Name: 早期斑马鱼胚胎的光片显微镜成像和安装策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 了解光片显微镜技术用于早期斑马鱼胚胎高分辨率活体成像的方法。该技术可减少光漂白和光毒性，实现细胞级分辨率的动态发育过程观察，为发育生物学研究提供重要工具。

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我们感谢Kalidas Kohale博士及其团队对鱼类养殖设施的维护，以及KV Boby对光片显微镜的维护。SRN感谢印度原子能部（DAE）政府提供的经费支持（项目编号：RTI4003，DAE文件号：1303/2/2019/R&amp;#38;D-II/DAE/2079，日期：2020年2月11日）、马克斯·普朗克学会伙伴小组项目（M.PG.A MOZG0010）以及科学与工程研究委员会启动研究基金（SRG/2023/001716）的支持。

本研究中使用的斑马鱼饲养和实验程序已获得机构动物伦理委员会批准，批准文号为 TIFR/IAEC/2023-1 和 TIFR/IAEC/2023-5。通过交配携带杂合基因型并表达特定标记的斑马鱼获得胚胎 Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)19&#160;在单细胞阶段注射了 H2A-mCherry mRNA（30 pg）。H2A-mCherry mRNA 使用 pCS2+ H2A-mCherry 质粒（由 EPFL 的 Oates 实验室惠赠）合成 体外 转录。在本方案其余部分中，分别将表达这两种标记物的胚胎称为 Utr-GFP 和 H2A-mCherry，并在原肠胚形成70%包被期和胚芽期进行成像。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 多视角成像的样品制备
<ol>
	<li>氟化乙烯丙烯/聚四氟乙烯（FEP/PTFE）管的制备
	<ol>
		<li>按照先前描述的步骤清洗FEP/PTFE管14。</li>
		<li>清洗后，根据需要将管子切成2-2.5 cm的长度，并将其储存于含有双蒸水的2 mL微量离心管中。此类储存方式可维持约一个月。</li>
		<li>在样品制备前，将管子在70-75 °C下加热约25分钟以使其伸直。每个微量离心管中应避免过度堆积，以防管子粘连，确保留有足够空间以实现有效伸直。 
		注意：在整个管子操作过程中需佩戴手套，因为管子上留下的任何指纹或灰尘颗粒都可能干扰成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>琼脂糖的制备
	<ol>
		<li>配制50倍浓缩的E3缓冲液储备液，方法如下：
		<ol>
			<li>储备液1：将3.252 g Na2HPO4、0.285 g KH2PO4、11.933 g NaCl、0.477 g KCl溶于1 L去离子水中</li>
			<li>储备液2：将2.426 g CaCl2、4.067 g MgSO4&#160;溶于1 L去离子水中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制1倍E3缓冲液时，将储备液1和储备液2各取20 mL，加入960 mL去离子水中。 
		&#8203;注意：用于成像的E3缓冲液中不得添加亚甲蓝，因其会导致光散射。</li>
		<li>将低熔点琼脂糖加入1倍E3缓冲液中，在加热块上于70-75 °C加热并搅拌，直至溶液澄清、无结块或晶体残留。</li>
		<li>对于多视角成像，向琼脂糖溶液中加入市售荧光微球（参见材料表），以便在分析过程中实现图像配准。将微球置于水浴超声仪中，室温下以40 kHz频率超声处理20-30分钟，以分散微球团块。</li>
		<li>超声处理后，向15 mL离心管中的10 mL琼脂糖溶液中加入1 µL微球，并充分涡旋混匀，确保微球均匀分散。 
		注意：加入琼脂糖的微球溶液体积取决于厂家提供的原液浓度。建议尝试不同体积范围，选择在光片成像系统中观察到微球分布均匀的浓度。即使经过超声和涡旋处理，过多的微球仍可能聚集，而过少则会影响图像配准效果。</li>
		<li>在样品制备前，将加入微球的琼脂糖管置于37 °C恒温水浴中密闭保存至少30分钟，使琼脂糖温度从70 °C降至37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>在成像当天前一晚，将鱼类成对放入饲养盒中并用隔板隔开。移除隔板约15分钟，随后采用标准方法收集胚胎20。</li>
		<li>当胚胎发育至样品制备所需阶段时，将置于37 °C保温的全部10 mL含微球琼脂糖溶液倒入6 cm培养皿中。</li>
		<li>等待约2-3分钟，待温度降至33 °C以下后，将10至15个胚胎转移至琼脂糖溶液中。 
		注意：此步骤至关重要，可防止胚胎因高温琼脂糖而遭受热休克。</li>
		<li>转移胚胎时，应尽量减少带入琼脂糖溶液中的E3缓冲液体积。轻轻旋转培养皿，使少量带入的缓冲液充分分散。</li>
		<li>在后续样品制备过程中均需佩戴手套。</li>
		<li>取一支200 µL移液器并装配合适的吸头，将一根从微量离心管中取出的已清洗直管插入移液器吸头中，如图1A、B所示。</li>
		<li>使用移液器先吸入少量琼脂糖进入管内，随后吸入2-3个胚胎（图1C、D）。确保胚胎靠近管底（图1E），这在后续设置成像时非常重要。同时确保不同胚胎之间留有少量琼脂糖（图1E），以便该区域的微球可作为图像配准标记。</li>
		<li>保持移液器负压不释放，将管子从吸头上取下，并将其放置于盛有E3缓冲液的培养皿盖上，使琼脂糖凝固（图1F）。</li>
		<li>重复步骤1.3.6至1.3.8，直至培养皿中所有胚胎均转移至管中。</li>
		<li>待琼脂糖完全凝固（约需5-10分钟，可通过检查培养皿中琼脂糖状态确认）后，将管子转移至装有E3缓冲液的2 mL微量离心管中（图1G）。</li>
		<li>根据需要，将含有胚胎的管子置于28 °C或33 °C培养箱中保存，随后进行多视角成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 多视角成像
注意：本步骤介绍了斑马鱼胚胎在早期发育阶段进行多视角成像的通用流程。下述方法可轻松适配于任何多视角光片显微镜系统。
<ol>
	<li>定位胚胎 
	注意：用胚胎培养基填充显微镜的样品室20&#160;并将样品室温度设置为成像所需的温度，且至少在成像前10分钟完成预热。
	<ol>
		<li>按照之前所述组装样品 holder21，但需进行一项修改。由于将通过毛细管进行成像，因此需将含有胚胎的琼脂糖管直接插入直径合适的毛细管中，确保其固定到位，同时避免推出琼脂ose或扰动底部的胚胎（图1H). 
		注意：由于样品室具有固定的深度，在样品制备过程中（如步骤1.3.7所述）确保胚胎位于管底附近，可使胚胎定位在视野范围内，同时避免触碰到样品室底部。</li>
		<li>将样本架插入多视角系统，并使用x轴和y轴控制将胚胎移至视野中心。</li>
		<li>使用样本导航器的 z 轴控制功能将胚胎调至焦点。</li>
		<li>此时，胚胎在绒毛膜内的方向将清晰可见；如果方向不理想，可插入新的移液管，选择具有理想方向的胚胎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对齐光片
	<ol>
		<li>胚胎就位后，设置所有实验参数——激光器、光路、滤光片、分光镜和相机。</li>
		<li>在设置采集参数时，如果软件提供选项 摆动扫描，选择该选项。枢轴扫描可减少光片在遇到样品中任何结构或不透明区域时产生的阴影效应。</li>
		<li>开始对样品进行实时扫描。设置位大小、激光功率和所需的缩放倍数，这些参数将决定光片的厚度，从而影响轴向分辨率。</li>
		<li>为对齐光片，首先切换至 单侧光照 并更改设置 两束光片 （左侧和右侧）依次进行。在样品中选择一个具有清晰可见目标结构的区域，进行数字放大。 
		注意：本研究中使用了核标记（H2A-mCherry）或膜标记（Utr-GFP）来对齐层片。建议在软件中调整光片设置，以在目标区域获得最清晰的信号对比度。</li>
		<li>当两束光片各自优化至获得最佳信号后，同时开启两束光片。进行第二轮准直调整，确保闪烁现象最小化，这表明两束光片已实现较佳的对准。</li>
		<li>一旦完成对齐，如果软件允许，启用自动融合由两片光片生成图像的选项。或者，可先通过聚焦样品周围的荧光微珠对光片进行粗略对齐，再利用样品本身的信息进行精细调整。 
		注意：在使用两种荧光染料（如细胞核和细胞膜标记物）进行成像时，两种结构的最佳对齐参数通常略有不同。在此情况下，应根据下游处理的限制条件选择设置。例如，若需分割细胞边界（该过程相对更耗费计算资源），则应基于细胞膜标记物对齐光片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置多视角成像
	<ol>
		<li>对齐光片后，启用进行z轴扫描及多视角成像的选项。</li>
		<li>开始 活体扫描 并使用样本导航器选择第一个视图。在此视图中，设置 层厚间隔，接着是z轴层扫的第一层和最后一层。在多视野对话框中添加此位置，以记录该视野的位置和z轴层扫信息。</li>
