Name: 体外共培养系统以重现癌症免疫循环 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学习体外共培养系统以重现癌症免疫循环，利用多参数流式细胞术和肿瘤芯片模型监测肿瘤微环境中癌细胞与免疫细胞的相互作用。该方法为研究免疫监视与免疫逃逸机制提供了简单、快速且可靠的低成本方案。

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A.S. 由 AIRC（IG #28807）和 PRIN（#P2022YE2MX）资助。M.M. 由 AIRC-FIRC 奖学金（#25558）资助。A.D.N. 由欧盟—下一代欧盟 PNRR 任务4 组件2 投资1.5 资助的创新生态系统罗马技术园区 ECS00000024 资助。

Flow Cytometry-Based Monitoring of Cancer-Immunity Cycle 

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer-immunity+cycle%3A+Indication%2C+genotype%2C+and+immunotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.</a> Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).</li>
<li>Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+privilege+of+cancer+stem+cells%3A+A+key+to+understanding+tumor+immune+escape+and+therapy+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure.</a> Cells. 10 (9), 2361(2021).</li>
<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+Es+of+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The three Es of cancer immunoediting.</a> Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).</li>
<li>Musella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+promote+cancer+cell+stemness+by+triggering+the+epigenetic+regulator+KDM1B%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B.</a> Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+immune+resistance+archetypes+in+solid+cancer+to+inform+next-generation+anticancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies.</a> J Immunother Cancer. 11 (6), e006533(2023).</li>
<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
<li>Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+cancer+cell+immunogenicity+and+antigen-specific+T-cell+cytotoxicity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Front Mol Biosci. 7, 612801(2020).</li>
<li>Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+automated+cytometry+in+the+new+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy.</a> Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).</li>
<li>Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+of+cytometry+practices+for+immuno-oncology%3A+A+multifaceted+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge.</a> Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).</li>
<li>Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cancer+models%3A+One+step+closer+to+in+vitro+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">3D cancer models: One step closer to in vitro human studies.</a> Front Immunol. 14, 1175503(2023).</li>
<li>De Ninno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+models+for+dissecting+the+immune+response+in+in+vitro+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments.</a> JoVE. (170), e61895(2021).</li>
<li>Mattei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoimmunology+meets+organs-on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Oncoimmunology meets organs-on-chip.</a> Front Mol Biosci. 8, 627454(2021).</li>
<li>Businaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+between+cancer+and+immune+cells%3A+exploring+complex+dynamics+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).</li>
<li>Vacchelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+antitumor+immunity+requires+formyl+peptide+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1.</a> Science. 350 (6263), 972-978 (2015).</li>
<li>Maulana, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocompetent+cancer-on-chip+models+to+assess+immuno-oncology+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).</li>
<li>Lorenzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+control+antigen+retention+and+survival+of+CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+after+uptake+of+tumor+apoptotic+cells+leading+to+cross-priming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming.</a> J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).</li>
<li>Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+assessment+of+dendritic+cell-mediated+uptake+of+cancer+cell+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies.</a> Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).</li>
<li>Lucarini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Type+I+Interferons+and+5-Aza-2%27-Deoxycitidine+to+improve+antitumor+response+against+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma.</a> J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).</li>
<li>Gutiérrez-Martínez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+cell-associated+antigens+by+MHC+Class+I+in+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets.</a> Front Immunol. 6, 363(2015).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+spatial+omics+in+dissecting+tumour+microenvironment+and+the+role+of+AI%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI.</a> Front Oncol. 13, 1172314(2023).</li>
<li>Lewis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics+and+multiplexed+imaging+to+explore+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology.</a> Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).</li>
<li>Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics%3A+Navigating+to+the+golden+era+of+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research.</a> Clin Transl Med. 12 (1), 696(2022).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).</li>
<li>Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+flow+cytometry+automated+data+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Current trends in flow cytometry automated data analysis software.</a> Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).</li>
<li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+in+oncoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

