区域出现严重缺血，从而证实栓线放置已导致完全闭塞。成功手术的术后PWI显示病灶核心区域出现高灌注，同时MCA区域边缘出现一定程度的再灌注。术中DWI病灶与术中PWI所观察到的缺血区域相对应。术后DWI病灶向缺血核心收缩，并伴随表观弥散系数显著降低，使其较术中DWI病灶及周围再灌注脑组织呈现更暗的信号。标准T2解剖成像在术中和术后通常无明显异常表现，除非发生由栓线引起的出血。
（图3）。在这种情况下，PWI和DWI扫描显示不完全或无缺血。 
再灌注过程在接下来的48小时内发生，并通过术后第二天进行的MRI扫描确认其发生（图2，第2天的CBF）。PWI扫描显示病灶部位完全再灌注，病灶核心区域有轻度高灌注。DWI扫描显示由于脑水肿形成，出现多个表观扩散系数降低的区域。T2解剖扫描显示水肿区域呈高信号，包绕大脑中动脉（MCA）区域，而海马等非MCA区域未受累及。
苏醒后，动物表现出急性脑卒中的明显体征。常见的行为学症状包括病灶同侧肌张力增高，导致动物躯干向该侧屈曲。同侧转圈和旋转也是急性脑卒中的明确表现。步态共济失调常提示缺血性病灶累及海马。然而，由于异氟烷麻醉的副作用，在超急性期该症状可能缺乏特异性。在术后随后的数天内，动物应出现同侧前肢屈曲及姿势状态恶化，并伴有胡须反射消失。术后约3天，由于脑水肿，死亡率达到高峰。当脑水肿开始消退后，进入慢性期。在此期间，动物可能出现尿潴留。因此，重要的是检查动物膀胱是否僵硬以及尿道出口处是否有坚实封盖。大多数情况下，可通过轻柔按摩膀胱以促进排尿来解决此问题。卒中发生后最初7天内，通常会出现体重恢复的迹象。
<img alt="脑成像分析；CBF 和 ADC 图谱，T2 加权 MRI；术中/术后，第 2 天结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66720/66720fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：通过 MRI 扫描证实完全再灌注的大脑中动脉闭塞（MCAO）成功模型的代表性示例。CBF、ADC 和 T2w 分别代表脑血流图谱、表观扩散系数图谱和 T2 加权解剖扫描。IntraOP、postop 和 D02 分别表示缺血发生后、再灌注开始后以及 MCAO 后第二天这三个不同时间点的成像结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66720/66720fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑成像分析；CBF、ADC图、T2加权MRI；术中、术后对比；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66720/66720fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：MCAO手术过程中由线栓引发出血的代表性MRI扫描图像。 CBF、ADC和T2w分别代表脑血流图、表观扩散系数图和T2加权解剖扫描图像。IntraOP、postOP和D02表示成像的三个不同时间点：缺血开始后、再灌注开始后以及MCAO术后第二天。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66720/66720fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑动脉示意图；标注的脑动脉；前动脉、中动脉、后动脉、颈动脉。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66720/66720fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：大脑中动脉分支处线栓正确放置的示意图。 大多数情况下，线栓的硅胶部分（白色部分）会卡在前 cerebral 动脉（ACA）近端，位置比大脑中动脉（MCA）分支点远约2 mm。通常小鼠的ACA脑区不会受到影响，因为ACA会与对侧ACA汇合形成单一的无名ACA。受影响的动脉以灰色显示。左侧图中，在缺血期间颈总动脉（CCA）保持通畅，因此可向所有颈内动脉（ICA）分支供血，直至被线栓硅胶部分阻塞的大脑中动脉（MCA）。右侧图中，线栓位置相同，但缺血期间保持CCA结扎。由于后交通动脉（PcomA，绿色部分）在大多数情况下不通畅，若持续结扎CCA，卒中将非选择性地累及同侧半球的大部分区域，包括MCA、AchA、VTA、HTA和PCA。在这些情况下，由于脉络膜前动脉（PPA）受阻，还可观察到眼部急性梗死的体征（如白瞳症和瞳孔不等大）。图示使用BioRender.com制作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66720/66720fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案为研究人员提供了使用改良Longa颈外动脉法在小鼠上进行大脑中动脉阻塞手术的逐步操作指南。本文介绍的改良方法旨在提高大脑中动脉阻塞的准确性，并确保完全再灌注。

