Name: 将 Naegleria gruberi rDNA 的分子克隆转染到 N. gruberi 滋养体中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 了解Naegleria gruberi滋养体的分子克隆转染方法，通过CERE元件实现稳定转染并在多次传代中维持。该方案为研究Naegleria属物种的CERE分子动力学奠定了基础。

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这些研究部分由克瑞顿大学George F. Haddix基金（KMD）资助。图1在biorender.com中生成，图3在benchling.com中生成。

本研究中使用的物种、试剂和设备的详细信息列在材料表中。17,004个碱基对的pGRUB构建体序列见补充文件1。
1. 滋养体培养
<ol>
	<li>将冻存的 N. gruberi 滋养体在 37 °C 下解冻 3 分钟。</li>
	<li>将滋养体接种至 T25 培养瓶中，使用含 10% 胎牛血清的改良蛋白胨/酵母提取物/核酸/叶酸/血红素（PYNFH）培养基，并添加 2% 缓冲液（磷酸氢二钠、磷酸二氢钾）。</li>
	<li>在 25 °C 下培养滋养体，直至汇合度达约 80%，此时细胞呈现阿米巴样形态（图 2A）。 
	注意：初次从冻存状态复苏滋养体培养物时，T25 培养瓶可能需要 5–7 天才能达到完全汇合。每 3–4 天倾去培养基，并更换新鲜培养基。</li>
	<li>将汇合的培养瓶置于冰上 5–10 分钟，以使贴壁的滋养体从塑料表面脱落。轻轻摇晃培养瓶，使残留的贴壁细胞松动。此时滋养体呈现“圆缩”形态（图 2B）。</li>
	<li>按 1:2 至 1:4 的比例将培养物传代至新的组织培养瓶中。</li>
	<li>去除 PYNFH 培养基，更换为无菌包囊培养基（120 mM 氯化钠、0.03 mM 氯化镁、1 mM 磷酸氢二钠、1 mM 磷酸二氢钾、0.03 mM 氯化钙、0.02 mM 氯化铁，pH 6.8）22，以诱导 N. gruberi 形成包囊。 
	注意：大多数滋养体在 72 小时内完成包囊（图 2C）。脱囊过程应在 72 小时内完成。</li>
	<li>从培养瓶中收集包囊，在 20 °C 下以 600 × g 离心 10 分钟，然后将包囊重悬于含 10% 胎牛血清的 PYNFH 培养基中，以诱导细胞脱囊。在 25 °C 下孵育 24 小时，直至滋养体开始出现。</li>
</ol>
2. 转染滋养体
<ol>
	<li>将滋养体接种于6孔平底组织培养板中（每孔1 mL，浓度为1 × 106 个滋养体/mL），在25 °C条件下培养。</li>
	<li>当细胞生长至70%–80%汇合度时（6孔板中约为10.4 × 104 个细胞/cm2）进行转染。使用前将转染试剂恢复至室温。</li>
	<li>按如下方法配制质粒-转染试剂混合物：在200 µL不含FBS的PYNFH培养基中加入75 ng质粒DNA和0.225 µL转染试剂。为保证重复实验，需配制足够的质粒-转染试剂混合物以进行双份转染。 
	注：本研究使用含有N. gruberi CERE全长克隆的细菌质粒（pGRUB）。空质粒（pGEM）作为阴性对照（图3）。</li>
	<li>将质粒-转染试剂混合物于室温孵育10分钟。</li>
	<li>转染前，从滋养体单层中移除约800 µL培养基。</li>
	<li>将质粒-转染试剂混合物加入滋养体中。</li>
	<li>每隔15分钟轻轻摇动培养板，防止培养基在板边缘聚集。</li>
	<li>在25&#160;°C孵育1小时后，用2 mL生长培养基洗涤单层细胞一次。</li>
	<li>加入含10 U DNase的1 mL 10倍浓度DNase缓冲液，在37 °C处理15分钟以去除残留质粒DNA，随后用生长培养基洗涤一次，加入2 mL新鲜培养基，并置于25°C培养24–36小时。</li>
	<li>将培养板置于冰上10分钟，以释放细胞。</li>