监测抗肿瘤免疫反应对于阐明和理解肿瘤微环境（TME）中复杂的分子与细胞相互作用及其所维持的持续性优势争夺至关重要23。本文详细介绍了一种基于多重流式细胞术（mFC）和时间分辨细胞分析（ToC）的简便方案，用于监测和表征构成癌症-免疫循环的各个步骤。通过微小调整，该方案可从依赖小鼠细胞系和小鼠来源免疫细胞的体系，拓展应用于人类永生化细胞系乃至原代肿瘤细胞系，以及人外周血来源的免疫细胞。此外，结合特定信号通路的遗传学或药理学抑制方法及其相应的适当对照，本方案可用于鉴定调控免疫监视的关键生物标志物，从而预测对免疫原性治疗和免疫治疗的响应情况。
多色流式细胞术（mFC）能够高通量分析多种免疫参数，兼具在短时间内分析数百万个细胞的能力，并可识别稀有事件、评估细胞增殖与细胞死亡、在少量样本中同时检测多个参数，且可在基于荧光的细胞分选后进行下游分子和功能分析9。这些优势加上较低的成本，促进了mFC在科研和临床实验室中的普及与广泛应用。然而，仍存在一些重要局限性。首先，mFC分析在样本制备过程中需要将组织解离为单细胞悬液，从而破坏了肿瘤组织的空间信息。过去十年间空间技术的发展，包括高通量空间转录组学、蛋白质组学和表观基因组学，使我们能够通过分析癌细胞、免疫细胞和基质细胞的位置及其相互作用，更全面地描绘肿瘤微环境（TME）24。其次，mFC一次仅能检测约十六个（或更少）参数，因此无法在单一样本中涵盖所有细胞鉴定、成熟和活化状态的标志物。而上述前沿技术则能够在单细胞甚至亚细胞分辨率下，同时检测多达上百个参数25,26,27。第三，纵向和比较研究中的免疫监测需要可重复的实验方案，以及对包括数据采集和分析在内的每一步流程进行标准化。传统的手动设门具有主观性，且仪器维护和质量检查可能存在差异，从而影响数据挖掘与结果解读。自动化采集及数据处理插件的应用有助于最大限度减少数据变异性28。
ToCs 因其能够紧密模拟肿瘤微环境（TME）的多种特征，并在某些实验条件下至少部分替代传统模型，正在癌症研究中受到广泛关注 体内 肿瘤12尽管类器官模型在模拟肿瘤组织结构、多细胞复杂性以及肿瘤微环境（TME）中各细胞成分之间的动态相互作用方面提供了较为真实的体系，但仍无法完全替代动物实验，特别是在反映系统性免疫应答的复杂性方面，例如癌症-免疫循环各步骤中限速环节产生的相关机制仍难以充分再现。12,29除了这一方面，肿瘤免疫学领域将继续受益于ToCs的应用，因为科学研究创新的轮次和速度正使其日益接近 体内 模型12.
总之，本文所述方案是一种强大且简便的分析与发现工具，可用于揭示肿瘤微环境（TME）的动态复杂性。此外，该方案在时间和成本方面的优势使其具备大规模应用的可行性。未来面临的挑战是将其标准化，以用于临床，从而为癌症患者的治疗决策提供更精准的指导。

