Name: 通过原位肝灌注评估小鼠胰岛素清除率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 了解原位肝灌注技术在小鼠模型中直接评估肝脏胰岛素清除率的方法。该方案通过门静脉和肝下下腔静脉插管灌注，为研究代谢性疾病和肝脏功能提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作得到国家自然科学基金（82200948、82270921、82170882）的支持。

本方案经南京医科大学动物护理与使用委员会（IACUC-2105018）批准，并遵循机构动物护理与使用委员会的指导方针。所有C57BL/6N小鼠均在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，并可自由获取食物和水。6周龄小鼠被随机分为普通饮食（CD）组和高脂饮食（HFD）组。HFD组小鼠饲喂含60%脂肪的高脂饮食，并持续该饮食至10周龄。HFD组平均体重为28.55 g ± 1.2 g，对照组为24.3 g ± 0.48 g。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于 材料清单.
1. 准备
<ol>
	<li>通过高压灭菌对手术器械和耗材进行必要的灭菌处理。</li>
	<li>将手术器械、6-0 丝线、无菌小棉签、氯化钠注射液（500 mL）、棉签和纱布正确放置于手术台上。</li>
	<li>配制 30 mL 肝素化生理盐水，终浓度为 200 IU/mL。</li>
	<li>准备两根硅胶管，内径为 0.31 mm，外径为 0.64 mm；其中一根长 4 cm，用作门静脉导管，另一根长 10 cm，用作下腔静脉导管。</li>
	<li>配制含有 5.0 mmol/L 葡萄糖和 0.25% BSA 的 Krebs-Henseleit（KRBH）灌注缓冲液。</li>
	<li>配制含有 5.0 mmol/L 葡萄糖、0.25% BSA 和 4.0 ng/mL 人胰岛素的 Krebs-Henseleit（KRBH）灌注缓冲液。</li>
	<li>搭建肝脏灌注系统。图 1 显示了肝脏灌注系统的主要组成部分。</li>
</ol>
2. 外科导管插入术
<ol>
	<li>按照以下步骤配制麻醉混合液：
	<ol>
		<li>将 Zoletil 50（250 mg/5 mL）用 0.9% 氯化钠溶液稀释 10 倍。</li>
		<li>将盐酸赛拉嗪（200 mg/2 mL）用0.9%氯化钠溶液稀释10倍。</li>
		<li>将0.5% Zoletil 50溶液与1% Xylazine hydrochloride溶液按1:1比例混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉小鼠。
	<ol>
		<li>检查并记录小鼠的体重。给予麻醉混合物 通过 腹腔注射，剂量为5 mL/kg体重（2.5 mg/mL Zoletil 50；5 mg/mL Xylazine hydrochloride）。麻醉通常在注射后5–10分钟内起效，表现为翻正反射消失及对外界刺激反应减弱。</li>
		<li>将小鼠转移至手术台，使用胶带固定四肢。按2.5 U/g剂量经腹腔注射肝素，以实现肝素化。</li>
		<li>使用电动剃须刀修剪腹部皮肤上的毛发，并用聚维酮碘溶液对该区域进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行门静脉插管。
	<ol>
		<li>沿腹部中线从下腹部向剑突方向做一条4 cm的纵向切口。用剪刀小心切开腹膜，避免损伤内脏器官。插入小鼠腹部牵开器以暴露手术视野。</li>
		<li>将肠管移向右侧，以暴露门静脉、右肾和下腔静脉（图2A）。使用动脉钳夹闭肾脏上缘的下腔静脉。</li>
		<li>分离门静脉（图2A）并用6-0丝线结扎远端。在暴露血管的近端用另一根缝线 loosely 结扎。</li>