		<li>通过调整样本导航器中的角度切换到下一个视野。为第二个视野设置z轴层扫，并在多视野对话框中添加相应信息。</li>
		<li>对其他视图重复相同操作。 
		注意：确保在每种视角下成像的切片数量达到一定最小值，以便不同视角之间具有足够的重叠区域，从而在后续处理过程中有助于视角间的配准。最小切片数取决于成像时的缩放倍数以及所选择的成像角度数量。</li>
		<li>设置完所有视图后，将这些信息保存为一个文本文件（例如命名为“embryo-positions”），文件中将包含z层信息、管状结构的(x, y, z)坐标以及每个视图的角度参数。保存后，清除多视图对话框中的所有位置信息。</li>
		<li>由于成像时卵膜保持完整，而卵膜相对较大，因此无法在相同设置下于管中观察到珠子。因此，必须从管中另一位置获取珠子信息。为此，将视野移至远离胚胎、可清晰看到珠子的另一个“y”坐标位置。将该位置添加至多视野对话框中，并将其保存为文本文件（例如命名为“beads-y”）。 
		注意：应将珠子成像位置尽量靠近胚胎样本，以尽量减少两个位置间因管壁曲率差异可能带来的影响。因此，若在管中装载多个胚胎，需在胚胎之间保留少量琼脂糖，用于珠子成像（如步骤1.3.7所述）。</li>
		<li>转到保存文本文件的文件夹，将“embryo-positions”文件复制为一个新文件，命名为“beads-positions”。在“beads-positions”文件中，将所有视图的 y 坐标替换为“beads-y”文件中的 y 坐标。这将确保珠子以相同数量的视图、z 层切和 x 坐标进行成像，但在管中的 y 位置不同。</li>
		<li>返回成像软件并加载软件中的“bead-positions”文件。如果已启用时间序列选项，请选择一个周期并开始实验。将珠子图像保存为“beads”，用于图像处理过程中不同视角的配准。</li>
		<li>拍摄完磁珠图像后，清除原有位置信息，并在软件中加载初始的“胚胎-位置”文件。设置合适的循环次数和时间间隔，然后开始实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 多视角图像分析
注意：为融合多视角图像，使用 FIJI 插件 BigStitcher，该插件是 Multiview Reconstruction 插件的最新版本10,17,18。可通过在“帮助”菜单下的“更新”选项中进入“管理更新站点”功能，添加 BigStitcher 插件以完成安装。安装完成后，该插件将出现在“插件”菜单下。融合过程的主要步骤如下：（1）分别为荧光微球和胚胎定义 .xml/.h5 文件对；（2）使用荧光微球文件对所有视角进行配准；（3）提取荧光微球的点扩散函数（PSF），用于去卷积处理（图 2A）；（4）将荧光微球文件中的配准信息和 PSF 信息转移至胚胎文件，并开始多视角去卷积。其中大部分步骤已有详细描述21，本文仅介绍处理方式有所不同的步骤。
<ol>
	<li>定义 .xml 数据集
	<ol>
		<li>如前所述21，分别为珠子和胚胎定义新的数据集，文件名为“beads.xml”和“embryo.xml”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用兴趣点进行检测与配准
	<ol>
		<li>成功导出 beads.xml 文件后，在“Multiview Explorer”对话框中选择需要用于配准的视图（图2B）。右键单击并选择检测兴趣点。按照描述的步骤继续操作21。</li>
		<li>检测到兴趣点后，选择所有视图，右键单击并选择使用兴趣点进行配准。按照描述的方案进行操作21。</li>
		<li>仔细检查珠子配准是否成功。配准成功后，来自不同视图的重叠珠子将被叠加（图2C）。为评估配准的精确程度，选择两个连续的视图，进入重叠区域，并在两个视图之间切换，观察从不同角度成像的珠子是否完全重合。对每一对连续视图重复此操作。</li>
		<li>如果重叠不够精确，可通过降低配准所需的显著性阈值和/或放宽可接受的重叠误差（在“Registration”对话框中称为“RANSAC error”）重新尝试配准。</li>
		<li>成功配准后，点击“Multiview Explorer”窗口中的保存按钮，以保存更新后的 .xml 文件。 
		注意：同时保存日志文件，其中包含有关配准效率的更详细信息。要将珠子的配准信息转换至胚胎数据，请按以下步骤操作。</li>
		<li>使用任意文本编辑器打开bead.xml文件，并复制&#34;ViewRegistrations&#34;下的整个代码块。</li>
		<li>打开embryo.xml文件，将其中的&#34;ViewRegistrations&#34;代码块替换为从珠子文件中复制的代码块。如果有多个通道，需对每个通道重复上述替换操作。配准信息可通过手动方式或使用自定义编写的 MATLAB 代码进行转移，该代码可从此处下载：https://github.com/sundar07/Multiview_analysis</li>
		<li>在&#34;BigStitcher&#34;中打开embryo.xml文件，并仔细检查胚胎数据的配准是否成功。如同对珠子的操作一样，通过检查每两个连续视图中感兴趣结构的重叠情况来验证配准效果。 
		注意：有时即使珠子配准完美，胚胎配准效果仍可能不理想。这可能是由于从珠子成像位置到胚胎位置之间毛细管曲率存在轻微变化所致。此外，由于胚胎在绒毛膜内自由漂浮，不同视图之间可能存在细微移动。在此情况下，可使用胚胎中的核标记进行第二轮配准。</li>
		<li>为此，在&#34;BigStitcher&#34;中打开embryo.xml文件，右键单击所有包含核标记的视图，然后选择检测兴趣点。</li>
		<li>将兴趣点重命名为“nuclei”，并按照珠子处理的步骤继续操作。</li>
		<li>设置“高斯差分”参数时，应确保绝大多数（若非全部）细胞核被检测到，且无异位的细胞核检测信号。随后点击完成。</li>
		<li>接下来，选择使用兴趣点进行配准，并选择基于精确描述符（平移不变）选项。确保选中“比较所有视图和兴趣点”选项，并使用“nuclei”作为兴趣点。启用固定第一个视图的选项，并不进行反向映射。</li>
		<li>配准时使用仿射模型并结合刚性正则化，插件中使用默认参数。</li>
		<li>通过比较每两个连续视图，重新检查配准的成功情况。</li>
		<li>配准成功后，点击“Multiview Explorer”窗口中的保存按钮，以保存更新后的 .xml 文件。</li>
		<li>使用任意文本编辑器打开 embryo.xml 文件，并将来自核标记的配准信息复制到其他通道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点扩散函数提取与分配
	<ol>
		<li>为执行多视角去卷积，需从已配准的珠子数据集中提取成像系统的点扩散函数（PSF），并将其&#160;应用于胚胎文件。</li>
		<li>为获取该信息，选择珠子文件中的所有视图，右键单击并选择点扩散函数和提取选项。</li>
		<li>在弹出的对话框中，确保勾选使用对应的兴趣点和从PSF中移除最小强度投影，使用默认的PSF尺寸，然后点击确定。 
		注意：如果所有视图的PSF提取均成功，日志文件将显示“Extracted n/n PSFs”</li>
		<li>随后，重新保存 .xml 文件。“Multiview Explorer”对话框的PSF列中将出现勾选标记，同时在相应文件夹中生成一个包含所有提取PSF的“psf”文件夹。</li>
		<li>打开embryo.xml文件，并为每个视图单独分配PSF。右键单击&#34;一个视图&#34; → 点击点扩散函数 → 选择分配 → 选择高级，然后选择为所有选定视图分配新PSF。点击浏览，前往 .xml 文件路径，打开psf文件夹。</li>
		<li>选择与所选视图对应ID匹配的PSF，点击确定，之后“Multiview Explorer”窗口中PSF列的复选框将显示为已勾选。</li>
		<li>对所有其他视图重复此过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多视角融合与去卷积
	<ol>
		<li>在为所有视图分配点扩散函数后，右键单击并选择多视角去卷积。</li>
		<li>选择边界框为当前选定的视图。在本研究中，默认的OSEM加速参数和迭代次数表现良好。</li>
		<li>如需加快计算速度或受限于CPU内存，可根据需要对图像进行下采样。 
		注意：如果所需RAM超过现有内存，窗口底部将弹出红色警告消息。若出现此警告，请勿启动去卷积，否则插件将在处理过程中卡住并停止响应。</li>
		<li>为评估去卷积的进度，可查看日志文件，该文件每5次迭代显示一次结果。</li>
		<li>为提高计算速度，若已安装GPU，可在GPU上执行多视角去卷积。 
		注意：此过程结束后，将弹出融合图像窗口，可将其保存为tiff文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Refined Multiview Light Sheet Microscopy Protocol for Zebrafish Embryos

