Name: 一种在小鼠胚胎心脏中进行基因递送的高效转基因方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:25:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: 了解基于电穿孔的转基因技术在小鼠胚胎心脏中进行基因递送的方法。该技术可快速筛选基因功能，为心脏发育研究提供高效且经济的替代方案。

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本研究由西班牙科学与创新部资助项目 RTI2018-097617-J-I00 支持&#769;n 以及来自安达卢西亚政府的 Acción 9 资助；O.H.O. 获得西班牙科学与创新部项目基金 PGC2018-096486-B-I00 资助&#769;n 以及欧盟“地平线2020”计划（H2020-MSCA-ITN-2016-722427）向 M.T. 提供的资助。J.M.G. 获得了西班牙科学部和塞韦罗·奥乔亚基金会（PRE2022-101884）提供的博士奖学金。国家心血管研究中心（CNIC）和生物分子与细胞生物学研究中心（CBMSO）均得到西班牙科学部的支持，CNIC 还获得了 ProCNIC 基金会的支持。

所有动物实验均经国家心血管研究中心（CNIC）动物实验伦理委员会批准，并符合现行法律法规，包括欧盟指令2010/63/EU和建议书2007/526/EC，以及西班牙皇家法令Real Decreto 53/2013的实施规定。本实验方案采用15至21周龄的雌性野生型CD-1小鼠。有关所用动物、试剂和仪器设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 质粒与工具的准备
<ol>
	<li>首先，在冰上配制电穿孔混合液，加入所需质粒 DNA，使其终浓度为 1 µg/µL。然后加入蔗糖至终浓度 6%（溶于 PBS），再加入生物相容性染料至 0.01%，最后用 PBS 补足至终体积 30 µL。 
	注意：每个样品约使用 1–2 µL 电穿孔混合液。请根据实验中样品的数量按比例调整电穿孔混合液的配制量。请注意，用于电穿孔的 DNA 应从细菌培养物中纯化获得，以确保其最佳稳定性和最低杂质含量。有关本研究中所用质粒的更多细节，请参见代表性结果部分。</li>
	<li>通过在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加 10% 胎牛血清（FBS）、2% HEPES 缓冲液和 1% 青霉素/链霉素来配制生长培养基。将培养基置于 37 °C 培养箱中保温备用。同时，将 1× PBS 与生长培养基一同预热至 37 °C。</li>
	<li>使用拉针仪拉制针头：采用直径为 20 µm 的玻璃毛细管，设置参数为：加热 = 550；拉力 = 100；速度 = 250；时间 = 120。拉制后的最终针尖直径应约为 5–8 µm。</li>
	<li>设置电穿孔仪参数为 40 V、5 次循环，每次持续 50 ms，间隔 900 ms。准备好电极、口吸管和钝头针（图 3A）。将针头安装到口吸管上以加载 DNA（图 3A）。</li>
</ol>
2. 胚胎解剖与心脏提取
<ol>
	<li>建立野生型 CD-1 小鼠的交配组合。次日早晨，挑选出现阴道栓的雌鼠，并将该时间记为胚胎发育第 E0.5 天。按照机构批准的方案，于胚胎发育第 E12–12.5 天通过颈椎脱臼法处死动物。</li>
	<li>小心取出小鼠子宫并置于干燥的纸巾上。随后使用精细剪刀从子宫系膜侧插入剪刀尖端，沿刀刃缓慢剪开整个子宫长度。暴露蜕膜组织，并将其转移至生长培养基中。更多细节请参见 Behringer 等人的研究20。</li>
	<li>解剖蜕膜以分离胚胎，然后将胚胎放入盛有温热生长培养基的 60 mm 培养皿中。使用精细镊子小心剪除胚胎的尾部和头部，仅保留躯干部。可通过评估解剖学特征来确认胚胎发育阶段，具体方法如 Wong 等人所述21。</li>
	<li>接着，在不损伤心脏及肺动脉和主动脉的前提下，小心尽可能多地去除胚胎躯干部分的周围组织。暴露心脏后，立即将其放入新鲜的温热生长培养基中，并在 37 °C 培养箱中保存直至进行电穿孔。 
	注意：维持心脏温度对其存活至关重要。确保培养基始终温热，并每 5–10 分钟更换一次。另一方面，操作样品时无需保持无菌条件，因为这不会影响实验效率。请注意，生长培养基中含有抗生素。</li>