		<li>在结扎端附近用弹簧剪做一个切口，并插入导管。将导管经切口推进至门静脉分叉水平。</li>
		<li>将两根结扎线固定在导管周围，并通过将导管的游离端连接至采样注射器来确认采样正确。用肝素化生理盐水冲洗导管，并夹闭导管（图2C).</li>
		<li>移除牵引装置并复位肠管。用浸有生理盐水的无菌纱布或棉垫覆盖手术区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行肝上段下腔静脉插管。
	<ol>
		<li>沿胸骨从剑突处做一切口，暴露胸骨。</li>
		<li>沿肋缘切开膈肌，纵向切开胸骨以暴露胸腔。</li>
		<li>暴露并游离肝上段下腔静脉（图2B用6-0丝线仔细结扎远端。在血管近端 loosely 结扎另一根缝线。</li>
		<li>在结扎端下方用弹簧剪做一个切口，插入一根10 cm的导管。推进导管，直至导管尖端接近肝脏，然后牢固结扎两处结扎线。&#160;确认取样正确后，夹闭导管的游离端图 2D).</li>
		<li>用生理盐水冲洗手术区域。用浸有生理盐水的无菌纱布覆盖表面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肝脏灌注
<ol>
	<li>根据机构关于动物护理和使用的指南，通过过量麻醉和胸腔切开术处死小鼠，确保所有操作均以尽量减少动物痛苦的方式进行。</li>
	<li>设置肝脏灌注系统，包括氧合器、温度调节装置、输液泵和输液管，如图1所示。</li>
	<li>向氧合器持续提供95%氧气和5%二氧化碳的混合气体。</li>
	<li>打开水浴并预热器官腔至37 °C。</li>
	<li>配制含胰岛素和不含胰岛素的KRBH灌注缓冲液。使用在37 °C水浴中预温的灌注缓冲液对管路系统进行预充。 
	注：KRBH不含BSA和葡萄糖。不含人胰岛素的KRBH灌注缓冲液含有5.0 mmol/L葡萄糖和0.25% BSA，而含人胰岛素的KRBH灌注缓冲液含有5.0 mmol/L葡萄糖、0.25% BSA和4.0 ng/mL人胰岛素。</li>
	<li>将小鼠置于环境温度维持在约37 °C的容器中。使用加热垫维持小鼠体温在37 °C。</li>
	<li>通过门静脉导管灌注KRBH缓冲液。使用微型泵将输注速率设定为0.2 mL/min via。</li>
	<li>观察肝脏在数秒内变苍白，表明灌注液已流经肝脏。为更彻底地冲洗肝脏中残留的血细胞，在灌注开始后的第4分钟和第8分钟各暂停输注1分钟。</li>
	<li>用KRBH缓冲液对肝脏进行总共10分钟的灌注（不包括两次1分钟的暂停），作为平衡期。从下腔静脉导管收集基础样本。</li>
	<li>继续用添加胰岛素（4.0 ng/mL人胰岛素）的相同溶液灌注肝脏额外30分钟。</li>
	<li>每2分钟从下腔静脉导管收集一次所有样本。</li>
	<li>灌注结束后记录肝脏重量。从不同肝叶取样，立即在液氮中速冻，随后转移至-80 °C保存。</li>
	<li>将所有收集的灌注样本在4 °C下以约1,000 x g 离心10&#160;min。收集上清液并转移至-80 °C保存。 
	注：灌注样本中的胰岛素浓度使用人胰岛素酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒进行测定。</li>
	<li>操作结束后，确保所有生物废弃物均按照安全规定妥善处理。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>以随时间变化的胰岛素浓度输出为数据，绘制XY图。</li>
	<li>使用以下公式计算平均肝胰岛素清除率（HICRAVE）： 
	HICRAVE = (1−Cf/Ci) × 100% 
	其中 Ci = 灌注缓冲液的初始胰岛素浓度，Cf = 从肝上腔静脉在最后10分钟内测得的平均胰岛素浓度。</li>
</ol>