	<li>将一个孔的细胞按1:2比例传代至两个&#160;新孔中。</li>
	<li>收集其余孔中的滋养体用于后续实验。 
	注：所有培养均设双重复。每种条件下，一个孔用于传代，另一个孔用于CERE分离。</li>
</ol>
3. 从 Naegleria中分离CERE
<ol>
	<li>通过台盼蓝排斥染色法和血细胞计数板计算用于CERE分离的每个孔中滋养体的数量23.</li>
	<li>将滋养体置于 2.0 mL 离心管中。</li>
	<li>用 100 mM 氯化钠（pH 7.5）洗涤滋养体一次 通过 离心（600 × g） g，10 分钟，4 &#176;C) 
	注意：氯化钠可防止滋养体黏附在试管壁上。</li>
	<li>移除上清液，并将细胞沉淀重悬于 100 &#181;100 mM EDTA（pH 7.5）的 L</li>
	<li>将试管置于98℃的加热块中，持续15分钟&#160;&#176;C 以裂解细胞并灭活滋养体中的酶。 
	注意：此步骤可灭活大量存在的DNase 纳格里虫 滋养体。DNase 可能会干扰在第 4 步中对天然 CERE 及其分子克隆的检测。当细胞数量超过约 3 × 10⁶ 时，DNA 产量会降低。6 第3.4步中使用细胞。</li>
	<li>将离心管以最高速度（16,000 x g) 在 4&#160;&#176;C离心10分钟以沉淀碎片。</li>
	<li>将上清液转移至新的离心管中。</li>
	<li>用0.5体积的7.5 M醋酸铵（pH 7.5）、3体积的无水乙醇和1体积的……对上清液进行乙醇沉淀 &#181;10 mg/mL 糖原溶液，用作载体。</li>
	<li>将试管颠倒数次，然后将试管置于 -80&#160;&#176;C，至少持续1&#160;小时或过夜。</li>
	<li>将样品 warming 至室温。</li>
	<li>在室温下以16,000 x g离心试管10分钟 g.</li>
	<li>移去上清液，加入70%乙醇重悬沉淀，于16,000 x g离心5分钟 g （室温下）</li>
	<li>去除乙醇，将沉淀物在空气中干燥5分钟。</li>
	<li>将干燥的沉淀重悬于无菌去离子水（DI 水）中。调整体积至每微升含 10,000 个滋养体， &#181;L.</li>
	<li>-80 保存&#160;&#176;C，直至用于 PCR。</li>
</ol>
4. 转化滋养体的PCR检测
<ol>
	<li>使用 20,000 个细胞当量的 DNA、600 nM 引物（表 1）以及 Taq 聚合酶进行 PCR24。 
	注：用于区分天然 CERE 与克隆 CERE 的引物列于 表 1，PCR 条件亦列于其中。图 3 显示了引物在构建体上的位置。PCR 需根据所用引物及特定的 PCR 混合液进行优化。</li>
	<li>将 0.8% 琼脂糖溶于 1×Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液中，微波加热至琼脂糖完全溶解。</li>
	<li>将琼脂糖溶液在室温下冷却至约 50 °C。</li>
	<li>将溶液倒入含有梳子的凝胶制备槽中，形成加样孔。</li>
	<li>让凝胶在室温下静置至完全凝固。</li>
	<li>将凝胶放入电泳装置中。</li>
	<li>向电泳槽中倾入 1×TAE 缓冲液，直至完全浸没凝胶。</li>
	<li>移去梳子。</li>
	<li>向样品中加入 6×上样染料（0.25% 溴酚蓝、0.25% 茜素蓝、30% 甘油），混匀后上样。使用 DNA 分子量标记物确定 PCR 产物的大小。</li>
	<li>连接电极，开启电源，以 80 V 电压电泳约 1.5–2 小时。</li>
	<li>关闭电源，取出凝胶。</li>
	<li>将凝胶置于 100 mL 去离子水中，加入 DNA 染料（例如 10 mg/mL 溴化乙锭 10 µL）染色 10 分钟。</li>
	<li>用去离子水脱色 20 分钟。</li>
	<li>在紫外（UV）成像系统下观察凝胶并记录结果。</li>
</ol>