</ol>
3. 心脏电穿孔及 离体 培养
<ol>
	<li>用口吸管小心吸取约 10 µL 质粒混合物（按步骤 1.1 制备），将其加载至针头中。</li>
	<li>将单个心脏置于洁净的 60 mm 培养皿中，加入已预热至 37 °C 的无菌 1× PBS，以准备电穿孔。将培养皿置于解剖显微镜下（图 3A）。</li>
	<li>调节正负电极之间的距离至约 4 mm，以准备电极（图 3B）。 
	注意：4 mm 是本研究中所用电极适用于 E12.5 小鼠心脏的孔径距离。请根据不同的样本尺寸或电极规格考虑调整该距离。</li>
	<li>用口吸管的针头轻轻刺入心脏最表层组织，小心注入 1–2 µL 质粒混合物后撤出针头。可进行多次注射，以确保充分渗透并增加电穿孔细胞的数量。</li>
	<li>固定电极位置，使心脏位于两极之间（图 3C），然后按照上述条件对心脏进行电穿孔。 
	注意：为确保最大电穿孔效率，可切换电极极性并施加另一次脉冲。</li>
	<li>将电穿孔后的心脏转移至含有 1 mL 培养基的新 12 孔板中，并置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
	<li>重复步骤 3.1 至 3.6，直至实验中所有样本均完成电穿孔。最后，将所有心脏置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 24 h，或培养至进行分析为止。 
	注意：据我们经验，心脏在培养中可维持长达 48 h 而无明显退化迹象（补充视频 1；补充视频 2；补充图 1）。</li>
</ol>
<img alt="电穿孔装置示意图，包含培养皿和电极，用于展示将DNA导入细胞的方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：电穿孔装置示意图。（A）用于电穿孔的实验装置。红色箭头分别指示电穿孔仪、电极以及进行心脏电穿孔操作的培养皿。（A'）电穿孔针头的放大细节图，对应于（A）中白色矩形框所示区域。（B）E12.5期心脏所用电极间距的调整细节。（C）电穿孔过程的示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
4. 细胞分选和免疫组织化学分析
<ol>
	<li>进行样品的细胞分选分析时，配制消化液以解离组织：将 400 µL 的 liberase（5 mg/mL）、300 µL 的 dispase（0.1 g/mL）、4 µL 的 CaCl2（0.4 µM）、50 µL 的 MgCl2（5 µM）混合，并用 DMEM 定容至 10 mL。使用前置于冰上保存。每颗心脏约需 1 mL 消化液。根据样本数量调整体积。 
	注意：如用于免疫组织化学，可将心脏直接置于 1.5 mL 的 4% 多聚甲醛（PFA）中，在室温下固定 2 小时，或在 4 °C 下过夜。次日，用 PBS 洗涤心脏 3 次，随后进行后续组织学和免疫染色操作。详细的免疫组织化学方案请参考 Morris 等人22。</li>
	<li>将每颗培养的心脏转移至含有 1 mL 冰冷消化液的新离心管中。</li>
	<li>为促进组织解离，用移液器轻轻吹打组织 3–4 次，随后立即在 37 °C、600 rpm 条件下的加热板上孵育 45 分钟。</li>
	<li>将消化后的混合液通过 70 µm 细胞滤网过滤至新离心管中，依靠重力自然滤尽。收集滤过液后，再用 40 µm 细胞滤网过滤至新的 50 mL 离心管中。</li>
	<li>加入 500 µL 胎牛血清（FBS），并用冷 DMEM 定容至 30 mL。</li>
	<li>在室温下以 240 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将 50 mL 离心管倒置于纸巾上，使其完全干燥。 
	注意：此时可暂停实验，将细胞沉淀冷冻保存。若需冷冻，用含 10% DMSO 的 FBS 重悬细胞，并于 -80 °C 保存。</li>
	<li>进行细胞分选时，将细胞重悬于 300 µL 分选缓冲液（含 1% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 PBS）中，并加入 0.3 µL DAPI（1000 倍稀释）。随后进行细胞分选。</li>
</ol>