Mice Liver Perfusion for Accurate Evaluation of Hepatic Insulin Clearance

<ol><li>Najjar, S. M., Perdomo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+insulin+clearance%3A+Mechanism+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Hepatic insulin clearance: Mechanism and physiology.</a> Physiology (Bethesda). 34 (3), 198-215 (2019).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+clearance+as+the+initial+regulator+of+obesity-associated+hyperinsulinemia%3A+Novel+insight+into+the+underlying+mechanism+based+on+serum+bile+acid+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin clearance as the initial regulator of obesity-associated hyperinsulinemia: Novel insight into the underlying mechanism based on serum bile acid profiles.</a> Diabetes Care. 45 (2), 425-435 (2022).</li>
<li>Koh, H. E., Cao, C., Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+clearance+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Insulin clearance in obesity and type 2 diabetes.</a> Int J Mol Sci. 23 (2), 596(2022).</li>
<li>Bril, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+disease+severity%2C+hyperinsulinemia%2C+and+impaired+insulin+clearance+in+patients+with+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Relationship between disease severity, hyperinsulinemia, and impaired insulin clearance in patients with nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology. 59 (6), 2178-2187 (2014).</li>
<li>Herman, R., Sikonja, J., Jensterle, M., Janez, A., Dolzan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+metabolism+in+polycystic+ovary+syndrome%3A+Secretion%2C+signaling%2C+and+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Insulin metabolism in polycystic ovary syndrome: Secretion, signaling, and clearance.</a> Int J Mol Sci. 24 (4), 3140(2023).</li>
<li>Najjar, S. M., Caprio, S., Gastaldelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+clearance+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Insulin clearance in health and disease.</a> Annu Rev Physiol. 85, 363-381 (2023).</li>
<li>Polidori, D. C., Bergman, R. N., Chung, S. T., Sumner, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+and+extrahepatic+insulin+clearance+are+differentially+regulated%3A+Results+from+a+novel+model-based+analysis+of+intravenous+glucose+tolerance+data%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Hepatic and extrahepatic insulin clearance are differentially regulated: Results from a novel model-based analysis of intravenous glucose tolerance data.</a> Diabetes. 65 (6), 1556-1564 (2016).</li>
<li>Castillo, M. J., Scheen, A. J., Letiexhe, M. R., Lefebvre, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+insulin+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Rev%22%5BJournal%5D)">How to measure insulin clearance.</a> Diabetes Metab Rev. 10 (2), 119-150 (1994).</li>
<li>Rubenstein, A. H., Pottenger, L. A., Mako, M., Getz, G. S., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolism+of+proinsulin+and+insulin+by+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The metabolism of proinsulin and insulin by the liver.</a> J Clin Invest. 51 (4), 912-921 (1972).</li>
<li>Terris, S., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+degradation+of+125i-insulin+by+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding and degradation of 125i-insulin by rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 250 (21), 8389-8398 (1975).</li>
<li>Ooms, H. A., Arnould, Y., Rosa, U., Pennisi, G. F., Franckson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+metabolic+clearance+of+crystalline+insulin+and+radio-iodide+substitued+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Biol%22%5BJournal%5D)">Total metabolic clearance of crystalline insulin and radio-iodide substitued insulin.</a> Pathol Biol. 16 (5), 241-245 (1968).</li>