在过去几十年中，免疫治疗一直处于癌症治疗前沿方案的最前列。利用免疫系统实现抗肿瘤目的，已在多种历来预后较差的血液系统恶性肿瘤和实体瘤中为患者带来显著获益，提供了强有力的原理验证。随着免疫治疗为原本难以治疗的癌症带来了新的希望，其发展正以前所未有的速度快速推进。这一进展至少在一定程度上归因于人们对癌细胞与免疫细胞之间相互作用机制的深入理解。这种相互作用类似于一种正反馈循环 &#34;发动机&#34; 免疫系统被激活以摧毁癌细胞，即所谓的癌症-免疫循环。这一抗肿瘤免疫反应可分为三个主要阶段：识别、加工和反应。首先，在识别阶段，肿瘤形成过程中产生的肿瘤抗原（Ags）由肿瘤微环境（TME，步骤1）中死亡的癌细胞释放，并被肿瘤浸润的树突状细胞（DCs，步骤2）吞噬。接着，在加工阶段，DCs通过主要组织相容性复合体（MHC）分子在其表面呈递所捕获的肿瘤抗原表位，同时表达更高水平的共刺激分子（步骤3），并迁移至肿瘤引流淋巴结（dLNs），将抗原交叉呈递给初始CD8 T细胞（CD8N，步骤4）。所有这些步骤最终汇聚于反应的最后阶段，在此过程中产生针对肿瘤抗原特异性的交叉启动的CD8 T细胞（CD8C-P) 活化后，分化为效应性 CD8 T（CD8E) 细胞，并经历克隆扩增（步骤5）。CD8E 细胞随后离开dLNs，通过血液迁移至肿瘤微环境（步骤6），在此通过其T细胞受体（TCR）与相应的肿瘤抗原（Ags）相互作用，特异性识别并结合癌细胞，释放细胞毒性分子[即，干扰素（IFN）-γ、穿孔素和颗粒酶（Grzs）] 并杀伤癌细胞（步骤7）1,2癌细胞的杀伤会导致更多肿瘤抗原的释放，从而推动癌症-免疫循环。事实上，在上述所有步骤中，免疫系统摧毁并清除癌细胞的频率远高于以往预期。然而，在癌症患者体内，至少其中一个步骤无法正常发挥作用。我们及其他研究者发现，癌细胞会通过演化为更具侵袭性且具有免疫豁免特性的变体，以试图抑制免疫应答3,4,5 或削弱T细胞的有效性6,7.
癌症研究和抗癌药物开发均依赖于能够研究癌症与免疫细胞之间关系的实验模型，即所谓的肿瘤免疫学。本文描述了快速、可靠、可重复且低成本的 体外 能够全面再现肿瘤免疫学循环各个步骤的模型，并可快速清晰地展示免疫监视及最终免疫编辑的表型与功能特征谱。
多参数流式细胞术（mFC）是基础癌症研究、癌症诊断以及癌症临床试验转化研究中最成功的单细胞分析工具之一。由于能够同时捕获每个细胞的多个特征，mFC 已成为肿瘤免疫学领域的金标准分析平台。该技术结合了高灵敏度与高特异性，可从肿瘤微环境（TME）来源的异质性甚至异型细胞悬液中，快速、可重复地在单细胞水平上检测多种蛋白质表达模式及功能特性8,9,10。由于表型和功能表达模式均具有时间敏感性，因此在实验设计、合适抗体组合的选择、对照设置、滴定抗体的使用，以及样本处理和仪器操作等方面均需谨慎，这对结果的可靠性、可比性和可重复性至关重要，也是准确解读实验结果的前提11。
肿瘤芯片微流控装置（ToCs）通过模拟肿瘤微环境（TME） 体外 癌症与免疫细胞动态及其相互作用的微尺度仿生研究12,13,14,15具体而言，ToCs 是一种多通道微流控细胞培养装置，能够容纳以二维（2D）或三维（3D）培养环境组织的多种细胞类型，并可高保真、高精度地模拟和控制肿瘤微环境（TME）中生理存在的关键结构与功能单元，例如异型细胞相互作用和化学梯度的流动。12,13,14,15特别是免疫细胞的趋化作用、运动轨迹以及免疫细胞与癌细胞的相互作用，可通过延时显微成像和自动追踪分析进行实时监测与定量。5,12,13,14,15,16此外，类器官肿瘤模型（ToCs）为分析和操控调控癌症发生、发展及治疗反应的关键过程提供了可能17.
本文结合使用微流控芯片（mFC）与肿瘤类器官（ToCs），研究抗癌免疫反应的各个阶段，包括树突状细胞（DC）介导的肿瘤抗原（Ags）吞噬作用（步骤1-3）、T细胞交叉呈递（步骤4）、活化及克隆扩增（后者采用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）与铜(I)催化环加成反应[“点击”化学技术]，该方法具有高灵敏度与高准确性，步骤5）、CD8E细胞向肿瘤微环境（TME）的归巢（步骤6），以及最终的CD8E细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用（步骤7，图1）。
本研究致力于建立简单、快速且可靠的标准化方案，以研究癌症-免疫循环。将微流控芯片（mFC）和肿瘤类器官芯片（ToC）模型改进并整合到癌症研究、肿瘤微环境（TME）动态变化及治疗反应中，具有广阔前景，因为这些模型在提供生物学保真度的同时兼具实验可控性。因此，本方案通过逐步重现癌症-免疫循环，使研究人员能够对天然和获得性免疫监视过程中各免疫细胞组分的作用及其相互作用进行表征、监测和及时调控。这最终将有助于优化、减少并替代动物实验，同时为战胜肿瘤和指导临床诊疗提供关键见解。最后，本文还批判性地讨论并比较了mFC和ToC模型的优势与局限性，并将其与前沿技术（例如，单细胞甚至亚细胞分辨率下的高通量空间分析）进行对比，以推动肿瘤免疫学研究与治疗的发展。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>100 kV 电子束光刻</td><td>Vistec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Euroclone</td><td>&amp;nbsp;ET3012</td><td></td></tr><tr><td>15 和 50 mL 离心管</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>352096; 352070</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞筛网&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯管&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>120180</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞筛网&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 细胞培养处理烧瓶</td><td>Euroclone</td><td>&amp;nbsp;ET7076</td><td></td></tr><tr><td>吸水擦拭布</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD107a (LAMP-1) 抗体</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-319</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD25 (7D4) 抗体&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-678</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD3 (17A2) 抗体</td><td>BioLegend</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>Aptes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Plus 固定/透化溶液试剂盒（含 BD GolgiPlug）</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>BD GolgiPlug 蛋白转运抑制剂（含布雷菲德菌素 A）</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>BD GolgiStop 蛋白转运抑制剂（含莫能菌素）</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>US Biological, Salem</td><td>A1312</td><td></td></tr><tr><td>CD11c 单克隆抗体 (N418)</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) 单克隆抗体 (17B5)</td><td>eBioscience</td><td>17-1371-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3 单克隆抗体 (17A2)</td><td>eBioscience</td><td>25-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>CD44 单克隆抗体 (IM7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>CD45 单克隆抗体 (30-F11)</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4528</td><td></td></tr><tr><td>CD69 单克隆抗体 (H1.2F3)</td><td>eBioscience</td><td>48-0691-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8a 单克隆抗体 (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8a 单克隆抗体 (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD95 (APO-1/Fas) 单克隆抗体 (15A7)</td><td>eBioscience</td><td>53-0951-82</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>Kova