<ol><li>Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+and+its+potential+for+understanding+developmental+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Keller, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-contrast+imaging+of+animal+development+with+scanned+light+sheet-based+structured-illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy.</a> Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).</li>
<li>Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+morphogenesis%3A+Technological+advances+and+biological+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights.</a> Science. 340 (6137), 1234168(2013).</li>
<li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+Light+sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4 (1), 2207(2013).</li>
<li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+Light+sheet+microscope+for+imaging+mouse+pre-implantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development.</a> Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).</li>
<li>McDole, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+and+reconstruction+of+post-implantation+mouse+development+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level.</a> Cell. 175 (3), 859-876 (2018).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+Light+sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).</li>
<li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+for+bead-based+registration+of+selective+plane+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data.</a> Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).</li>
<li>Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+image+fusion+improves+resolution+in+three-dimensional+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy.</a> Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).</li>
<li>Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+imaging+axis+microscopy+improves+resolution+for+thick-sample+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications.</a> Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+for+long-term+light+sheet+microscopy+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish.</a> J Vis Exp. (84), e51119(2014).</li>
<li>Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+symmetry+of+zebrafish+embryos+requires+somite+surface+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension.</a> Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).</li>
<li>Shah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+imaging+and+analysis+identify+pan-embryo+cell+dynamics+of+germlayer+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish.</a> Nat Commun. 10 (1), 5753(2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hörl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigStitcher%3A+Reconstructing+high-resolution+image+datasets+of+cleared+and+expanded+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples.</a> Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).</li>
<li>Behrndt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+driving+epithelial+spreading+in+zebrafish+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation.</a> Science. 338 (6104), 257-260 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Icha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+light+sheet+fluorescence+microscopy+to+image+zebrafish+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development.</a> J Vis Exp. (110), e53966(2016).</li>
<li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+Light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).</li>
<li>Aigouy, B., Prud'homme, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+quantitative+analysis+of+epithelial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues.</a> Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).</li>
<li>Mancini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+size+and+deltaA+expression+predict+adult+neural+stem+cell+decisions+along+lineage+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression.</a> Science Adv. 9, 7519(2023).</li>
<li>Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+the+timing+of+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis+to+external+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+remodeling+of+extracellular+matrix+orients+epithelial+sheet+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Adv%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding.</a> Science Adv. 9, 2154(2023).</li>
<li>Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+multicellular+specimens+with+real-time+optimized+tiling+Light+sheet+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy.</a> Nat Commun. 7 (1), 11088(2016).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+Light+sheet+microscopy%3A+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>York, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+early+endosomal+maturations+emerge+from+a+stochastic+trigger-and-convert+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism.</a> Nat Commun. 14 (1), 4652(2023).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathfinding+by+identified+zebrafish+motoneurons+in+the+absence+of+muscle+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers.</a> J Neurosci. 17 (20), 7796(1997).</li>
<li>Rohde, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+timing+drives+the+vertebrate+segmentation+clock%27s+wave+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern.</a> eLife. , 13:RP93764 (2024).</li>
<li>Haynes, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLC4+shapes+axon+arbors+during+development+and+mediates+adult+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior.</a> eLife. 11, e74270(2022).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