<li>Defronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+clamp+technique%3A+A+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose clamp technique: A method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> Am J Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).</li>
<li>Asare-Bediako, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+hepatic+insulin+extraction+from+in+vivo+surrogate+methods+of+insulin+clearance+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Assessment of hepatic insulin extraction from in vivo surrogate methods of insulin clearance measurement.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 315 (4), E605-E612 (2018).</li>
<li>Kim, S. P., Ellmerer, M., Kirkman, E. L., Bergman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+%26%2334%3Brest%26%2334%3B+accompanies+reduced+first-pass+hepatic+insulin+extraction+in+the+insulin-resistant%2C+fat-fed+canine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Beta-cell &#34;rest&#34; accompanies reduced first-pass hepatic insulin extraction in the insulin-resistant, fat-fed canine model.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 292 (6), E1581-E1589 (2007).</li>
<li>Kotsis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+metabolism+and+assessment+of+hepatic+insulin+extraction+during+liver+regeneration.+A+study+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Surg%22%5BJournal%5D)">Insulin metabolism and assessment of hepatic insulin extraction during liver regeneration. A study in a rat model.</a> J Invest Surg. 33 (1), 69-76 (2020).</li>
<li>Mondon, C. E., Olefsky, J. M., Dolkas, C. B., Reaven, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+insulin+by+perfused+rat+liver%3A+Effect+of+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Removal of insulin by perfused rat liver: Effect of concentration.</a> Metabolism. 24 (2), 153-160 (1975).</li>
<li>Tamaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diabetes-susceptible+gene+SLC30A8%2FZnT8+regulates+hepatic+insulin+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The diabetes-susceptible gene SLC30A8/ZnT8 regulates hepatic insulin clearance.</a> J Clin Invest. 123 (10), 4513-4524 (2013).</li>
<li>Ghadieh, H. E., Gastaldelli, A., Najjar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+insulin+clearance+in+insulin+action+and+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of insulin clearance in insulin action and metabolic diseases.</a> Int J Mol Sci. 24 (8), 7156(2023).</li>
<li>Winther-Sorensen, M., Kemp, I. M., Bisgaard, H. C., Holst, J. J., Wewer Albrechtsen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+glucose+production%2C+ureagenesis%2C+and+lipolysis+quantified+using+the+perfused+mouse+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Hepatic glucose production, ureagenesis, and lipolysis quantified using the perfused mouse liver model.</a> J Vis Exp. 200, e65596(2023).</li>
<li>Rydell-Tormanen, K., Johnson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+applicability+of+mouse+models+to+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The applicability of mouse models to the study of human disease.</a> Methods Mol Biol. 1940, 3-22 (2019).</li>
<li>Zaidi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+ceacam1+in+hepatocytes+causes+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Loss of ceacam1 in hepatocytes causes hepatic fibrosis.</a> Eur J Clin Invest. 54 (7), e14177(2024).</li>
<li>Piccinini, F., Bergman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+insulin+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">The measurement of insulin clearance.</a> Diabetes Care. 43 (9), 2296-2302 (2020).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

