Longa 大脑中动脉闭塞方法的优化
2024年11月22日
该协议为研究人员提供了使用改良的 Longa 颈外动脉方法对小鼠进行大脑中动脉闭塞手术的分步指南。本文中介绍的改良旨在提高大脑中动脉闭塞的准确性并确保完全再灌注。
欢迎观看我们的小鼠短暂性大脑中动脉闭塞视频指南。我叫 Rok Ister，这个实验是在萨格勒布大学医学院的再生神经科学实验室进行的。短暂性大脑中动脉法，简称 tMCAO，是缺血性脑卒中最常用的动物模型。
它主要在啮齿动物中完成，例如大鼠和小鼠。两种主要的手术方法，颈总动脉和颈外动脉方法，主要区别在于细丝插入的动脉切开部位。在本视频中，我们将介绍我们的修改方法，以及使用颈外动脉入路确保完全再灌注的一些关键点。
从推荐的工具开始，您需要两把 Dumont 5 型镊子、Dumont 7 型镊子和 Dumont N0 型自闭合镊子、一个迷你 colibri 牵开器和用于动脉切开术的直微型弹簧剪刀。对于止血，我们将使用两片血管微夹和相应的涂抹器。手术剪刀、持针器和手术钳，我们将用于打开和闭合手术伤口。
对于材料，我们将使用 5/0 单丝缝合线用于手术伤口，使用 6/0 编织丝缝合线用于动脉结扎，用于固定动物的手术胶带，用于保护动物眼睛的眼膏凝胶，以及用于额外局部麻醉的利多卡因凝胶。最后，为了排出多余的血液，我们将使用尖头的纸巾。立体手术显微镜对于像这样的显微外科手术至关重要。
麻醉的啮齿动物容易体温过低，因此我们将使用温度监测器。在动物的操作侧，您需要一个易于清洁的加热表面，以及麻醉气体供应管，以及一种在手术过程中可靠监测动物体温的方法。在左边的桌子上，还有一些我们将要使用的工具和材料。
出于可重复性的原因，测量程序某些部分的持续时间以及以后的数据分析非常重要。Betadine 皮肤消毒剂和加载的注射器，使用方便快捷。用于剃除动物皮毛的动物毛发剪。
体重秤，对于正确给药很重要。最后，一种能够以 2:1 的比例输送氮气-氧气混合物的动物气体麻醉系统，以及用于麻醉诱导的敲除盒。本视频中介绍的所有动物处理和程序均已获得萨格勒布大学医学院道德许可委员会的批准，并由经过培训和持证的人员完成。协议。
动物和手术部位的准备。将动物放在加热的手术台上，并将其鼻子放入麻醉面罩中。将眼药膏涂抹在动物的眼睛上，以保护它们免受水合作用和使用氟气体的影响。
将动物仰卧，并在动物的脖子下方放置一个由手术胶带制成的小枕头来伸展它的脖子。使用手术胶带将动物的四肢固定到位。注意不要过度伸展前肢，以免无意中导致肩关节脱位。
用凡士林润滑直肠探头，并将其插入直肠进行连续体温测量。术前腹膜内注射生理盐水和丁丙诺啡，以保持动物水分充足，在手术过程中没有疼痛。使用无线动物剪在颈部区域塑造动物的皮毛。
使用手术胶带收集所有剃光的毛皮。要使该区域完全没有毛发，请另外使用剃须刀塑造该区域。将干净的手术单放在手术台上。
将一滴 Betadine 涂抹在动物剃光的皮肤上。使用棉签将消毒剂从内到外以圆周方式擦入皮肤。然后用浸有乙醇的棉签做同样的事情。
每次重复时，用一对新的无菌棉签重复此步骤 3 次。将少许利多卡因凝胶涂抹在未来切口部位的消毒区域，以进行局部伤口镇痛。缺血诱导手术。
使用手术刀在消毒后的皮肤上做一个初始切口，将皮肤切口的敲击次数保持在最低限度，以使手术伤口更容易愈合。使用 7 型和 5 型镊子撕开浅筋膜，并将唾液腺与下面的组织分离。将金属丝牵开器放在初始位置，同时确保唾液腺不会妨碍后续步骤。
使用 7 型镊子去除深颈筋膜，并从颈动脉区域分离胸锁乳突肌以重新定位牵开器。重新定位牵开器以到达胸锁乳突肌下方，以便进入颈动脉区域。切除舌骨肌，以便清晰、直观地接近颈动脉区域。
捏住颈动脉三联征外侧的颈动脉筋膜，轻轻向侧面拉动，以直观地识别动脉、神经、静脉和周围的所有血管分支。使用弯曲的 7 型镊子将 CCA 的下部从下面的组织和筋膜上完全分离，确保它准备好在未来的步骤中夹紧。将 CCA 与其两个各自的分支一起精心准备后，使用弯曲的 7 型镊子抬起 ECA，并用 N0 型自闭合镊子夹住 ECA 并用 N0 型镊子牢固固定，在 ECA 后面引入两条编织丝线。
完全系住颅线，因为它是永久性的，然后用剪刀剪掉多余的线。将尾线打成一个松散的固定结。使用血管微夹，夹住 CCA 和 ICA，以防止动脉切开术后出血。
使用微型弹簧剪刀，在 ECA 夹持部位正下方进行小型动脉切开术。以与 ECA 的角度匹配的角度，将细丝沿 CCA 近端方向插入动脉切开部位，穿过 ECA 分支侧的松散固定结，并与细丝一起插入 CCA 的管腔。小心地打开 ICA 微型夹，然后将其取下。
将细丝部分插入 ECA 并固定下来，进行完整的动脉切开术，从而使 ECA 残端松散，MCAO 细丝在里面。此时，松开 N0 型自闭合镊子，并将其取出。用一套 5 型镊子，用力捏住 ECA 残端，并稍微抬高。
在用另一把镊子抓住部分插入的细丝的同时，降低并轻轻拉动 ECA 残端，使细丝的内端朝向 ICA。切勿夹住灯丝的硅部分。慢慢地将 MCAO 细丝推进穿过 Circle of Willis，直到您感觉到阻力突然增加。
此时，观察细丝的剩余长度很重要。在成年小鼠中，细丝应毫不费力地从 ICA 分支点延伸至少 7 毫米。拧紧固定结，以确保细丝在缺血期间不会移位。
取下 CCA 夹，记下时间，这标志着缺血开始。取下导丝牵开器，使手术伤口的边缘彼此靠近。让手术部位停留几秒钟，让组织恢复到其解剖位置。
使用胶带伤口闭合闭合手术伤口，以促进缺血期后伤口更快地重新开放。缺血期。使用 MRI 或其他一些定量灌注测量方法验证手术是否成功。