International</td><td>87144E</td><td></td></tr><tr><td>铬石英掩模</td><td>MB W&amp;amp;A, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 流式细胞术检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>C10635</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX 流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>死细胞去除试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液 (D-PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4053L</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10.0.7</td><td>Flowjo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>颗粒酶 B 单克隆抗体 (NGZB)</td><td>eBioscience</td><td>12-8898-82</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加湿细胞培养孵育箱 (37&amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>制冰机</td><td>Brema Ice Makers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IFN-γ 单克隆抗体 (XMG1.2)</td><td>eBioscience</td><td>11-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator CC 2015</td><td>Adobe Systems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte 2022A 软件</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte 细胞毒性染料（用于死细胞计数）</td><td>Sartorius</td><td>4632</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte SX5 活细胞分析系统&amp;nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JuLi Smart 荧光活细胞成像显微镜</td><td>Bulldog Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室冰箱 (4&amp;deg;C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室生物安全柜（II 级）</td><td>Angelantoni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>EuroClone</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>MACS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201; 130-042-401&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-10; 130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MCA205 小鼠纤维肉瘤细胞系</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC173</td><td></td></tr><tr><td>配备 II 级生物安全柜的微生物控制动物设施</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 21R 微型离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002552</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel&amp;nbsp;</td><td>Microsoft, Redmond&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠：C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>小鼠初始 CD8a+ T 细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-543</td><td></td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ts2</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学光刻</td><td>EVG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素 G 钠盐和硫酸链霉素</td><td>EuroClone</td><td>ECB3001D/1</td><td></td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td><td>&amp;nbsp;4-000-201</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PKH67 荧光细胞连接试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH67GL-1KT</td><td>荧光细胞连接&amp;nbsp; 试剂盒</td></tr><tr><td>塑料盖玻片</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Thermo Scientific</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>反应离子刻蚀系统</td><td>Oxford plasmalab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>罗斯韦尔帕克纪念研究所 1640 培养基 (RPMI 1640)</td><td>EuroClone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管 (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td><td>Corning- Millipore-Sigma; St. Louis,&lt;br/&gt; MO</td><td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489</td><td></td></tr><tr><td>SL 16 离心机系列</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004031</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术刀、手术镊、剪刀和钳子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌吸头 (1&amp;ndash;10 &amp;mu;L, 20&amp;ndash;200 &amp;mu;L, 1000 &amp;mu;L)</td><td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td><td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3000 系列</td><td>MicroChem corp, Newton, (MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一套皮肤活检穿孔器</td><td>Kai Medical, Tedpella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dowsil, Dow Corning</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>TCR β 单克隆抗体 (H57-597)</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>恒温水浴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>计时器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMCS&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92360</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染色液 (0.4%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>含酚红的胰蛋白酶-EDTA</td><td>EuroClone</td><td>ECM0920</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