Longa 大脑中动脉阻塞法在完全再灌注中的优化

大脑中动脉闭塞模型是研究缺血性脑卒中的主要动物模型。尽管该模型已在研究中使用了三十多年……

欢迎观看我们关于小鼠短暂性大脑中动脉闭塞的视频指南。我是Rok Ister，本实验在萨格勒布大学医学院再生神经科学实验室进行。引言。短暂性大脑中动脉闭塞法（简称tMCAO）是目前最常用的缺血性脑卒中动物模型。该手术主要在啮齿类动物（如大鼠和小鼠）中进行。常用的两种手术方法——颈总动脉法和颈外动脉法，主要区别在于插入线栓的动脉切口位置。在本视频中，我们将介绍采用颈外动脉法时的一些改进措施及关键要点，以确保实现完全再灌注。从推荐的工具开始，您将需要两把Dumont 5号镊子、Dumont 7号镊子和Dumont N0型自闭合镊子，一把微型colibri牵开器，以及用于动脉切开的直显微弹簧剪刀。止血时，我们将使用两把血管显微夹及其相应的施夹器。手术剪、持针器和手术镊将用于切口的切开与缝合。在材料方面，我们将使用5/0单丝缝合线用于手术切口，6/0编织丝线用于动脉结扎，手术胶带用于固定动物，眼药膏凝胶用于保护动物眼睛，利多卡因凝胶用于额外的局部麻醉。最后，为引流多余血液，我们将使用尖头的纸巾条。体视手术显微镜对于此类显微外科手术至关重要。麻醉后的啮齿类动物容易发生低体温，因此我们将使用温度监测仪。在动物手术侧，您需要一个易于清洁的加热平台，同时配备麻醉气体输送管，以及在手术过程中可靠监测动物体温的方法。左侧桌面上还有我们将会用到的一些其他工具和材料。出于可重复性以及后续数据分析的考虑，测量操作流程中某些步骤的持续时间非常重要。使用聚维酮碘皮肤消毒剂和预装注射器以实现快速便捷的操作。使用动物毛发剪剃除动物体表的毛发。用于精确麻醉剂量的电子天平。最后，还需要一个动物气体麻醉系统，能够输送氮气-氧气混合气体（比例为2:1），以及一个用于诱导麻醉的麻醉诱导箱。本视频中展示的所有动物操作和实验程序均经萨格勒布大学医学院伦理许可委员会批准，并由经过培训且持有资质的人员执行。实验方案。动物及手术部位的准备。将动物置于加热的手术台上，并将其鼻子放入麻醉面罩中。在动物眼睛上涂抹眼膏，以保护其眼睛免受干燥和氟气使用的影响。将动物仰卧放置，并在其颈部下方垫一个小枕头（由手术胶带制成），以伸展其颈部。使用手术胶带固定动物的四肢，注意不要过度拉伸前肢，以免意外导致肩关节脱位。使用白色石油 jelly 润滑直肠探头，并将其插入直肠以持续监测体温。术前通过腹腔注射生理盐水和布托啡诺，以确保动物在手术过程中保持充分水化且无疼痛。使用无线动物剃毛器修剪颈部区域的毛发。使用手术胶带收集所有剃下的毛发。为使该区域完全无毛，可进一步用剃刀修整部位。在手术台上铺上干净的手术单。在动物剃毛后的皮肤上涂抹一滴碘伏。用棉签以画圈方式由内向外将消毒剂涂抹于皮肤表面。随后，用浸有乙醇的棉签重复相同操作。每次重复使用一对新的无菌棉签，共重复三次。在即将切开部位的已消毒区域涂抹少量利多卡因凝胶，以实现局部伤口镇痛。缺血诱导手术。使用手术刀在已消毒的皮肤上做初始切口时，应尽量减少切口次数，以利于手术伤口愈合。使用7号和5号镊子分离浅筋膜，并将唾液腺从下方组织中剥离。放置金属牵开器至初始位置时，需确保唾液腺不妨碍后续操作步骤。使用7号镊子去除深部颈筋膜，并将胸锁乳突肌从颈动脉区域分离，以重新定位牵开器。重新调整牵开器位置，使其置于胸锁乳突肌下方，以便暴露颈动脉区域。切除肩胛舌骨肌，以获得清晰的视野并更方便地进入颈动脉区域。捏住颈动脉三联体外侧的颈动脉筋膜，轻轻向外侧牵拉，以直观识别动脉、神经、静脉及所有周围的血管分支。使用7号弯头镊子将颈总动脉（CCA）下段与下方组织和筋膜完全分离，确保其已为后续夹闭操作做好准备。