方案中的关键步骤 
上述手术操作应轻柔进行，以避免对肝脏造成任何损伤。此外，肝静脉管壁结构脆弱，在插管过程中若操作不当，容易发生穿孔并导致后续出血。本方案采用较柔软的硅胶管以尽量减少对血管的损伤。建议由经验丰富的外科医生进行导管插入操作，并应经常练习，以提高插管成功率并缩短手术时间。
应不时用温盐水冲洗手术区域，以维持肝细胞的活性。灌注过程中，应用无菌纱布或棉球遮盖手术区域。这种做法可防止肝细胞长时间暴露于空气中，从而避免其功能受损。
挑战与解决方案 
将导管尖端准确定位于门静脉即将分叉为左、右肝门静脉之前的位置至关重要。若导管插入过深，可能导致肝脏各叶灌注不均。此外，在灌注过程中必须仔细避免气泡产生，因为气泡可能引发肝脏空气栓塞，从而显著影响到达肝细胞的液体灌注，继而干扰胰岛素的清除。
灌注KH缓冲液的最初10分钟为平衡期，在此期间可暂停灌注1至2次，每次2分钟，以尽可能将残留的血细...

胰岛素的发现已成为上个世纪的里程碑之一。目前对胰岛素合成、分泌及其在代谢组织中生理功能的调控已有大量研究。然而，关于胰岛素降解及其调控机制的关注相对较少。胰岛素代谢可被理解为β细胞功能、胰岛素抵抗（IR）或胰岛素敏感性以及胰岛素清除之间相互作用的结果。除胰岛素分泌外，肝脏对胰岛素的清除在维持胰岛素稳态水平方面起着关键作用，这种稳态水平对于胰岛素到达外周靶组织并发挥正常生物学效应至关重要1。多项研究已将胰岛素清除功能受损确定为代谢综合征中高胰岛素血症发病机制的关键因素，同时也见于2型糖尿病2,3、非酒精性脂肪性肝炎4和多囊卵巢综合征5等其他疾病状态。因此，继发于清除能力下降的高胰岛素血症可能在代谢性疾病的发病机制中发挥重要作用。改善胰岛素清除的策略有望逆转这些个体中高胰岛素血症带来的不利影响。
胰岛素具有独特的分布模式。循环血浆胰岛素水平取决于胰岛素分泌与清除之间的平衡。胰腺以脉冲方式将胰岛素分泌入门静脉，使其直接进入肝细胞。作为首个接触胰岛素分泌的器官，肝脏在胰岛素首次通过时即降解其大部分，占总胰岛素量的60%–70%6。剩余的胰岛素通过肝静脉离开肝脏，进入体循环，在经肝动脉第二次通过肝脏被进一步摄取之前，部分被外周组织（主要是肌肉、脂肪组织和肾脏）利用7。
准确测量胰岛素清除率至关重要。在人体研究中直接测量肝脏胰岛素清除率具有挑战性，因为难以从门静脉和肝静脉获取血液样本。目前在人类和动物模型中均采用直接和间接方法来估算胰岛素清除率。间接测量胰岛素清除率的方法大致有三种。临床实践中最常使用的评估方法基于C肽/胰岛素摩尔比8。该方法的依据是两种肽等摩尔分泌，且肝脏不摄取C肽9。第二类方法依赖于在已知且特定剂量的胰岛素进入循环后，对血浆中胰岛素衰减曲线进行数学分析2,10,11。第三种方法基于以下事实：以恒定速率输注胰岛素可使血液中激素水平达到稳定状态，此时清除速率等于给药速率12。这些间接方法主要反映的是全身胰岛素清除情况。鉴于肝脏是胰岛素清除的主要部位，并在该过程中发挥关键作用，因此直接评估肝脏胰岛素清除率十分必要。
既往研究已直接测量了健康犬的肝脏胰岛素摄取量13,14。也有研究采用离体灌注大鼠肝脏模型来评估肝脏对胰岛素的摄取15,16。由于基因修饰小鼠品系资源丰富，小鼠成为研究分子通路的宝贵模型。少数研究17已利用肝脏灌注技术在小鼠模型中直接评估肝胰岛素清除率。在这些研究中，含有外源人胰岛素的灌注液经门静脉输入，并从下腔静脉收集。肝脏对胰岛素的摄取比例反映了其清除能力。肝脏灌注技术通过在肝血管系统中循环温热、含氧且富含营养物质的灌注液，使肝脏维持在接近生理的状态。然而，目前尚缺乏关于该技术操作的充分实践指导和关键操作要点，以促进其优化与推广。
因此，尽管肝脏胰岛素清除率日益受到关注，但其在疾病中的作用及其分子机制仍不明确18。因此，该研究领域迫切需要先进的技术。本方案建立了用于评估小鼠肝脏胰岛素清除率的改良版肝脏灌流详细操作流程。此外，该方法还可用于研究药物对肝脏的影响，包括首过效应、药物转运过程以及其他多个方面。

