利用人肠道类器官在单细胞转录水平研究小肠上皮

我们正在整合单细胞转录组学与类器官技术，以更深入地理解小肠的生物学特性。这些技术使我们能够更深入地洞察该组织内存在的细胞异质性。提高通量、灵敏度和分辨率的工具是推动该领域研究进步的关键。

一些示例包括改进的计算方法和技术革新。降低成本也是一个主要关注点。文库或样本的制备与测序过程可能引起转录变异，这是其中一个挑战。

对于类器官而言，特定的挑战包括空间背景信息或时间动态信息有限。对人类肠道类器官进行单细胞分析，能够提供以往无法获得的关于构成肠道上皮细胞类型的详细信息，从而揭示这些细胞的转录组景观。

我们正在利用这些技术来鉴定人类肠道疾病的生物标志物和发病机制。这些生物标志物和机制将提升我们采用基于个体化医学的方法治疗人类疾病的能力，从而整体改善人类健康。首先，在37摄氏度条件下解冻酶法细胞消化试剂30分钟。

在10倍放大倍率的明场显微镜下，观察已分化的三维人肠道类器官，以确保细胞状态良好。将含有已分化类器官的24孔板各孔中的培养基更换为500 µL冷的细胞回收溶液。通过移液器反复吹打，使细胞从基底膜上脱离。

将细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中。冰上孵育10分钟，每5分钟上下吹打一次。在4°C条件下，以400g离心3分钟。

从离心管中移除上清液，注意不要扰动沉淀。将沉淀重悬于500 µL预热的酶法细胞消化试剂中，上下吹打10次。将类器官置于37°C二氧化碳培养箱中孵育30分钟。

每10分钟使用P1000移液器将全部体积上下吹打10次，以促进细胞解离。将细胞悬液在4°C下以400g离心3分钟，弃上清后将沉淀重悬于1毫升分化培养基中。在冰上迅速上下吹打细胞50次，使类器官解离为单细胞。

将全部体积通过70微米尖端滤器过滤，并将滤液收集到一个新的1.5毫升离心管中。随后将所得滤液通过40微米尖端滤器上的70微米滤器进行二次过滤。取5微升0.4%台盼蓝溶液与5微升细胞悬液混合，通过台盼蓝排斥法计数可存活的单细胞。

用细胞培养基稀释样本，使浓度达到每微升1,000个细胞。共从分化的回肠三维人肠道类器官中分离出4,402个单细胞，这些细胞代表了预期的细胞类型，包括吸收性肠上皮细胞和分泌性细胞。首先，将装有预热的酶消化细胞试剂的15毫升离心管置于37°C培养箱中，待用。

将500微升新配制的PBS EDTA分装至24孔板的各孔中。在明场显微镜下观察分化后的三维人肠类器官及transwell的生长情况。将细胞培养小室从生长培养基转移至PBS EDTA溶液中。

从顶端去除培养基，加入 100 微升不含细胞层扰动的 PBS EDTA。弃去 PBS EDTA 后，将小室从孔中取出，轻轻在纸巾边缘吸去液体，并将其倒置放在实验台面上。使用锋利的手术刀片，沿膜的内周切割，以将膜从小室中分离。

用镊子将膜转移至含有 200 微升预热的酶法细胞消化试剂的 1.5 毫升离心管中。将膜置于 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育 30 分钟。每隔 10 分钟，使用 P200 移液器将全部液体吹打 5 次。

每隔10分钟取1至2微升细胞悬液转移至玻片上，通过定性评估单细胞所占百分比来判断解离程度。解离完成后，将每种条件下的三个重复孔的细胞合并至一个1.5毫升微量离心管中。加入400微升含有10微摩尔ROCK抑制剂的细胞培养分化培养基，轻轻吹打混匀。

将全部体积通过70微米尖端滤器过滤，收集滤过液至新的1.5毫升离心管中。随后将所得滤过液通过置于40微米尖端滤器上的70微米滤器进行二次过滤。取5微升0.4%台盼蓝与5微升细胞悬液混合，计数可存活的单细胞。

用WRNE生长培养基稀释样品，使每微升含有1,000个细胞。共从生长在膜式细胞培养插入物上的分化空肠人肠类器官中分离出5,623个单细胞。首先，准备用于人肠类器官消化的酶解细胞消化试剂和PBS EDTA。

在明场显微镜下，确认分化后的三维人肠道类器官以单层形式生长。弃去单层培养中的细胞培养基，每孔加入 100 微升 PBS EDTA。去除 PBS EDTA 后，向每孔加入 100 微升预热的酶解细胞消化试剂。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中，每隔10分钟用移液器将全部液体吹打5次，持续20至30分钟。每隔10分钟取1至2微升细胞悬液转移至玻片上，通过观察单细胞所占百分比来评估解离程度。解离完成后，将每种条件下的三个重复孔细胞合并至一个1.5毫升微量离心管中。

加入700微升含有10微摩尔RCOK抑制剂的细胞培养分化培养基，用移液器轻轻混匀。将全部体积通过70微米尖端滤器过滤，收集滤过液至新的1.5毫升离心管中。将所得滤过液通过置于40微米尖端滤器上的70微米滤器再次过滤。

取5 µL的0.4%台盼蓝与5 µL细胞悬液混合，计数可存活的单细胞。用含有ROCK抑制剂的细胞培养基稀释样品，使浓度达到每微升1,000个细胞。共从在96孔板中培养的分化空肠人肠类器官中分离出9,952个单细胞。