在颈总动脉及其两个分支均已仔细准备就绪后，用7号弯头镊子抬起颈外动脉（ECA），并用N0型自闭合镊子将其夹闭。在颈外动脉被N0型镊子牢固夹持的情况下，将两根编织丝线从颈外动脉后方穿过。完全系紧颅侧缝线，因其为永久性缝线，然后用剪刀剪去多余的缝线。将尾侧缝线打成一个松散的固定结。使用血管微夹夹闭颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA），以防止动脉切开后出血。使用微型弹簧剪刀，在ECA夹闭部位下方做一个小的动脉切口。将线栓沿与ECA成相同角度的方向，从动脉切口向CCA近端插入，使其穿过ECA分叉侧的松散固定结，并进入CCA管腔内。小心打开ICA微型夹，然后将其移除。将线栓部分插入颈外动脉（ECA）并固定后，进行完整的动脉切开，从而使带有MCAO线栓的ECA残端松脱。此时，松开N0型自闭合镊子并将其移除。用一对5号镊子牢固地夹住ECA残端，并轻轻提起。用另一把镊子夹住已部分插入的线栓，同时下拉并轻轻牵拉颈外动脉残端，使线栓的内端朝向颈内动脉。切勿夹住线栓的硅胶部分。缓慢推进大脑中动脉阻塞（MCAO）线栓，穿过Willis环，直至感觉到阻力突然增加。此时，重要的是观察尼龙线剩余的长度。在成年小鼠中，尼龙线应能从大脑中动脉（ICA）分叉点起顺畅推进至少七毫米。扎紧固定结，以确保在缺血期间尼龙线不会发生移位。移除 CCA 夹，并记录时间，此操作标志着缺血开始。移除牵开器钢丝，将手术切口边缘相互靠拢。让手术部位静置数秒钟，使组织恢复至解剖位置。使用胶带式伤口闭合器关闭手术切口，以便在缺血期后更快地重新打开伤口。缺血期。采用 MRI 或其他定量灌注测量方法验证手术成功。纤维牵出手术。移除固定胶带，用金属牵开器重新打开手术切口。使用N0型镊子夹住并向前下方牵拉颈外动脉残端边缘，使颈外动脉残端处于张力状态。再次使用大血管夹夹闭CCA。缓慢撤出MCAO栓线，直至栓线的硅胶部分开始从ECA残端露出。略微收紧固定结，为完全撤出栓线做好准备。当接近丝线的硅胶末端时，以单个操作收紧固定结，使MCAO丝线被推出，同时颈外动脉（ECA）残端被闭合。待丝线滑出后，完全收紧结。随后打开并移除夹闭镊子及颈总动脉（CCA）夹。从周围开始缝合手术切口，确保完全闭合伤口，无任何皮下组织外露。所需缝合针数取决于手术切口的大小。使用酒精擦拭片清洁并消毒手术部位。代表性结果。手术成功后，MRI 扫描结果应与此类似。术中在缺血期间，您应能在灌注加权图像上观察到边界清晰的缺血区域。表观扩散系数病灶应大致覆盖相同区域。术后撤出丝线后，在灌注加权图像上，理想情况下应观察到病灶核心区域的高灌注。除缺血核心外，病灶区域的ADC值应出现恢复并略有超调。术后第二天，病灶区域应完全再灌注。由于脑水肿，缺血病灶核心的ADC值应再次下降，这一点在T2像上也应可见。若为导丝引起的出血，则术后灌注成像和ADC图均不会出现改善。此外，在术中和术后T2图像上均可观察到明显的出血征象。结论：得益于近期对小鼠脑血管解剖结构的研究，我们能够根据新获得的知识对大脑中动脉阻塞（MCAO）模型进行调整和优化。后交通动脉（以绿色标示）在最常用的小鼠品系中仅有10%为双侧通畅。因此，可以依靠它们为大脑中动脉（MCA）近端的分支提供血流。因此，在缺血期间需要保持颈总动脉（CCA）通畅，且栓线的硅胶部分长度不应超过三毫米。希望本视频内容详实且简明扼要。感谢观看。

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Longa 大脑中动脉闭塞方法的优化

大脑中动脉闭塞（MCAO）的管腔内模型是实验性缺血性卒中模型中最常用的模型。本文将结合激光多普勒血流仪的引导，详细演示该模型的全部操作步骤及其典型结果。...