<table><tbody><tr><td>60% 高脂饮食</td><td>Research Diets, USA</td><td>D12492</td><td></td></tr><tr><td>丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒</td><td>南京建成生物工程研究所</td><td>C009-2-1</td><td></td></tr><tr><td>无水葡萄糖</td><td>生工生物</td><td>50-99-7</td><td>500 G</td></tr><tr><td>天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒</td><td>南京建成生物工程研究所</td><td>C010-2-1</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>GeminiBio</td><td>700-107P</td><td>无脂肪酸</td></tr><tr><td>Contour TS 血糖仪</td><td>Bayer</td><td>PH220800019</td><td></td></tr><tr><td>Contour TS 血糖测试条</td><td>Bayer</td><td>DP38M3F05A</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠&amp;nbsp;</td><td>常州千红生化制药</td><td>H32022088</td><td>12500 U/2mL</td></tr><tr><td>人胰岛素</td><td>Novo Nordisk</td><td>S20191007</td><td>300 U/3mL</td></tr><tr><td>人胰岛素免疫检测试剂盒</td><td>Ezassay Biotechnology</td><td>HM200</td><td></td></tr><tr><td>KRBH 缓冲液（无糖、无 BSA）</td><td>coolaber</td><td>SL65501</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>膜式氧合器</td><td>西安西京医疗用品</td><td>5</td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>上海金钟</td><td>YBC020</td><td></td></tr><tr><td>微血管夹</td><td>宁波医用针厂</td><td>180709</td><td></td></tr><tr><td>显微外科镊</td><td>上海金钟</td><td>WA3010, WA3020</td><td></td></tr><tr><td>针式过滤器</td><td>N-buliv</td><td>LG05-133-2</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>上海利康消毒高科技</td><td>20231016J</td><td></td></tr><tr><td>pump 11 Elite</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PC5&amp;nbsp;70-4500</td><td></td></tr><tr><td>牵开器</td><td>环球博益（北京）科技</td><td>GEKK-10mm</td><td>10 mm</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>scientific commodities</td><td>#BB518-12</td><td>0.31 mm &amp;times; 0.64 mm</td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>Fisher Scientific</td><td>#11-189-15A</td><td>ID 0.5 mm</td></tr><tr><td>氯化钠注射液</td><td>Baxter</td><td>S2402023</td><td>4.5 g/500 mL</td></tr><tr><td>外科丝线缝合线</td><td>扬州环球医疗设备</td><td>6-0</td><td></td></tr><tr><td>温度调节装置</td><td>西安西京医疗用品</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>恒温水浴锅</td><td>嘉兴俊思电子</td><td>HIH-1</td><td>220 V 50 HZ</td></tr><tr><td>三通接头</td><td>YISAI</td><td>AQTCY1.6</td><td>ID 0.4 mm</td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪注射液</td><td>生欣</td><td>20240106</td><td>200 mg/2mL</td></tr><tr><td>Zoletil 50</td><td>Virbac</td><td>WK001</td><td>250 mg/5mL</td></tr></tbody></table>

通过原位肝脏灌注评估小鼠胰岛素清除率

Assessing Insulin Clearance in Mice via In Situ Liver Perfusion

肝脏胰岛素清除对维持葡萄糖稳态至关重要，并与肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病等代谢性疾病密切相关。准确测定胰岛素清除率对于理解这些疾病的潜在机制具有重要意义。本方案介绍了一种简便且易于操作的小鼠肝脏灌流实验流程，专门用于直接评估肝脏胰岛素清除速率。该方法包括对门静脉和肝后下腔静脉进行精确插管，以建立一个 原位 模拟生理条件的灌注系统。该方案指导研究人员完成实验的各个阶段，从手术准备、灌注系统的搭建到样本采集与分析。文中提供了详细的实验步骤，以及代表性结果和优化操作的重要提示。书面方案配有视频教程，通过深入直观的视觉演示和图示，为探索肝脏胰岛素代谢与清除分子机制的科研人员提供了一个易于使用且全面的参考资源。