体外共培养系统重现癌症-免疫循环

Co-Culture In Vitro Systems to Reproduce the Cancer-Immunity Cycle

基础癌症研究以及有效反击疗法的开发均依赖于详细描述癌症细胞与免疫细胞相互作用的实验研究，即所谓的癌症-免疫循环。体外共培养系统结合多参数流式细胞术（mFC）和芯片上肿瘤微流控装置（ToCs），能够简便、快速且可靠地监测和表征癌症-免疫循环的每一步骤，有助于揭示介导癌症免疫监视与免疫逃逸之间平衡转变的关键机制。深入理解癌症细胞与免疫细胞之间的动态相互作用，可为战胜肿瘤提供关键见解，并加速患者个体化治疗策略的优化进程。本文具体介绍了一种简便的、基于mFC和ToC的技术方案，用于解析小鼠癌细胞系与小鼠来源免疫细胞中癌症-免疫循环各阶段的动态复杂性，并聚焦于免疫监视过程。鉴于该方案在时间和成本方面的优势，其具备大规模应用的可行性。此外，通过少量调整，该方案还可适用于人源癌细胞系和人外周血来源免疫细胞，并可结合特定信号通路的遗传学和/或药理学抑制，以鉴定免疫应答的生物标志物。

CD11c 的功能+ 树突状细胞（DCs），一种以交叉提呈功能著称的吞噬细胞亚群21,22 如图所示进行门控 图2A，通过mFC评估了吞噬先前用PKH67荧光细胞连接剂标记的经UV照射的MCA205肿瘤细胞所产生的凋亡小体的能力。正如预期，CD11c+ DCs 高效捕获了凋亡的 MCA205 细胞 体外 在 37 °C 但不在 4 °C (图2B，癌症-免疫循环的步骤1-3）。为了进一步表征树突状细胞（DC）在摄取肿瘤抗原后的成熟状态，检测并比较了DC在吞噬前后共刺激分子和免疫检查点配体分子的表面表达水平（DCN 和树突状细胞吞噬作用，分别）。DC吞噬作用 细胞表现出CD86和MHC-II水平显著升高，同时PDL1水平降低（图2C，癌症-免疫循环的第4步）。此外，CD8 T细胞在被树突状细胞交叉呈递激活后发生的克隆扩增吞噬作用 (CD8C-P通过评估EdU胸苷类似物的掺入情况（癌症-免疫循环的第5步）来检测。通过正确圈选活的CD3+CD8+ T细胞（图 3A)，发现约20%的CD8C-P，代表表达CD95分子并携带肿瘤抗原特异性TCR的克隆（补充图1)，与初始CD8 T细胞（CD8N, 图3B）。通过使用 ToC 模型（图3C)，评估了CD8C-P 通过癌细胞释放的警报素（alarmins）进行感应并产生趋化反应，从而模拟肿瘤特异性CD8 T细胞向肿瘤微环境（TME）的归巢过程（癌症-免疫循环的第6步）。具体而言，采用ToCs系统以实现并追踪非黏附性免疫细胞与位于肿瘤腔内的黏附性癌细胞之间的化学和物理性吸引及相互作用，其中免疫细胞从免疫腔向肿瘤腔迁移。共培养后不同时间点拍摄的显微照片显示，CD8 T细胞逐步发生迁移C-P 穿过微通道趋向癌细胞（图3C值得注意的是，免疫细胞在24 h、48 h和72 h时均能稳定且高效地与癌细胞相互作用（图3D最后，分析了CD8的反应C-P 归巢至肿瘤微环境，并由癌细胞呈递的抗原（CD8E通过mFC评估早期CD69的表面表达水平补充图 2ACD44 和 CD25 晚期图4A) 活化标志物，以及CD137的膜表达图4B）和 CD107a（补充图 2B与CD8相比的肿瘤反应性标志物N 和 CD8C-P （癌症-免疫循环的第7步）。我们还评估了细胞内毒性分子Grz-B的产生情况图 5A）和 IFN-γ（图5B）。有趣的是，所有这些标志物的水平均随着时间推移而逐步显著升高，并在共培养72 h时达到表达高峰，呈现出晚期且有效的活化特征。相应地，与之特异性共培养的MCA205细胞表现出显著水平的CD8E介导的细胞死亡，通过活细胞分析系统和mFC分析揭示（图6).
<img alt="癌症免疫治疗过程示意图；细胞培养、mFC分析、肿瘤反应性、延时研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：研究癌症-免疫循环的实验方案概览。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同温度下流式细胞术分析、细胞形态图、活力、PKH67表达。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：树突状细胞介导的癌细胞抗原摄取与呈递。（A）树突状细胞多色流式细胞术（mFC）分析的设门策略。在mFC数据采集和分析过程中，样本依次设门：（1）通过绘制FSC-A与SSC-A区分细胞形态；（2）通过绘制FSC-A与FSC-H区分单细胞；（3）通过绘制近红外（Near-IR）与SSC-A评估细胞活力。最后对活细胞分析特异性表面标志物CD11c。（B）CD11c+树突状细胞在37 °C和4 °C条件下吞噬经PKH67标记并接受紫外线照射的MCA205癌细胞凋亡小体能力的mFC分析（癌症-免疫循环的步骤1-3）。代表性双参数图及直方图显示CD11c+P KH67+细胞百分比（均值±标准误，含单个数据点，展示的是三次独立实验中的一次代表性结果）。（C）树突状细胞在吞噬前后（分别为DCN和DCPHAGO）共刺激分子及免疫检查点配体表面分子的mFC分析（癌症-免疫循环的步骤4）。直方图表示CD11c+CD86+、CD11c+MHC-II+和CD11c+PDL1+细胞的百分比（均值±标准误及单个数据点，n = 3次独立实验）。（B）采用Welch校正的非配对双尾Student's t-检验，与4 °C组比较。（C）采用非配对双尾Student's t-检验，与DCN组比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析、EdU 掺入、微室装置、肿瘤-免疫相互作用、T 细胞追踪。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：交叉启动后 CD8 T 细胞的增殖及其向癌细胞的迁移。（A）CD3+CD8+ T 细胞分析的设门策略。在微流控流式细胞术（mFC）数据采集和分析过程中，样本依次设门：（1）通过绘制 FSC-A 与 SSC-A 来筛选形态正常的细胞；（2）通过绘制 FSC-A 与 FSC-H 来排除双联体，筛选单细胞；（3）通过绘制 Aqua 与 SSC-A 来评估细胞活力。最后对活细胞进行特异性 EdU 增殖染色分析。（B）利用 EdU 技术对 CD8 T 细胞克隆扩增进行 mFC 分析（癌症-免疫循环的第 5 步）。