获取急性 LCMV 感染小鼠中病毒特异性滤泡辅助性 CD4⁺ T 细胞早期分化的研究方法

我们的研究描述了评估病毒特异性滤泡辅助性T细胞（TFH细胞）早期分化命运的可重复方法，包括建立急性感染的多克隆小鼠模型、进行流式细胞术染色以及基于逆转录病毒载体的基因操作。与体外T细胞刺激相比，体内刺激可在12小时内更快地激活T细胞，并使其充分活化以利于后续的逆转录病毒转导。我们的研究结果有助于深入探索不同类型特异性TFH细胞早期分化的分子机制。

此外，我们的研究将有助于理解T细胞依赖的体液免疫、谦逊机制，并优化疫苗设计。首先，取一只六至八周龄的CD45.1阳性智能小鼠，通过静脉注射200微克LCMV GP61-77多肽溶于100微升RPMI培养基中。从小鼠中获取脾细胞后，将其悬浮于2% RPMI中，调整细胞密度至1 × 10⁸ 个细胞/毫升，并将含有细胞的离心管置于冰上。

向圆底96孔板的每个孔中加入50微升细胞悬液和150微升染色缓冲液。在4摄氏度下，以800×g离心96孔板1分钟，然后小心弃去上清液。

涡旋混匀平板，向每孔加入 200 µL 染色缓冲液。离心沉淀细胞后，在冰上避光孵育 30 分钟，加入表面抗体混合液重悬细胞。洗涤两次后，将细胞重悬于 200 µL 静置缓冲液中，并转移至流式细胞仪检测管中。

通过流式细胞术分析检测智能检测CD4阳性T细胞的活化状态。随后将每孔1×10⁶个智能CD4阳性T细胞接种至24孔板中。在4°C、800 ×g条件下离心3分钟，沉淀细胞，并小心移除上清培养基。

接下来，向每个孔中加入1 mL逆转录病毒培养基和8 µg聚凝胺。在37°C、800 ×g条件下离心转导细胞2小时。弃去逆转录病毒培养基后，用1 mL预热的含白细胞介素-2的10% RPMI培养基孵育细胞。

将细胞悬液转移至15毫升锥形管中并进行离心。弃去上清液后，用2% RPMI重悬细胞，使细胞密度达到每毫升1 × 10⁸个细胞。为评估转导效率，取50微升细胞悬液分装至圆底96孔板中。

将细胞与包含 CD4、Vα2 和载体标签相关抗体的表面抗体混合物一起在冰上孵育。洗涤细胞后，按照之前展示的方法进行流式细胞术分析。随后，将 1 × 10⁶ 个 CD45.1 阳性的 Smart-Test CD4 阳性 T 细胞通过静脉注射入 C57BL/6 受体小鼠体内，次日再给予 1 × 10⁶ 个噬斑形成单位的 LCMV Armstrong 病毒。

从小鼠中获取脾细胞后，对其进行染色以检测目标标志物。为检测转录因子，将细胞与200微升2%多聚甲醛在室温下避光孵育20分钟。最后进行流式细胞术，以检测急性LCMV感染早期阶段的因子表达情况。

感染后第三天，在MIGR1 SMART2 CD4阳性T细胞中发现滤泡辅助性T细胞与T辅助细胞1的分化达到平衡。而在MigR1 BCL6 Smart CD4阳性T细胞中，则观察到以滤泡辅助性T细胞为主的分化方向以及增强的BCL6表达水平。