细丝撤离手术。取下胶带缠绕闭合器，然后用导丝牵开器重新打开手术伤口。用 N0 型镊子，捏住并向腹侧拉动 ECA 残端的边缘，以施加 ECA 残端的张力。
再次用大血管夹夹住 CCA。慢慢抽出 MCAO 细丝，直到细丝的硅部分开始从 ECA 残端伸出。稍微收紧固定结，为完全抽出细丝做好准备。
当靠近细丝的硅端时，拧紧固定结，使其一次性推出 MCAO 细丝并关闭 ECA 残端。细丝滑出后，将结完全收紧。打开并取出捏合镊子和 CCA 夹。
从外围开始缝合手术伤口，从而完全闭合伤口，看不到任何底层组织。所需的缝合线数量取决于手术伤口的大小。使用外用酒精湿巾清洁和消毒手术部位。
代表性结果。手术成功后，MRI 扫描的结果应与此相似。在术中，在缺血期间，您应该能够在灌注加权图像上观察到缺血的清晰区域。
表观弥散系数病变应大致覆盖相同的区域。术后，在取出细丝后，理想情况下应在灌注加权图像上观察高灌注病灶核心。除缺血核心外，您应该会看到病变中 ADC 值的恢复和轻微超调。
手术后第二天，应完全再灌注病变。由于脑水肿，缺血病灶核心的 ADC 值应再次下降，这也应在 T2 图像上可见。在细导出血的情况下，术后灌注或 ADC 图未观察到改善。
此外，在术中和术后的 T2 图像上都可以观察到明显的出血迹象。结论。得益于最近对小鼠脑脉管系统的解剖学研究，我们能够根据新知识调整和修改我们的 MCAO 模型。后交通动脉涂成绿色，仅在 10% 的最常见小鼠品系中呈双侧通畅。
因此，可以依靠它们为 MCA 近端的分支提供血流。因此，在缺血期间需要保持 CCA 的专利性，并且细丝的硅部分长度不应超过 3 毫米。我们希望在此视频中提供信息量和简洁性。
感谢您的观看。
概述
本文介绍了一种详细的小鼠中大脑动脉闭塞（MCAO）程序协议，特别是使用改良的Longa外颈动脉方法。它旨在提高MCAO技术的准确性，确保完全的再灌注，这对缺血性中风研究至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 缺血性中风研究
- 啮齿动物模型中的外科技术
背景
- 短暂中大脑动脉闭塞（tMCAO）模型在缺血性中风研究中被广泛使用。
- 存在不同的方法，主要差异在于导丝插入的动脉切开部位。
- 理解这些技术对于准确的中风建模和有效的再灌注至关重要。
- 在萨格勒布大学进行的研究确保了动物实验的高道德标准。
研究目的
- 提供一个全面而精确的指南，用于有效地执行MCAO程序。
- 提出改进手术结果并促进完全再灌注的修改。
- 支持研究人员在中风研究中获得可重复的结果。
所用方法
- 该协议利用了一种涉及小鼠动脉切开和导丝插入的外科手术方法。
- 关键材料包括专门的外科工具和用于人道处理的麻醉。
- 讨论了重要的手术步骤和时间表，以提高程序的准确性。
- 关于动物准备和监测的细节对于成功执行至关重要。
主要结果
- 所描述的修改旨在显著降低不完全再灌注的风险。
- 外科技术旨在最大限度地减少组织损伤，同时确保对颈动脉的全面访问。
- 该方法增强了研究环境中中风建模的可靠性和可重复性。
- 有关处理和准备的关键见解对程序成功至关重要。
结论
- 本文建立了一个改进的协议，使MCAO研究获得更好的结果。
- 预计对程序的修改将促进对缺血性中风机制的更深入理解。
- 该研究有助于确保神经科学中的道德和有效的动物研究实践。
常见问题
Executive Industry Relevance
Standardization of the Longa middle cerebral artery occlusion (MCAO) model with complete reperfusion is critical for translational stroke research and preclinical validation of neuroprotective strategies. The ability to precisely control reperfusion onset and maintain uninterrupted perfusion in proximal branches enhances predictive confidence in modeling endovascular interventions. This refined protocol supports robust target validation and mechanistic de-risking at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of ischemic and reperfusion injury mechanisms in a controlled, reproducible setting.
- Supports functional validation of neurovascular targets by isolating the effects of complete reperfusion.
- Facilitates mechanistic de-risking by minimizing confounding variables related to incomplete reperfusion.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized in vivo platform for evaluating candidate neuroprotective compounds under clinically relevant reperfusion conditions.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment through MRI and perfusion-weighted imaging outputs.