小鼠缺血性卒中激光多普勒血流仪引导下经腔内大脑中动脉阻塞（MCAO）模型

越来越多的证据表明，缺血预处理（PC）——即对脑组织施加一次非损伤性的缺血刺激——可对后续的致损伤性缺血攻击产生短暂的保护作用。我们在C57Bl6/J小鼠中建立了双侧颈总动脉阻断（BCCAO）作为预处理刺激，以诱导对短暂性局灶性脑缺血（由大脑中动脉阻断，MCAO引起）的早期缺血耐受（IT）。...

双侧颈总动脉阻断作为诱导局灶性脑缺血早期缺血耐受的充分预处理刺激

我们介绍一种高度可重复的啮齿类动物主要脑血管永久性闭塞的方法。该技术可实现极小的周围组织损伤、最少的失血量、较高的长期存活率，以及与人类临床人群相符的稳定梗死体积。...

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本方案描述了重复性缺氧预处理，即短暂暴露于全身性缺氧，可减少小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后脑梗死体积及血脑屏障的破坏。同时，本文还详细说明了脑卒中后脑梗死体积与血脑屏障破坏的双重定量方法，以评估神经血管保护作用的疗效。...

重复性缺氧预处理及小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后神经血管保护作用的量化

为了理解脑卒中的病理生理学机制，使用可靠的模型至关重要。本文将介绍小鼠中最常用的脑卒中模型之一，即大脑中动脉闭塞（MCAo）模型（也称为血管内丝线或缝线模型），并包含再灌注过程。...

小鼠大脑中动脉闭塞与再灌注诱导脑卒中的手术方法

我们描述了一种通过使用硅胶包被的缝合线阻塞大脑中动脉来诱导小鼠脑卒中的模型。该方案可用于诱导永久性阻塞，或诱导短暂性缺血后进行再灌注。...

采用大脑中动脉阻塞技术诱导小鼠缺血性卒中与缺血-再灌注及梗死区域的可视化

新生儿卒中是导致早期脑损伤的重要原因，需要建立具有稳定局灶性损伤模式和高可重复性的转化模型以开展相关研究。本研究详细描述了在足月等效啮齿类动物中建立非出血性单侧局灶性缺血-再灌注损伤的手术操作步骤。...

P10大鼠新生期脑卒中短暂性大脑中动脉阻塞模型

大脑中动脉内栓线阻塞是啮齿类动物实验性脑卒中最常用的体内模型。本文采用一种可实现颈总动脉修复的替代性外科手术方法，能够恢复颈总动脉的血流，并实现大脑中动脉供血区域的完全再灌注。...

小鼠经颈总动脉修复实现再灌注的中脑动脉闭塞模型

建立小鼠脑缺血-再灌注模型以研究中风的病理生理学机制。我们结扎右侧大脑中动脉远端和右侧颈总动脉，并在缺血10或40分钟后恢复血流。...

双血管阻断小鼠脑缺血-再灌注模型

本方案描述了通过大脑中动脉腔内阻塞建立小鼠短暂性局灶性脑缺血模型的方法。此外，还展示了使用磁共振成像和行为学测试进行结果评估的示例。...

短暂性大脑中动脉闭塞卒中模型

本方案描述了通过颈总动脉进行大脑中动脉闭塞再灌注的准备工作流程。...

一种改良的中动脉闭塞再灌注模型制备方法

学习优化的小鼠大脑中动脉闭塞手术方法，采用改良Longa颈外动脉入路技术，确保完全再灌注。该方案可提高缺血性中风研究的手术准确性与可重复性。

Longa 大脑中动脉阻塞法在完全再灌注中的优化

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