将胚胎调整至合适的方向以观察目标区域，是成像过程中的限速步骤之一，常导致用户显微成像失败。在多视角光片显微镜中，这一问题尤为突出，因为样本被包埋在管状结构中，难以手动调整其方向。为辅助该过程，本研究报道了当含有胚胎的聚合物管直立放置于微量离心管中时，斑马鱼胚胎在卵膜内从70%外包期至早期体节阶段所呈现的各种位置的统计结果。
在70%下包阶段，垂直或水平方向的胚胎可提供整个胚胎发育事件的互补信息。水平方向便于从植物极观察动物极的细胞动态以及正在进行下包的细胞动态，而垂直方向则便于观察胚胎的背侧和腹侧，包括背侧组织中心的细胞动态、原肠作用期间细胞的内陷以及汇聚延伸流。本研究表明，如果在成像前数小时制备样品，仅凭偶然即可较大概率获得垂直方向的胚胎；然而，在这些阶段，水平方向的胚胎似乎较为少见。对于70%下包阶段之前的时期，建议用户在进行延时成像前，先记录胚胎在卵膜内的类似方向分布统计数据，因为提前掌握这些信息可从长远上节省时间。
从芽胚期开始，成像的最佳方向是将胚胎水平放置，因为这样可以沿胚胎的整个前后体轴观察细胞动态15。获得这种方向的胚胎相对简单，因为无论何时制备样品，大约25%的胚胎会自然处于这种稳定位置。通常情况下，为了对任何感兴趣的发育阶段进行成像，建议准备约15根试管，每管含有两到三个胚胎，这样可大大提高获得理想方向胚胎的概率，从而确保在任意一天都能成功完成显微成像。此外，建议在目标发育阶段前约一小时对试管进行筛选，以挑选出方向合适的胚胎用于延时成像。
在获得正确方向的胚胎后，需要考虑成像时的视图数量以及各视图之间的角度间隔。这取决于所需的最低空间和时间分辨率。对胚胎特定结构或区域成像的角度越多，空间分辨率越高（如图6所示），但这会牺牲时间分辨率。在本实验方案中，使用具有两个照明臂和一个检测臂的系统，在360°范围内以30°的角度间隔进行双通道成像，每个角度采集约100个z层，层间距为2 µm，单个时间点的成像耗时约3分钟。虽然该参数足以追踪早期胚胎发育阶段的细胞，但如果需要捕捉动态更快的生物学事件，则必须减少采集角度数量，以提高时间分辨率，但会降低空间分辨率，尤其是在需要分割细胞边界等精细结构时。另一种提高时间分辨率的可选方案是采用具有两个检测臂的多视角系统，该系统可显著提升数据采集速度，最近已被用于斑马鱼胚胎原肠胚形成过程中细胞运动的追踪16。此外，尽管本方案仅测试了20x/1 NA物镜，但根据待成像样本、所需空间分辨率以及视场范围，应选择合适的物镜。综上所述，应根据特定样本和视场范围所需的后续处理与定量分析，仔细选择视图数量和角度间隔。然而，对于整个早期斑马鱼胚胎的成像，尤其是需要从多个角度实现细胞尺度分辨率时，20x/1 NA物镜似乎是最佳选择：低倍率和低数值孔径（如10x/0.5 NA）的物镜分辨率显著降低，可能导致更多分割错误；而更高倍率和更高数值孔径的物镜则难以在相机视场范围内覆盖整个胚胎。
本研究中，为探讨样本封片与成像策略，采用了肌动蛋白标记物（可作为细胞边界示踪的替代指标）以及组蛋白标记物（用于检测和追踪细胞核）。事实上，此前已发表的多数使用多视角光片显微系统的研究所采用的标记物均与此类似5,7,15,16,27。选择这些标记物的主要原因是，多视角光片显微镜主要用于长时间（数小时至数天）观察组织尺度乃至整个胚胎中细胞尺度的动态过程（例如细胞形态变化和细胞重排）。另一方面，若需获得亚细胞分辨率，则可选用标记特定兴趣区域的转基因品系；但在这种情况下，多视角光片显微镜可能并非最佳仪器选择，而共聚焦显微镜、超分辨率成像系统，甚至晶格光片显微镜28,29&#160;可能更适用于所研究的问题。
所述方案在原肠胚形成期至15体节期的斑马鱼胚胎中（约17 hpf）无需任何修改即可良好适用30&#160;，尽管本文未对此进行测试，但该方案很可能也适用于原肠胚形成期之前的更早期胚胎。超过15体节期后，胚胎将开始出现自发性肌肉收缩30,31，可通过在样品管以及样品腔室中添加麻醉剂三卡因（tricaine）来抑制该现象。此外，在约18 hpf时，尾部开始从卵黄向外翻转30，导致胚胎移出视野范围。为解决此问题，需采用一种可追踪伸长末端的追踪算法，以保持胚胎处于焦点之中32。此外，对于去壳后较晚期的胚胎（例如用于观察神经发育的研究），需要采用另一种固定策略，正如近期研究所示33。
对于具有完整绒毛膜的斑马鱼胚胎进行成像时，使用20倍/1.0数值孔径的物镜无法在同一视野中同时捕获作为配准标记的微珠和胚胎本身。本研究提供了一种简单的替代方法，即利用位于样品上方或下方的微珠信息对不同视野进行配准，随后在图像处理过程中将配准信息从微珠转移到胚胎上。一旦通过此方式完成胚胎样品的配准，可进一步利用样品内部存在的细胞核作为配准标记进行第二轮配准，以精细调整初始配准结果。在进行延时成像时，细胞核信息还可用于连续时间点之间的配准，这一点此前已有报道21。该方案的一种替代方法是省略微珠，直接使用细胞核信息进行初始配准。但在BigStitcher插件中，这种配准方法常常失败（此处未展示），可能的原因包括：在处理过程中，胚胎深层的许多细胞核未能被检测到；此外，从某些角度观察时（例如在晚期上胚层形成阶段从腹侧观察），胚胎中可见的细胞核数量相对较少。
在本实验方案中，由于使用样本上方或下方的微珠信息进行图像配准，无需在与样本成像相同的视野中对微珠成像，因此可利用该方案仅对特定感兴趣区域进行高倍率、多角度成像，而非对整个胚胎进行成像。此外，通过利用样本之间的微珠信息进行配准，该方案可轻松适用于在管中垂直堆叠的多个样本的成像。