本方案概述了通过肝脏灌注直接计算肝胰岛素清除率的操作步骤。该模型具有可靠性和可重复性。图3展示了实验获得结果的一个示例。在10分钟的平衡期后，通过门静脉灌注添加了4.0 ng/mL人胰岛素的KRBH缓冲液，持续30分钟。从肝上腔静脉的导管中以每2分钟为间隔收集灌注液，并测定灌注液中人胰岛素的浓度。结果以均值±标准误（SEM）表示。一个比较对照饮食（CD）小鼠与高脂饮食（HFD）小鼠的肝脏灌注实验示例如图3所示。CD组的肝胰岛素清除率（HICRAVE）为55.57% ± 4.43%，HFD组为25.37% ± 6.83%（图3B）。结果表明，高脂饮食会导致胰岛素清除能力受损。
灌流后，采集肝脏样本进行苏木精-伊红（HE）染色及全片扫描；分别收集了灌流良好、灌流不良以及来自正常小鼠的对照组肝脏样本。在灌流条件较好的情况下，肝组织结构正常，肝细胞索呈放射状整齐排列，肝细胞形态完整，胞质染色...

肝脏胰岛素清除在调节葡萄糖稳态中起关键作用。本文介绍了一种操作简便的肝脏灌流方法，可用于直接评估肝脏胰岛素清除率 原位 在小鼠中。

肝脏胰岛素清除对于维持葡萄糖稳态至关重要，并且与肥胖、胰岛素抵抗等代谢性疾病密切相关。

胰岛素清除在调节葡萄糖代谢中起关键作用，并与肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病等代谢紊乱相关。准确评估胰岛素清除率至关重要。本方案介绍了一种简便易行的肝脏灌流操作流程，旨在直接评价肝脏胰岛素清除速率。胰岛素清除率在人体和动物模型中可通过直接和间接方法进行估算。然而，很少有研究采用肝脏灌注技术在小鼠模型中直接评估肝脏对胰岛素的清除。肝脏灌注技术通过在肝脏血管内循环温暖、含氧且富含营养的灌注液，以维持肝脏在接近生理条件下的功能状态。手术插管的成功对于肝脏灌注系统至关重要，因为肝脏组织中的血管较为细小。准确地将导管插入门静脉和下腔静脉尤为关键。若导管插入过深，可能导致肝叶之间的灌注不均，从而影响实验结果。小鼠肝脏灌注系统是研究肝脏胰岛素代谢动态过程及分子机制的重要工具。此外，该方案不仅可用于预先诱导的疾病模型，还可广泛应用于急性刺激挑战测试。[旁白] 首先，将麻醉后的小鼠置于手术台上，用胶带固定四肢，沿腹部中线从下腹部向剑突方向做一条4厘米长的纵向切口。使用剪刀小心剪开腹膜，避免损伤内脏器官。插入腹腔牵开器以暴露手术视野。将肠道移向右侧，以显露门静脉、右肾和下腔静脉。使用动脉钳在肾脏上缘夹闭下腔静脉。接着分离门静脉，并用6-0丝线结扎其远端。在暴露血管的近端松松地打另一个结。用弹簧剪在结扎端附近做一切口，并插入导管。将导管经切口推进至门静脉分叉水平。现在，将两根结扎线在导管周围扎紧，并通过将导管的游离端连接至取样注射器来确认取样通畅。随后灌注肝素化生理盐水，并夹闭导管。接下来，移除牵开装置，复位肠道。用生理盐水浸湿的无菌纱布或棉球覆盖手术区域。沿胸骨从剑突处做切口，暴露胸骨。然后纵向切开胸骨，并沿肋缘切开膈肌，以暴露胸腔。暴露并分离肝上段下腔静脉。接着用6-0丝线小心结扎其远端。在血管近端松松地打另一个结。接下来，用弹簧剪在结扎端稍下方做一切口。将一根10厘米长的导管经切口插入，并向前推进，直至导管尖端接近肝脏。然后将两根结扎线在导管周围牢固打结。确认取样通畅后，夹闭导管的游离端。最后，用生理盐水冲洗手术区域，并用生理盐水浸湿的无菌纱布覆盖表面。首先，设置肝脏灌流系统，该系统包括氧合器、温度调节装置、输液泵和输液管。打开水浴，预热器官腔至37°C。使用在水浴中预温的灌流缓冲液对管路系统进行预充。将安乐死处理后的小鼠放入带有加热垫的容器中，维持温度为37°C。然后将肝脏灌流系统连接至门静脉导管。使用微型泵以0.2毫升/分钟的可控速率经门静脉导管灌注KRBH缓冲液。数秒内可观察到肝脏变苍白，表明灌流缓冲液已开始流动。为冲洗肝脏中残留的血细胞，在灌流开始后的第4分钟和第8分钟各暂停灌注1分钟。10分钟后，从下腔静脉导管收集基础样本。接下来，使用含4纳克/毫升人胰岛素的KRBH缓冲液继续灌注肝脏30分钟。每2分钟从下腔静脉导管收集一次样本。灌流结束后，记录肝脏重量，并从不同肝叶采集