单参数直方图显示了增殖中的 EdU+ 初始 CD8 T 细胞和交叉启动的 CD8 T 细胞（分别为 CD8N 和 CD8C-P）的百分比（均值 ± 标准误，显示单个数据点，为三次独立实验中的一次代表性结果）。（C,D）CD8 T 细胞归巢至肿瘤微环境（TME）的“器官芯片”（ToC）微流控模型（癌症-免疫循环的第 6 步）。（C）ToC 的示意图平面结构。两个侧翼培养室分别容纳免疫细胞和癌细胞，通过微米级通道（宽度 = 12 µm，长度 = 10 µm，高度 = 10 µm）相连。细胞培养区的尺寸为宽 1 mm、长 8 mm、高 100 µm。延时记录生成的显微图像显示 CD8C-P 向癌细胞迁移的过程（时间范围为 0–72 小时；比例尺，100 µm）。（D）图示在 24–72 小时内，单个 CD8C-P（每组条件 n = 100 个细胞）向靶向癌细胞（黑色斑点）迁移的轨迹（比例尺，10 µm）。（A）采用未配对双侧 Student's t-检验（Welch 校正），与 CD8N 组比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图谱显示CD8 T细胞活化及CD25/CD137标志物；比较柱状图与统计学数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：经活癌细胞再次刺激后CD8 T细胞对肿瘤的反应性。（A）通过癌细胞呈递的抗原（CD8E）再次刺激CD8 T细胞后，在72小时内检测其表面CD44和CD25活化标志物表达水平的多色流式细胞术（mFC）分析（癌症免疫循环的第7步）。代表性双参数图和直方图显示在48小时和72小时时CD8N、CD8C-P、CD8E中CD44+CD25+ CD8 T细胞的百分比（均值 ± 标准误及单个数据点，n = 3次独立实验）。（B）CD8E细胞膜上肿瘤反应性标志物CD137表达的mFC分析。代表性双参数图和直方图显示在48小时和72小时时CD8N、CD8C-P、CD8E中CD137+ CD8 T细胞的百分比（均值 ± 标准误及单个数据点，展示的是三次实验中一次的代表性结果）。（A、B）采用普通单因素方差分析（one-way ANOVA）检验，随后进行Bonferroni校正，与CD8N组比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CD8 T细胞分析：流式细胞术直方图，GrzB、IFN-γ表达；比较柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：CD8 T细胞产生Grz-B和IFN-γ。（A）CD8E细胞内Grz-B表达水平的多色流式细胞术（mFC）分析（癌症-免疫循环的第7步）。代表性直方图显示在48 h和72 h时CD8N、CD8C-P、CD8E中Grz-B+ CD8 T细胞的MFI（均值±标准误及单个数据点，n = 3次独立实验）。（B）CD8E细胞内IFN-γ的mFC分析。代表性直方图显示在48 h和72 h时CD8N、CD8C-P、CD8E中IFN-γ+ CD8 T细胞的百分比（均值±标准误及单个数据点，n = 3次独立实验）。（A、B）采用普通单因素方差分析（one-way ANOVA）检验，随后进行Bonferroni校正，与CD8N组比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术分析，PI染色，MCA205，CD8ₑ；细胞活力，细胞毒性比较结果，图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：CD8 T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。（A）共培养72小时后（癌症-免疫循环的第7步），由CD8E诱导的CD45−细胞死亡的mFC分析。直方图表示死亡PI+CD45−细胞的百分比（均值 ± 标准误及单个数据点，n = 3次独立实验）。（B）CD8E介导的癌细胞死亡的活细胞分析。代表性图像及图表显示 dying 和 dead 癌细胞对Cytotox Red的摄取情况（展示的是三次实验中的一次代表性结果）。（A）采用未配对双尾Student's t检验，与单独癌细胞组（CTR）比较。（B）采用双尾Mann-Whitney检验，与CTR组比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：直方图显示CD95+TCR-β+ CD8N 和 CD8C-P 的MFI。采用非配对双侧Student t 检验与CD8N 进行比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%201_revised.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 2：CD8 T 细胞活化。（A）CD8E 上早期活化标志物 CD69 表面表达水平的 mFC 分析（癌症-免疫循环的第 7 步）。代表性双参数图及直方图显示在 48 h 和 72 h 时 CD8N、CD8C-P、CD8E 中 CD69+ CD8 T 细胞百分比（均值 ± 标准误及单个数据点，为三次实验中的一次代表性结果）。（B）CD8E 上溶酶体相关蛋白 CD107a 膜表达的 mFC 分析。代表性双参数图及直方图显示在 48 h 和 72 h 时 CD8N、CD8C-P、CD8E 中 CD107a+ CD8 T 细胞百分比（均值 ± 标准误及单个数据点，为三次实验中的一次代表性结果）。（A、B）采用普通单因素方差分析（ANOVA）检验，随后进行 Bonferroni 校正，与 CD8N 组比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%202_revised%20.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 1：抗体混合物，步骤 3.3.2。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文详细介绍了一种简单、快速且可靠的多参数流式细胞术联合肿瘤芯片辅助的实验方案，用于监测和表征构成癌症-免疫循环的各个步骤。事实上，深入理解癌症细胞与免疫细胞之间的相互作用，对于破解肿瘤免疫机制、指导临床诊疗具有重要意义。