在长时间对活体胚胎进行高时空分辨率成像时，确保光毒性最小化是一个主要要求。在过去十年中，光片显微镜技术已成为满足这一要求的首选方法1,2,3,4,5,6,7。简而言之，该技术最早于2004年被用于捕捉发育过程8，其原理是两束对准的薄层激光从相对两端穿过胚胎，仅照亮目标平面。检测物镜被置于正交方向，从而同时收集样品中所有被照亮点发出的荧光。通过将胚胎逐层穿过静止的光片，即可获得三维图像。
此外，在该方法的一种特定形式——多视角光片显微镜技术中，样品可悬浮于聚合物管内，并通过转子旋转，从而实现从多个角度对同一胚胎进行成像9,10,11。成像完成后，基于配准标记物将来自不同角度的图像进行融合，这些标记物通常是胚胎内部的球形荧光标记（例如细胞核）或管壁上的荧光微珠。多视角成像与图像融合显著提高了轴向分辨率，实现三个维度上的各向同性分辨率12。尽管这是显著优势，但多视角方法的主要挑战在于样品装载，即胚胎必须在整个成像过程中被稳定地装载并固定在管内。
为了进行多视角成像，需要将胚胎固定以防止成像过程中发生移动，可将胚胎包埋于琼脂糖中。然而，这种方法通常会对胚胎的生长和发育产生不利影响，尤其是对本文所讨论的模式系统——早期斑马鱼胚胎13。另一种固定策略是使用一种内径略大于胚胎直径的细管，将胚胎连同胚胎培养液一起吸入管中，随后用琼脂糖塞封闭管底14。在此方法中，由于管内充满胚胎培养液，无法使用荧光微球等外部标记物作为不同视角图像融合的配准标记，因此图像配准必须依赖胚胎内部的天然结构作为标记。通常情况下，微球作为配准标记的效果更佳，因为受显微镜照明和检测深度的限制，胚胎内部标记信号在成像深度增加时会逐渐衰减。
因此，第三种方法（本文将详细描述并已在先前研究中使用过5,13,14,15,16）是对具有完整绒毛膜的早期斑马鱼胚胎进行成像，并在毛细管中填充含有作为配准标记的微珠的极低浓度琼脂糖。在此情况下，由于无法通过人工干预在绒毛膜内调整胚胎位置，本研究提供了早期斑马鱼胚胎自然沉降方向的统计结果，特别关注了70%原肠胚形成期和胚芽期。随后讨论了以细胞尺度分辨率对早期胚胎进行成像所需的最优视图数量，并详细描述了使用基于FIJI的插件BigStitcher进行图像融合的流程10,17,18。该方案结合使用20x/1 NA物镜，旨在帮助斑马鱼胚胎学研究人员利用多视角光片显微系统，对从原肠胚形成期到早期体节阶段的胚胎进行细胞核和膜标记的成像。