assessing-insulin-clearance-in-mice-via-in-situ-liver-perfusion

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过原位肝灌注评估小鼠胰岛素清除率

高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术，或称胰岛素钳夹，是评估胰岛素作用的金标准...

清醒非束缚小鼠的高胰岛素-正常血糖钳夹实验

肾小球滤过率（GFR）的测定是评估肾功能的金标准。本文介绍一种高通量方法，通过单次团注荧光素异硫氰酸酯标记的菊粉（FITC-菊粉），在清醒小鼠中采集血浆样本测定FITC-菊粉浓度，并利用双相指数衰减模型计算GFR。...

一种用于清醒小鼠肾小球滤过率高通量测定的方法

胰岛素诱导的血管舒张可调节肌肉灌注，并增加血液与组织间质之间溶质交换可用的微血管表面积（微血管招募）。本文介绍了结合活体显微镜与对比增强超声技术，以同时评估胰岛素在较大血管和微循环中的作用。...

结合活体显微成像与对比增强超声技术研究小鼠后肢胰岛素诱导的血管舒张及肌肉灌注

本文介绍了在小鼠体内成功实施门静脉内胰岛移植的优化手术步骤。该手术是一种具有临床相关性但技术上具有挑战性的外科操作。...

小鼠肝内胰岛移植过程中减少输注后门静脉出血的方法

脂肪酸β-氧化是一种重要的代谢途径，在包括肝细胞在内的多种细胞类型中负责能量生成。本文介绍一种利用14C标记的棕榈酸测定 freshly isolated primary...

新鲜分离小鼠肝细胞悬液中脂肪酸β-氧化的测定

本研究通过使用稳定同位素标记的葡萄糖示踪剂，对多囊卵巢综合征小鼠模型中的肝脏葡萄糖生成进行直接测定 通过...

多囊卵巢综合征小鼠模型中肝糖生成的评估

本方案描述了一种通过门静脉灌注对完整小鼠肝脏进行切片以用于代谢研究的简便方法。...

Ex Vivo 小鼠门静脉肝脏灌注

荧光标记葡萄糖的细胞外耗竭与葡萄糖摄取相关，可用于离体器官和细胞培养中葡萄糖摄取的高通量筛选。...

细胞和组织离体外环境中葡萄糖摄取的间接检测方法：细胞外葡萄糖耗竭法 Ex Vivo

常温的 离体 小鼠肝脏离体灌注

在此，我们介绍一种可靠的实验方法 原位...

利用灌流小鼠肝脏模型定量测定肝葡萄糖生成、尿素生成及脂解作用

本文提供了通过小鼠完整血管系统灌注以进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验的详细步骤，作为一种评估胰腺内分泌功能的附加技术，可减少潜在混杂因素的影响。...

通过完整胰腺小鼠血管灌注进行葡萄糖刺激的胰岛素分泌

了解原位肝灌注技术在小鼠模型中直接评估肝脏胰岛素清除率的方法。该方案通过门静脉和肝下下腔静脉插管灌注，为研究代谢性疾病和肝脏功能提供重要工具。

通过原位肝脏灌注评估小鼠胰岛素清除率

探索更多视频