Using a CERE-Based Vector for Transfection of Naegleria gruberi Trophozoites

<ol><li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+we+know+by+now+about+the+genus+Naegleria%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">What do we know by now about the genus Naegleria.</a> Exp Parasitol. 145, Suppl S2-S9 (2014).</li>
<li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+research+on+the+Amoeboflagellate+genus+Naegleria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Protozool%22%5BJournal%5D)">A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria.</a> Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).</li>
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<li>Nguyen, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+the+closed+circular+extrachromosomal+element+%28CERE%29+of+Naegleria+pringsheimi+De+Jonckheere+%28strain+Singh%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Resource+Announce%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of the closed circular extrachromosomal element (CERE) of Naegleria pringsheimi De Jonckheere (strain Singh).</a> Microbiol Resource Announce. 13 (4), (2024).</li>
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</ol>

未声明任何财务利益冲突。

本文所述方案非常直接，但每种构建体可能都需要一定程度的优化，特别是DNA与转染试剂的比例，这取决于构建体的性质以及所用Naegleria的物种。我们仅使用了一种市售的转染试剂对该方案进行了测试，但很可能其他多种试剂也有效。由于使用了包含功能性复制起点并因此能够自主复制的CERE全长克隆，该构建体具备所有必要的真核复制机制。如果将部分克隆插入pGEM载体，则预测转染后的克隆在转染后很快就会丢失，除非其含有功能性真核复制起点，这一点与空pGEM载体类似（图2B）。此外，这些数据表明，原核DNA的存在不会干扰分子克隆被滋养体保留的能力。
尽管已有研究报道过对N. gruberi滋养体进行转染的案例25，但本研究所使用的插入片段明显更大（约17 kbp），远大于先前研究中转染的片段（&#60;1 kbp）。目前尚不清楚Naegleria能够耐受的最大质粒大小，但我们实验室的未发表数据显示，另一属（Willaertia）的阿米巴含有大小约为24 kbp的CERE。
确保本方案能够检测到滋养体中DNA的关键步骤是DNase处理步骤（步骤2.9），该步骤可消除培养物中残留的DNA（即未转染的DNA）。为确保本方案的完整性，进行了若干质量控制程序：首先，对构建体进行了测序；其次，对PCR产物也进行了测序，以确认其身份，确保检测过程中无污染，并证实PCR产物并非由引物错配所致。
尽管已成功实现了带有真核生物复制起点的质粒转染，但从图4可以明显看出，在滋养体传代一次后，PCR信号有所减弱。对转染后的滋养体进行随时间推移的qPCR检测发现，pGRUB质粒的拷贝数从第1代的约1,600拷贝下降至第7代的35拷贝（数据未显示），表明转染的质粒可能在接下来的数次传代过程中逐渐丢失。这一结果并不意外，因为转染的质粒对滋养体而言属于外源DNA，可能被视为对阿米巴生存无必要甚至有害的物质。
关于Naegleria的CERE，目前存在基本的知识空白。GenBank中大多数CERE序列均为部分序列，主要集中在rDNA和内转录间隔区（ITS）区域，这些区域用于鉴定属（ITS1）和种（ITS2）1,26,27。尽管Naegleria sp.之间的rDNA亚基序列高度保守，但Naegleria sp.的NRS在大小和序列上差异极大，长度范围约为5.5 kbp至10 kbp1,15,16,17,18,19,20。Naegleria中NRS的功能尚属未充分探索的领域，但推测其包含调控元件，包括但不限于复制起点、启动子和终止序列17。根据GenBank中完整的CERE序列，Naegleria CERE的一个共同特征是在NRS中存在富含A-T的重复区域。这些区域的功能目前尚不清楚。
转染Naegleria滋养体的能力使得研究CERE NRS生物学的多个方面成为可能，特别是CERE复制的动态过程及其所需条件。在Escherichia coli中，已在某些基因的启动子区域鉴定出G-四链体结构28。G-四链体结构也在包括小鼠、大鼠、人类及非人灵长类在内的多种真核生物的启动子区域中被发现29。对多个不同全长CERE序列进行的in silico分析表明，NRS的多个区域被预测可形成G-四链体结构。在多种Naegleria sp.的NRS中，一个预测存在G-四链体结构的区域位于18S基因起始位置的上游。转染滋养体的能力将有助于通过删除或突变rDNA上游序列，探索鉴定Naegleria CERE中rDNA启动子区域的研究。同样，也可开展类似研究以鉴定终止rDNA转录的序列。
在多次传代过程中，滋养体中完整长度的CERE得以保留，这将有助于研究确定NRS中实现CERE复制所需的最小区域。尽管已有研究鉴定出CERE中一个区域为推测的复制起点20，但尚不清楚该区域之外的二级结构是否为CERE复制所必需，也不清楚该区域是否可被显著截短而仍保持复制起点（ori）的功能。NRS中的重复元件存在于迄今为止测序的所有Naegleria sp.中15,16,17,18,19,20，但这些序列的功能目前尚不清楚。它们是否作为调控元件存在，或若被删除后CERE是否仍能在滋养体中复制，这些问题仍未明确。这些重复序列在Naegleria属中具有物种特异性，但一个物种的序列是否能在另一物种中发挥功能尚属未知。总之，关于CERE生物学仍存在大量未解问题，而本文所述技术现可为这些问题的研究提供途径。