<table><tbody><tr><td>低凝胶温度琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12022</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>版本：ImageJ 1.54f</td></tr><tr><td>荧光红色羧基化改性聚苯乙烯乳胶微球，平均粒径 0.5 &amp;mu;m，水悬浮液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3280</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM1340</td><td>用于 H2A-mCherry 质粒的体外转录</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 套管 AWG 15L - 内径 1.58 mm × 壁厚 0.15 mm，公差 ±0.05&amp;nbsp;</td><td>Adtech Innovations in Fluoroplastics</td><td>STW15</td><td>PTFE 管</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗机</td><td>Labman</td><td>LMUC3</td><td>超声波破碎仪</td></tr><tr><td>Zeiss LightSheet 7 系统</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

早期斑马鱼胚胎的光片显微成像与样品制备策略

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

光片显微镜已成为对斑马鱼胚胎进行长时间活体成像的首选方法，具有极低的光毒性。特别是多视角系统，可通过旋转样品实现从不同角度对整个胚胎进行成像。然而，在大多数多视角系统的成像过程中，样品固定是一个繁琐的步骤，因为样品通常制备在聚合物管中。为协助完成这一过程，本实验方案描述了在70%外包层期至早期体节阶段之间对斑马鱼早期发育进行成像的基本固定策略。具体而言，本研究提供了胚胎在卵膜内处于70%外包层期和芽期时默认位置的统计信息。此外，本文讨论了在斑马鱼胚胎发育早期阶段进行全胚胎成像所需的最优角度数量及角度间隔，以便通过融合不同视角图像获取细胞尺度的信息。最后，由于胚胎占据了相机的整个视场（这是获得细胞尺度分辨率所必需的），本方案详细说明了如何利用位于胚胎上方或下方的微珠信息来实现不同视角图像之间的精确配准。