基础癌症研究以及有效反击疗法的开发均依赖于详细描述癌细胞与...之间相互作用的实验研究。

本方案可对癌症免疫循环的每一步进行简单、快速且可靠的监测与表征，从而有助于识别维持癌症免疫监视与免疫逃逸之间平衡的关键机制。肿瘤微环境中癌细胞与免疫细胞之间的相互作用及其共进化，已被认为是决定治疗效果的关键因素。目前，多种技术正在推动本领域的研究进展，包括流式细胞术、单细胞转录组学、空间转录组学、蛋白质组学、芯片上肿瘤模型以及体内模型。本方案相较于其他技术具有显著优势，可提供一种简单、快速、可靠且低成本的方法，用于监测和表征癌症免疫循环的每一步骤。未来，我们希望研究免疫原性治疗和免疫治疗条件下肿瘤微环境的动态变化。首先，在100毫米的培养皿中，将3×10⁶个MCA 205纤维肉瘤细胞接种于10毫升完全生长培养基中。用紫外线照射细胞，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育至少6小时，以诱导细胞死亡。将体外分化的树突状细胞（DCs）用完全生长培养基在1,100 G条件下离心4分钟，洗涤两次。使用台盼蓝染色排除法计数骨髓来源的MDDCs。将辐照后的癌细胞在1,100 G条件下离心5分钟。以2:1的比例在12孔板中设置MDDC与辐照后凋亡细胞的共培养体系，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。次日，在15毫升离心管中用10毫升完全培养基以1,100 G离心5分钟，洗涤细胞两次。进行细胞表面染色时，将骨髓来源的树突状细胞重悬于20 µL预冷的FACS缓冲液中，在4°C避光孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞后，加入100 µL含活力可固定近红外染料的PBS，孵育30分钟。用PBS洗涤细胞一次，然后将细胞重悬于FACS缓冲液中。根据前向散射（FSCA）和侧向散射（SSCA）特性识别目标细胞。随后，绘制FSCA与前向散射高度（FSCH）以排除细胞双联体和细胞团块。绘制780至60纳米发射带通滤光片面积与SSCA以去除死细胞。使用575至26纳米和530至30纳米的发射带通滤光片，在双参数密度图中检测细胞对CD11c标记物和PKH67荧光细胞连接剂的阳性率。计数后，将CD8 T细胞与摄取凋亡MCA 205细胞的骨髓来源树突状细胞以2:5:1的比例在37°C和5%二氧化碳条件下共培养72小时。向共培养体系中加入EdU，使其终浓度为10 µmol/L，孵育16至20小时。将CD8交叉引物在4°C避光条件下，用预冷的FACS缓冲液重悬，于1,100 ×g离心两次，每次5分钟，并在冷FACS缓冲液中染色表面标志物，染色时间为20分钟。用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次后，将细胞重悬于 100 微升含活力可固定蓝色染料的 PBS 中，孵育 30 分钟。用 3 毫升含 1% BSA 的 PBS 在流式管中洗涤细胞悬液一次。加入 100 微升 4% 多聚甲醛，固定细胞 15 分钟。将细胞在100 µL皂苷类通透和洗涤试剂中孵育15分钟。加入500 µL反应混合液，在避光条件下孵育30分钟。洗涤后，将细胞重悬于100 µL皂苷类通透和洗涤试剂中。根据细胞的FSCA和SSCA特性识别目标细胞。然后，绘制FSCA与FSCH以排除细胞双联体和团块对分析的干扰。绘制525至50纳米发射带通滤光片面积与SSCA以去除死细胞。使用530至30纳米和575至26纳米发射带通滤光片密度图，检测细胞对CD8a和CD3的阳性表达。使用660至620纳米带通发射滤光片，通过单参数直方图分析Alexa Fluor 647标记的EdU掺入情况。CD11c阳性的树突状细胞在37摄氏度下有效吞噬了凋亡的MCA 205癌细胞，表明在癌症免疫早期循环阶段存在温度依赖性的吞噬作用。