Naegleria 属包含超过 45 个物种，尽管目前可能尚未鉴定出该属的所有成员1。Naegleria 可以以不同形态存在：滋养体（阿米巴）、鞭毛体，或在资源严重受限时以包囊形式存在1,2,3,4。Naegleria 属因其一个特别危险的物种——Naegleria fowleri 而广为人知，该物种被称为“食脑阿米巴”（综述见1,2,3,4,5,6,7），是几乎无一幸免的原发性阿米巴脑膜脑炎的致病原因。
Naegleria 将其核糖体DNA（rDNA）编码在位于核仁中的CERE上。对三种Naegleria物种基因组的完整测序证实，其核基因组中不存在rDNA8,9,10,11。根据目前有限的全长CERE序列数据，CERE的长度范围约为10 kbp至18 kbp。每种Naegleria物种的每个细胞约含有4,000个CERE，每个CERE携带一个rDNA顺反子（包含5.8S、18S和28S核糖体DNA）12,13,14。除rDNA外，每个CERE还含有一段较长的非rDNA序列（NRS）。不同物种间的CERE大小存在差异，这种差异主要源于NRS长度的变化，而rDNA序列在该属中高度保守1,15,16,17,18,19,20。N. gruberi CERE的NRS区域内已定位到单一的DNA复制起点21，这为Naegleria CERE独立于核基因组进行复制的假说提供了有力支持。
N. gruberi 是一种常用于研究的非致病性阿米巴 纳格里虫 生物学。我们开发了一种用于转化的实验方法 N. gruberi 同一物种的CERE克隆滋养体，以验证该假设 纳格里虫 阿米巴原虫在滋养体内容忍并独立复制CERE。这是通过转化实现的 N. gruberi 全长克隆 N. gruberi 将CERE转化为滋养体，并通过聚合酶链式反应（PCR）追踪供体CERE克隆的命运。该方案的总体概述如下所示： 图1本文展示的数据表明，供体克隆在组织培养中至少可检测到连续七次传代，并能通过包囊和脱囊过程得以维持。这些研究为解析CERE复制机制以及探索其作为转染载体的应用提供了基础。 纳格里虫.

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>Bio Rad</td><td>161-3102</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7330</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-4901</td><td></td></tr><tr><td>碎冰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养瓶，T-75</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>培养板，6孔</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-4527</td><td></td></tr><tr><td>EDTA，0.5 M</td><td>Affymetrix</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>电泳凝胶装置</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6052-45</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管，1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管，2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，100%</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-8751</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>叶酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876-25G</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>加热金属块</td><td>Thermo Scientific</td><td>88871001</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>血红素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51280</td><td></td></tr><tr><td>氯化铁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>372870-256</td><td></td></tr><tr><td>连接酶</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>MySpin 12</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N. gruberi&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>30224</td><td></td></tr><tr><td>核酸</td><td>Chem Impex Int&amp;rsquo;l</td><td>#01625</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>pGEM</td><td>Promega</td><td>P2251</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC 电泳电源装置</td><td>Bio Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>MCB Reagents</td><td>SX0420</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝，0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>ViaFect 转染试剂</td><td>Promega</td><td>E4981</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Denver Instruments</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Gibco</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

将 naegleria gruberi rdna 的分子克隆转染入 n. gruberi 滋养体

Transfection of a Molecular Clone of Naegleria gruberi rDNA into N. gruberi Trophozoites

所有Naegleria滋养体的核糖体基因均维持在一个闭合环状的染色体外核糖体DNA（rDNA）包含元件（CERE）中。尽管目前对CERE了解甚少，但对三种Naegleria物种进行的完整基因组序列分析明确表明，其核基因组中不存在rDNA顺反子。此外，在N. gruberi的CERE中已定位到单一的DNA复制起点，支持了CERE独立于核基因组进行复制的假说。这一CERE特性提示，有可能利用工程化CERE将外源蛋白导入Naegleria滋养体中。作为探索CERE在Naegleria中作为载体应用的第一步，我们建立了一种将克隆至pGEM7zf+载体中的N. gruberi CERE分子克隆（pGRUB）转染N. gruberi的实验方案。转染后，pGRUB在N. gruberi滋养体中至少连续传代七次仍可被检测到，并且能够通过包囊和脱囊过程稳定存在。作为对照，将不含N. gruberi序列的骨架载体pGEM7zf+（pGEM）转染滋养体。转染进入N. gruberi后，pGEM在第一次传代后即无法检测到，表明其不能在真核生物中复制。这些研究描述了一种针对Naegleria滋养体的转染方案，并证明pGRUB中的细菌质粒序列并不影响转染后CERE克隆在细胞内的成功转染与复制。此外，该转染方案对于确定驱动CERE在滋养体中复制所需的最小序列，以及鉴定非核糖体序列（NRS）中的调控区域将至关重要。