以精确的方式对样本进行定位是高效使用显微成像系统的关键环节。然而，在使用多视角光片显微系统时，由于需要将样本置于管状容器中制备，通常无法手动调整样本方向。因此，为了检测胚胎在卵膜内是否存在典型的空间取向，本研究在原肠胚形成期至早期体节阶段的时间序列成像背景下，选择在原肠形成70%阶段（约受精后7小时，hpf）对斑马鱼胚胎进行成像。当在70%原肠阶段成像前立即制备样本时，胚胎在不同样本间未表现出特定的常见取向。由于这种情况通常并不理想，因此样本在原肠胚形成前较早时间即完成制备，并在适当温度下保存于微量离心管中，直至成像开始。在此条件下，在70%原肠阶段（N = 3；n = 87个胚胎），胚胎的取向可分为三类：（1）水平方向，即胚胎的动-植极（AV）轴与聚合物管的长轴垂直；（2）垂直方向，即AV轴与聚合物管的长轴平行；（3）倾斜方向，即AV轴与管长轴呈锐角（图3A）。其中，水平方向出现频率最低，而垂直方向与倾斜方向的出现频率相当（图4）。
当胚胎保留在管中时，它们在各自的位置上保持稳定，直至90%原肠胚形成期，此后大多数胚胎改变了其方向。因此，需要在胚胎发生的芽胚期（约10 hpf）进行第二轮方向记录，以反映方向的变化。该步骤针对独立制备的样品进行。对于早期体节阶段的成像，先前有报道称，当胚胎的脊索与聚合物管的长轴呈正交方向时，为理想的方向，因为这可以沿轴线清晰观察到多个对称的体节形成15。当样品在原肠胚形成前制备时（N = 3，n = 93个胚胎），约25%的胚胎呈现此方向（图4），且这些胚胎在此方向上至少稳定至8体节期，与先前报道一致15。其余胚胎在芽胚期表现出多种其他方向（分类见图3B和图4）；然而，其中许多胚胎在早期体节形成过程中重新调整为水平方向。有趣的是，无论样品是在原肠胚形成前、70%原肠胚期，还是紧邻芽胚期前制备，芽胚期呈现水平方向的胚胎比例均相似。因此，对于需要成像体节阶段所关注的水平方向而言，样品制备的时间似乎不如在70%原肠胚期成像时关键。
多视角系统的优势在于能够从多个角度观察同一样本。然而，对于处于所述发育阶段的斑马鱼胚胎，要实现整个胚胎的细胞级分辨率所需的视角数量尚不明确。为表征这一点，使用检测光路中20倍/1.0数值孔径（NA）的物镜并设置放大倍数为1（对应光片厚度为4.57 µm）对斑马鱼胚胎进行成像。在此设置下，胚胎完全覆盖了像素尺寸为6.5 µm、成像面积为1920×1920像素的sCMOS相机的整个视场。通过对来自标记肌动蛋白丝的转基因品系（Utr-GFP）的单细胞期胚胎显微注射组蛋白标记的荧光蛋白mRNA（H2A-mCherry），可在胚胎中同时可视化细胞核与细胞膜。为了以不同角度间隔进行胚胎的多视角图像融合，对双转基因胚胎以及管中的微珠进行了360°成像，角度间隔分别为30°（70%上胚层形成期胚胎n = 3；出芽期胚胎n = 3）或45°（70%上胚层形成期胚胎n = 3；出芽期胚胎n = 3），每个角度采集约100个光学切片，切片间隔为2 µm。在图像处理过程中跳过交替角度，从而由30°和45°采集数据额外获得60°和90°的数据集。
然后利用微珠信息对获取的图像进行配准，并将配准参数转移至胚胎数据集，具体操作如方案部分所述。除90°数据集外，其余不同角度采集的数据均成功利用BigStitcher插件完成了配准，90°数据集配准失败可能源于每个角度对样品的覆盖范围较小。为克服此问题，在70%上胚层形成期和出芽期两个阶段，均以每90°采集约400层、层间距为2 µm的条件对胚胎进行成像，最终实现了成功配准（每个阶段n = 3个胚胎）。
下一步是对已配准的数据集进行多视角融合与去卷积。该过程采用4倍下采样以加快计算速度。如单个视角的细胞核成像及多视角重建的胚胎图像所示（图5），单个视角的视场较小，而经过融合后获得了完整胚胎的图像。在本展示中，细胞核的检测使用了基于FIJI的插件Mastodon（https://github.com/mastodon-sc/mastodon），该插件可通过FIJI软件“帮助”菜单中的“管理更新站点”（Manage Update Sites）添加，并在添加后于插件菜单中调用。检测时，首先将相应图像转换为XML/hdf5格式，随后使用Mastodon的“Detection”插件，采用DoG检测器（直径6 µm，质量阈值80）进行细胞核检测。
在不同的融合图像中， 90° 数据集在样品更深层显示出极高的背景信号，导致其不适合进行任何定量分析。因此，与较小的样品（如 果蝇 胚胎，这些样本经常使用以下方法进行成像： 90° 其他研究中的时间间隔9,22，但不建议使用20x/1 NA物镜对早期斑马鱼胚胎进行成像。介于两者之间的 30°, 45° 和 60° 融合的数据集在定性上显示，细胞核信息没有显著差异（图6B，顶行）；然而，使用 30° 融合数据集与其他数据集相比图6C，第一行）。
为了验证这一观察结果，使用 Mastodon 在每隔 30°、45° 和 60° 成像所获得的融合图像中检测细胞核。在融合图像中选择了三个区域进行分析，分别位于胚胎表面以下 20 µm（图 6A）、50 µm 和 100 µm 深度处。为了比较不同图像中细胞核检测的效率，按照上述方法对来自不同角度间隔的融合图像采用相同参数进行检测。在所有分析区域中，无论融合图像是通过每隔 30°、45° 还是 60° 成像获得，每个细胞核均被成功检测到（图 6B，底行）。因此，诸如细胞核之类的球状结构可在上述任意角度间隔下成像，且不会丢失任何信息。
为分析细胞边界，使用了Tissue Analyzer23，这是一种FIJI插件，常用于细胞分割24,25,26。与Mastodon类似，Tissue Analyzer插件可通过FIJI中“帮助”菜单下的“管理更新站点”部分添加，添加后可在插件菜单中访问。细胞边界的分割采用默认参数的分水岭算法，强模糊值根据组织深度在1.5至2之间调整，弱模糊值为1。所有分析中均保持这些参数不变，以利于直接比较。当将分割后的图像与原始输入图像进行人工比对时，发现存在错误，表现为软件未能检测到细胞边界，或绘制出实际不存在的细胞边界（图6C，底行）。将组织分析插件产生的错误数归一化为该区域内检测到的总连接数，并计算为“边界分割误差”。尽管在所有分析区域中均存在此类误差，但在以45°和60°角度间隔成像所获得的融合图像中，误差数量较30°时显著增加（图6D）。这表明，随着角度间隔的增大，融合图像的分辨率逐渐变差。因此，对于细胞边界等精细结构的分割，更小的角度间隔有助于后续处理的顺利进行。
<img alt="使用离心机和显微镜进行蛋白质纯化的样品制备与分析步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：使用聚合物管进行样品制备。（A）使用镊子从储存的微量离心管中取出一个聚合物管。（B）将该管连接至200 µL移液器的吸头末端。（C）借助移液器将胚胎吸入管中。（D,E）一个含有胚芽期胚胎的聚合物管，胚胎可见于管底。（F）将聚合物管放置在含有E3的培养皿中，以固化琼脂糖。（G）将聚合物管储存于装有E3的微量离心管中。（H）已安装聚合物管的组装式样品架。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多视角去卷积流程；成像软件中的工作流程图和配准结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用荧光小球进行多视角图像分析流程与配准。（A）多视角图像分析流程。（B）图像显示了FIJI插件BigStitcher中的“多视角浏览器（Multiview Explorer）”窗口，其中每个视角以单独的一行显示，并包含有关角度、通道、配准、兴趣点和点扩散函数（PSF）的信息。当选择某一视角并单击右键时，协议中讨论的所有命令将出现在弹出菜单中，如图所示。所选视角可在BigDataViewer窗口中进行可视化，如图所示。（C）以30°角度间隔成像获得的代表性荧光小球图像，在配准前（左）和配准后（右）的对比。所有角度的视角均已被选中并显示。比例尺：75 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="原肠胚形成70%时期和成束期胚胎的方向；体轴和发育阶段示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3： 胚胎默认方向的概述。显示胚胎在70%原肠胚形成期（A）和成束期（B）时在绒毛膜内的典型方向。每幅图的上排为光片显微系统获得的明场图像，下排为代表性示意图。（B）中的箭头指示脊索的位置，用于确定胚胎方向。Ap，动物极；Vp，植物极；A，前部；P，后部。比例尺：100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="原肠胚形成70%和成胚阶段胚胎方向百分比；柱状图；发育生物学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：不同胚胎方向的统计结果。（A）堆叠柱状图显示了在原肠胚形成前制备样本时，于原肠胚形成70%阶段落入所示方向的胚胎所占百分比。（B）堆叠柱状图显示了在原肠胚形成前（左）、原肠胚形成70%阶段（中）以及成胚阶段（右）制备样本时，于成胚阶段落入所示方向的胚胎所占百分比。N 表示获得胚胎的独立卵批数量；n 表示胚胎总数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多视角胚胎细胞核三维分布图，角度为0°、60°、120°，空间轴方向。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：多视角重建胚胎中细胞核的示意图。（A）该三维散点图展示了在每隔30°成像角度下重建的多视角胚胎中检测到的细胞核。每个圆圈代表一个细胞核，并标出了细胞核位置的质心。细胞核坐标通过FIJI插件Mastodon获得。（B）同一胚胎三个代表性视角下的细胞核三维散点图，各视图之间相隔60°。每个细胞核的颜色为随机分配。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多视角胚胎成像；细胞核与边界检测（H2A-mCherry，Ut-GFP）；误差量化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66735/66735fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：融合图像中细胞尺度信息的比较。（A）左侧图像显示了从表面下20 µm深度处重建的多视角胚胎的一个快照。黄色圆圈表示用于进一步分析的区域。比例尺：50 µm（所有图中）。（B）分别每隔30°、45°和60°采集的三组数据集中，胚胎表面下20 µm深度处细胞核的代表性原始图像（上图）。使用FIJI插件Mastodon在相同图像中检测到的细胞核（以绿色显示）（下图）。（C）分别每隔30°、45°和60°采集的三组数据集中，使用肌动蛋白标记物Utr-GFP获取的胚胎表面下20 µm深度处的代表性原始图像（上图）。使用FIJI插件Tissue Analyzer对相同图像进行的边界分割结果（下图）。箭头指示Tissue Analyzer在边界分割中的错误：黄色箭头表示缺失的边界，白色箭头表示在视觉上无明显边界处错误检测出的边界。（D）箱形图显示了在不同深度处，每隔30°、45°和60°采集的多视角重建胚胎中Tissue Analyzer产生的错误百分比。误差线表示1.5倍四分位距。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66735/66735fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了一种在完整卵膜内利用光片显微镜对早期斑马鱼胚胎进行成像的样品制备策略。该方法分析了胚胎在原肠胚形成70%期和胚芽期时于卵膜内所采取的不同方位，并详细阐述了如何利用光片显微系统在整个胚胎范围内获得细胞尺度分辨率的成像策略。