吞噬作用后，树突状细胞表现出CD86和MHC II类分子水平升高，同时PDL1水平降低。一旦被成熟的树突状细胞激活，CD8+ T细胞的克隆扩增明显，增殖率约为20%。利用肿瘤芯片模型，观察到这些T细胞对癌细胞释放的警报素产生的趋化反应。从共培养物中回收CD8交叉引物后，将其在10毫升完全生长培养基中以1,100 G离心10分钟。将一千万个总细胞重悬于100微升死细胞去除微珠中，在室温下孵育15分钟。将分离柱置于磁性分离器中，并用结合缓冲液冲洗。将细胞悬液转移至分离柱中，收集穿流液。洗涤柱子后，收集未标记的穿柱细胞，并与先前收集的穿流液合并。在完全培养基中，将富集的活CD8交叉呈递细胞以1,100 ×g离心5分钟。计数后，按2:1的比例将CD8交叉呈递细胞与新鲜的MCA 205细胞共同接种于12孔板中，在37°C、5% CO₂条件下培养72小时。在收获CD8效应细胞前，向肿瘤免疫细胞共培养体系中加入莫能菌素和布雷菲德菌素，共同孵育6小时。然后，收集CD8效应细胞，于1,100 G离心两次，每次5分钟。将细胞重悬于三种不同的冷FACS缓冲液配制的一抗混合液中，4°C避光孵育20分钟。向来自混合液C的细胞悬液中加入100微升固定液，4°C避光孵育20分钟。将细胞重悬于预冷的洗涤缓冲液中，在4°C下孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次后，向细胞沉淀中加入含活力可固定Aqua染料的100 µL PBS，孵育30分钟。根据细胞的FSCA和SSCA特性鉴定目标细胞。然后，绘制FSCA与FSCH以排除细胞双联体和细胞团块。利用525至50纳米发射带通滤光片与SSCA，去除死细胞。使用660至20纳米和780至60纳米发射带通滤光片，在双参数密度图中检测细胞CD8a和CD3的阳性表达。分别对混合物 A、B 和 C 进一步分析细胞的 CD44、CD25 和 CD69 标记物，以及 CD137 标记物和干扰素γ阳性细胞与颗粒酶 B。对于肿瘤杀伤实验，在共培养体系中加入实时细胞死亡定量染料。将培养板置于活细胞分析系统中升温至 37°C 后，每两小时进行一次数据扫描，持续最长 72 小时。将细胞在1,000 G条件下离心两次，每次5分钟。用20 µL冷FACS缓冲液对细胞进行表面标志物染色，并在4°C避光孵育20分钟。然后加入活力染料碘化丙啶，用于细胞门控策略的染色。根据细胞的FSCA和SSCA特性识别目标细胞。然后，绘制FSCA与FSCH以排除细胞双联体和细胞团块对分析的干扰。使用450至50纳米的发射带通滤光片检测CD45阴性的癌细胞。在单参数直方图中，使用610至620纳米带通发射滤光片，通过平均荧光强度分析细胞对碘化丙啶的摄取情况。通过多参数流式细胞术检测，早期活化标志物CD69、晚期活化标志物CD44和CD25、膜表面CD137以及CD107a肿瘤反应性标志物的表达水平均得到增强。细胞内细胞毒性分子颗粒酶B和干扰素γ阳性水平随时间进行性且显著升高，在共培养72小时时达到表达峰值。同源共培养的MCA 205细胞经历了显著水平的CD8效应细胞介导的死亡。

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体外共培养系统以重现癌症免疫循环

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学习体外共培养系统以重现癌症免疫循环，利用多参数流式细胞术和肿瘤芯片模型监测肿瘤微环境中癌细胞与免疫细胞的相互作用。该方法为研究免疫监视与免疫逃逸机制提供了简单、快速且可靠的低成本方案。

体外共培养系统重现癌症-免疫循环

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