对转染了pGRUB质粒的滋养体进行PCR检测表明，转染的CERE在滋养体连续传代至少七代的过程中均能被检测到，且在包囊和脱囊过程中也保持存在（图4）。PCR所用引物针对pGEM载体和CERE序列进行设计，从而确保PCR不会扩增出内源性CERE。将pGEM转染滋养体后进行PCR检测显示结果为阴性（图4），表明空质粒未被阿米巴保留。图4显示，pGEM在第一代传代后即已丢失，后续各代、包囊及脱囊过程的检测结果均为阴性。
<img alt="滋养体培养、转染、分离和PCR流程图；微生物学方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig01v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：转染实验流程图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="变形虫样和球形细胞的显微镜图像；在10 µm尺度下的细胞形态比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：N. gruberi（NEG-M 菌株）滋养体在培养中的形态。（A）在 25 °C 的标准培养条件下，N. gruberi 滋养体呈阿米巴样形态，并贴附于培养瓶/板上。箭头指示用于推动滋养体定向移动的伪足。（B）将 N. gruberi 培养物置于冰上孵育后，滋养体变为圆形且不再贴壁。（C）在包囊诱导培养基中孵育 24–48 小时后，N. gruberi 滋养体形成包囊。比例尺：10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="pGEM-7Zf(+) 和 pGRUB 质粒图谱示意图，显示启动子、基因和序列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：用于转染 N. gruberi (NEG-M) 的 pGRUB 构建体。 将 N. gruberi（EBM 菌株，14,007 bp；红色）的全长 CERE 克隆至 pGEM7Zf(+)（2,997 bp；绿色）中，获得一个长度为 17,004 bp 的重组质粒。各质粒上的箭头表示 PCR 引物的位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果，DNA分离，条带模式分析，pGRUB与pGEM比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：检测转染至N. gruberi滋养体的pGRUB和pGEM的PCR结果。 PCR结果显示，pGRUB在转染后的滋养体中至少可维持七个传代，并经历包囊（En）和脱囊（Ex）过程；而pGEM在滋养体第一次传代后即丢失。P1 = 第1代，P7 = 第7代。阴性对照（neg）在PCR中未加入DNA，阳性对照（pos）则为直接加入PCR的pGRUB或pGEM质粒。预期扩增产物大小分别为656 bp（pGRUB）和337 bp（pGEM）。图A左侧的数值表示DNA分子量标记中最亮条带的大小。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物名称</td>
			<td colspan="2">序列 - 5'-&gt;3'</td>
			<td>Tm</td>
			<td>产品规格</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-正向引物</td>
			<td colspan="2">CTCTTCGCTATTACGCCAGC</td>
			<td>54</td>
			<td>337 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM-反向</td>
			<td colspan="2">TTGTGTGGAATTGTGAGCGG</td>
			<td></td>
			<td>337 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGRUB-正向引物</td>
			<td colspan="2">AGCCCCCGATTTAGAGCTTG</td>
			<td>60.5</td>
			<td>656 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGRUB-反向</td>
			<td colspan="2">TCGGCTAGAAATGAAGTGAGGAC</td>
			<td></td>
			<td>656 bp</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本研究中使用的PCR引物及反应条件。
补充文件1：17,040碱基对pGRUB构建体的序列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种转染方法 Naegleria gruberi 滋养体携带一种在连续传代过程中保持稳定的构建体 体外以及通过包囊化和脱囊过程。