光片显微镜已成为对斑马鱼胚胎进行长时间活体成像的首选方法，因其光毒性极小。在……

尽管在左右轴上存在内部不对称性，但在大多数高等生物中，骨骼和肌肉等外部结构仍以对称方式发育。我们利用斑马鱼胚胎，结合高分辨率活体成像、定量分析和理论建模，研究对称性建立的基本原理。该领域高度依赖多种显微镜技术，以实现对发育中胚胎的高时空分辨率成像，随后对获取的图像进行定量分析。不同形式的显微镜技术具有各自独特的优势。然而，近年来，光片显微镜和活细胞超分辨率显微镜显著推动了我们对胚胎发育过程中动态事件的观察。传统的共聚焦显微镜和多光子显微镜在对活体胚胎成像时，除了视场有限之外，还常常导致光漂白和光毒性。多视角光片显微镜解决了这些问题，能够实现更长时间的观察和样本旋转。然而，该技术在样本制备和成像过程中的装样与固定方面仍存在挑战。成像成功的主要限制因素之一在于能否适当地固定和定向样本。本文介绍了将早期斑马鱼胚胎安装在多视角光片显微镜中进行成像的策略，以及获取和重建多视角图像的一般流程。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

早期斑马鱼胚胎的光片显微镜成像和安装策略

本文介绍了光片荧光显微镜的样品制备方法，并演示了一种用于长期成像的活体斑马鱼胚胎安装技术，该方法可在接近生理条件下对活体胚胎进行长时间延时摄影记录。...

光片显微镜样品制备：活体斑马鱼胚胎的长期成像固定方法

当胚胎被包埋在低浓度琼脂糖的光学透明聚合物管中时，可通过光片显微镜在数天内连续观察斑马鱼的发育过程。...

斑马鱼长期光片显微镜成像的多层封片技术

光片荧光显微镜是成像胚胎发育的优秀工具，能够在接近生理条件下对活体胚胎进行长时间的延时成像。我们展示了其在跨越广泛时空尺度下斑马鱼眼部发育成像中的应用，并提供了一套多视角数据集融合与去卷积的处理流程。...

利用光片荧光显微镜成像斑马鱼眼睛发育过程

本文介绍了一种通用的固定方法，可在不干扰斑马鱼胚胎正常发育的情况下，实现对活体斑马鱼胚胎后部体轴发育过程的长期延时成像。...

一种用于斑马鱼发育长期成像的通用固定方法

本文介绍了一种用于长时间延时共聚焦显微镜观察的脆弱斑马鱼胚胎固定方法。该低成本方法易于操作，可使用常规的玻璃底培养皿，在任何倒置显微镜上进行成像。固定过程采用不同浓度的琼脂糖分层进行。...

一种用于延长斑马鱼全胚胎共聚焦显微延时成像的分层封片方法

光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。在比较研究中，一个主要问题是环境变异。我们的实验方案描述了一种可同时对多个样本进行活体成像的实验框架，从而主动解决了这一问题。...

基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

此处，一种 方案是 提供 使用市售的光片显微镜和图像处理工作站对眼球形态发生过程进行延时成像，并分析所得数据。本方案详细描述了胚胎麻醉、包埋于低熔点琼脂糖、在成像腔室中悬浮、设置成像参数，以及最终利用图像分析软件对成像数据进行分析的操作步骤。...

利用rx3:GFP转基因斑马鱼通过光片显微镜观察眼部形态发生过程

我们介绍了用于研究斑马鱼心脏的优化工具 体内...

斑马鱼胚胎中心脏快速动态的光片显微成像

本文所述方法利用能够进行光学切片的荧光解剖显微镜，以及简单的重新调整策略来校正焦平面和层面漂移，从而实现对斑马鱼胚胎器官发育过程的延时分析。...

利用配备光学切片功能的解剖显微镜通过延时成像分析斑马鱼肾脏发育

本文介绍一种用于在透射光和荧光显微镜下进行活体延时成像的新技术，以体外（ex...

一种用于早期鸡胚长期 Ex Ovo 活体延时成像的浸没式滤纸夹心培养法

了解光片显微镜技术用于早期斑马鱼胚胎高分辨率活体成像的方法。该技术可减少光漂白和光毒性，实现细胞级分辨率的动态发育过程观察，为发育生物学研究提供重要工具。

早期斑马鱼胚胎的光片显微成像与样品制备策略

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