- Enables reliable comparison of intervention efficacy across studies and research teams.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical stroke models with human endovascular thrombectomy scenarios for improved translational relevance.
- Supports biomarker discovery and validation by enabling precise temporal control of ischemia and reperfusion phases.
- Reduces translational risk by modeling sudden reperfusion and its biological consequences.
Pipeline & Workflow Integration
This optimized MCAO protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies with translational validation of therapeutic hypotheses.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on neurovascular injury and repair mechanisms under controlled reperfusion.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative endpoints for compound efficacy assessment using imaging-based readouts.
- Analytics: Provides robust perfusion and diffusion metrics for cross-condition and cross-study comparisons.
- Translational Research: Models clinically relevant reperfusion dynamics, supporting biomarker and therapeutic alignment with human stroke interventions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable in vivo platform for ongoing neurovascular research and portfolio triage.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurovascular target validation.
- Operational Value: Promotes reproducibility, standardization, and scalability across research teams and studies.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neuroprotective candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of stroke therapeutics with translational fidelity.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise and access to advanced imaging modalities for quantitative validation.
- Demands precise intraoperative monitoring and standardized animal handling protocols.
- Necessitates cross-team alignment on procedural timing and perfusion assessment criteria.
- Adaptation to different rodent strains may require protocol adjustments based on vascular anatomy.
- Limitations include potential variability in reperfusion outcomes if procedural steps are not rigorously controlled.