将 Naegleria gruberi rDNA 的分子克隆转染入 N. gruberi 滋养体

所有核糖体基因在福氏耐格里变形虫滋养体中均保留在一种闭合环状染色体外核糖体DNA（rDNA）含元件（CERE）中。而……

本研究是理解闭合环状染色体外核糖体DNA元件（CERE）中哪些序列对于其复制至关重要，以及阐明CERE的DNA复制机制的第一步。本实验方案填补了目前对CERE在格氏耐格里变形虫（naegleria gruberi）中传播机制及其有效传播所需元件认知上的空白。我们的实验方案提供了一种简约的耐格里变形虫转染方法，旨在减少可能干扰细胞正常状态的操作步骤。因此，本研究探讨了CERE在格氏耐格里变形虫（naegleria gruberi）中的传播机制，以及CERE中哪些组分对其有效传播至关重要。我们已证实，不同耐格里虫（naegleria）物种含有独特的CERE，其序列长度和核苷酸组成均存在差异。本研究旨在为分析耐格里虫属内各物种CERE的分子动态特征奠定基础。我们的研究结果为进一步探究CERE复制所需的组分以及ORI是否可用于在棘阿米巴属物种中扩增外源构建体等问题奠定了基础。我们计划将研究拓展至棘阿米巴属的其他物种，以阐明CERE在种内水平的转染特性。首先，将冻存的格氏棘阿米巴滋养体置于37°C下孵育3分钟。将滋养体在 PYNFH 培养基中于 25 摄氏度培养至约 80% 汇合。将汇合的培养瓶置于冰上 5 至 10 分钟，以使贴壁的滋养体从塑料表面脱落。然后轻轻摇晃培养瓶，使残留的贴壁细胞脱落。用无菌包囊培养基替换原有培养基，以诱导格氏耐格里原虫细胞形成包囊。48小时后，从培养瓶中收集包囊。在4°C条件下，以600×g离心10分钟，收集包囊。离心后，将包囊重悬于含有10%胎牛血清的2毫升PYNFH培养基中，以诱导细胞脱囊。于25°C孵育包囊72小时，直至滋养体孵出并达到80%汇合度。转染滋养体时，先将1毫升滋养体接种至6孔平底组织培养板中。接下来，将质粒转染试剂混合物在室温下孵育10分钟。在转染前，从滋养体单层中吸出约800微升培养基。然后向滋养体中加入200微升质粒转染试剂混合物。每15分钟轻轻摇晃培养板一次，以防止培养基在板边缘聚集并干燥。一小时后，将10单位的DNAs加入1毫升10X DNAs缓冲液中，并将其添加至各孔中。将培养板在37°C下孵育15分钟，以去除残留的质粒DNA。现在用一毫升培养基将培养板洗涤一次，然后加入两毫升新鲜培养基。将培养板置于25°C条件下孵育24至36小时。孵育完成后，将一个孔中的内容物以1:2的比例分装至新培养板中。随后收集其余孔中的滋养体用于进一步分析。在标准培养条件下，格氏耐格里变形虫（Naegleria gruberi）滋养体呈阿米巴样形态，并贴附于培养瓶壁生长。冰上孵育后，滋养体呈圆形且不贴壁。在包囊培养基中孵育滋养体可使其形成包囊。首先，向含有转染的格氏耐格里变形虫滋养体的试管中加入200微升100毫摩尔的氯化钠溶液。在4°C条件下，以600G离心10分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于100微升100毫摩尔EDTA中。将离心管置于98°C的加热块中15分钟，以裂解细胞。将离心管在4°C、最大转速下离心10分钟，以沉淀杂质。将上清液转移至新的离心管中。接着，向上清液中加入0.5倍体积的乙酸铵、3倍体积的无水乙醇以及1微升的糖原。将离心管颠倒数次以混匀，然后在零下80摄氏度条件下孵育30分钟或过夜。孵育结束后，在室温下以16,000G离心10分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀物，加入200微升70%乙醇洗涤沉淀，随后再次离心。将干燥的沉淀重悬于无菌去离子水中，调整滋养体密度至每微升10,000个滋养体。用针对转染DNA的特异性引物进行PCR并检测转化后的滋养体后，向CERE样品中加入2微升6X上样缓冲液。然后将加样后的样品上样至0.8%琼脂糖凝胶中。电泳1.5至2小时后，将凝胶置于含有100毫升去离子水的DNA染料中孵育。将染色后的凝胶转移至去离子水中浸泡20分钟以脱色。使用紫外光成像系统观察凝胶并记录结果。PCR 分析显示，pGRUB 在转染的滋养体中至少经过七次传代后仍可被检测到。pGEM 在第一次传代后即丢失，表明空质粒未被阿米巴保留。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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将 Naegleria gruberi rDNA 的分子克隆转染入 N. gruberi 滋养体

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