Electroporation-Based Transgenesis of Cardiac Cells in Mouse Hearts

<ol><li>Tyser, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+handling+precedes+cardiac+differentiation+to+initiate+the+first+heartbeat%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat.</a> eLife. 5, e17113(2016).</li>
<li>Tyser, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+common+progenitor+pool+of+the+epicardium+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium.</a> Science. 371 (6533), 2986(2021).</li>
<li>Sendra, M., Domínguez, J., Torres, M., Ocaña, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+complexity+of+early+heart+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Dev+Dis%22%5BJournal%5D)">Dissecting the complexity of early heart progenitor cells.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5(2021).</li>
<li>Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+heart+tube+development+in+mouse+reveals+alternating+phases+of+cardiac+differentiation+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis.</a> eLife. 6, e30668(2017).</li>
<li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canonical+Wnt+signaling+functions+in+second+heart+field+to+promote+right+ventricular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth.</a> PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).</li>
<li>Zimmerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+burden+of+congenital+heart+disease%2C+1990-2017%3A+A+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Chil+Adolesc+Heal%22%5BJournal%5D)">regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).</li>
<li>Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mending+broken+hearts%3A+Cardiac+development+as+a+basis+for+adult+heart+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li>
<li>Cao, J., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicardium+as+a+hub+for+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The epicardium as a hub for heart regeneration.</a> Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors%5BTitle%5D)+AND+%22JCI%22%5BJournal%5D)">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li>
<li>Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PLOS One. 7 (9), e44692(2012).</li>
<li>Hesse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+defines+heterogeneity+of+epicardial+cells+and+fibroblasts+within+the+infarcted+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart.</a> eLife. 10, e65921(2021).</li>
<li>Streef, T. J., Smits, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+contribution+to+the+developing+and+injured+heart%3A+Exploring+the+Cellular+composition+of+the+epicardium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 750243(2021).</li>
<li>Sanchez-Fernandez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+epicardial+cell+heterogeneity+during+cardiogenesis+and+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Dev+Dis%22%5BJournal%5D)">Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376(2023).</li>
<li>Quijada, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+endothelial+cell+positioning+and+fate+specification+by+the+epicardium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium.</a> Nat Commun. 12 (1), 4155(2021).</li>
<li>Mantri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+single-cell+RNA+sequencing+of+developing+chicken+hearts+identifies+interplay+between+cellular+differentiation+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis.</a> Nat Commun. 12 (1), 1771(2021).</li>
<li>Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeobox+gene+Meis1+modulates+cardiovascular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration.</a> Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).</li>
<li>Stankunas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pbx%2FMeis+deficiencies+demonstrate+multigenetic+origins+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease.</a> Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+Meis1+act+as+a+new+regulator+of+ischemic+arrhythmias+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Adv+Res%22%5BJournal%5D)">Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice.</a> J Adv Res. 39, 275-289 (2022).</li>
<li>Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+mouse+embryo%3A+A+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Lab Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).</li>
<li>Wong, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+atlas+of+the+mouse+embryo+for+precise+morphological+staging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging.</a> Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).</li>
<li>Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TdTomato+and+EGFP+identification+in+histological+sections%3A+Insight+and+alternatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives.</a> Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).</li>
<li>Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+myosins%3A+expression+patterns+and+functional+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet.+Muscle%22%5BJournal%5D)">Developmental myosins: expression patterns and functional significance.</a> Skelet. Muscle. 5 (1), 22(2015).</li>
<li>Eissa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+reference+genes+for+messenger+RNA+quantification+by+real-time+pcr+in+mouse+dextran+sodium+sulfate+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis.</a> PLOS One. 11 (5), e0156289(2016).</li>
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<li>Carmona, R., Barrena, S., López Gambero, A. J., Rojas, A., Muñoz-Chápuli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+cell+lineages+and+the+origin+of+the+coronary+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium.</a> FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).</li>
<li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium-derived+cells+contribute+a+novel+population+to+the+myocardial+wall+and+the+atrioventricular+cushions%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions.</a> Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).</li>
<li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+types%2C+methods+and+strategies%3A+A+technical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Peer+J%22%5BJournal%5D)">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> Peer J. 9, e11165(2021).</li>
<li>Kałużna, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+human+heart+ex+vivo-Current+possibilities+and+strive+for+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22JTERM%22%5BJournal%5D)">Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications.</a> JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).</li>
<li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li>
<li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ex+vivo+culture+method+for+the+embryonic+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. (75), e50359(2013).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

总体而言，本文所述方法为在发育中的心外膜中表达转基因构建体提供了一个可靠的框架（图4B），Meis1过表达的结果已对此进行了验证（图4C）。通过使用适当的构建体，本方案可用于 transient 地评估特定基因的功能获得（GOF）或功能丧失（LOF）效应。LOF效应可通过转染靶向候选基因的RNA干扰质粒来实现26。基因GOF或LOF的快速评估具有显著优势，特别是考虑到心外膜细胞存在较大的转录组异质性12，这使得为逐一评估每个候选基因而构建转基因动物变得不切实际。
由于该方案采用离体（ex vivo）培养，因此可在特定时间窗口内研究心外膜细胞的命运。发育中的心外膜在成年心脏不同区域的形成过程中发挥关键作用13,27,28；因此，了解其对心脏发育的贡献对于解析先天性心脏畸形的基础机制具有重要意义。尽管本文未深入探讨这一应用，但本方案中概述的指导原则可能对未来的心外膜命运图谱研究具有参考价值
尽管当前方法具有实际应用价值，但仍需承认其存在某些局限性。由于该方法依赖于瞬时转基因技术，质粒表达可能随着时间推移而丢失或减弱，从而限制了本方案用于研究特定发育阶段的时间范围29然而，在本研究中，GFP的过表达在整个电穿孔后培养期间（48 hpe）均得以维持。此外，当前研究可能存在的一些局限性 离体 培养技术限制了该方法在评估晚期胚胎或出生后发育阶段中的适用性，尤其是在以下情况中 离体 电穿孔后的培养变得困难30. 尽管存在更为复杂的方法 离体 胚胎培养存在31,32它们可能需要使用研究人员较难获得的设备，且无法保证样本的存活。
尽管本实验方案的设计力求尽可能简单以提高可重复性，但仍包含若干对成功至关重要的关键步骤。首先，胚胎解剖必须谨慎且迅速地进行，以尽量减少对心脏的损伤，否则可能影响电穿孔后器官的存活。强烈建议在此步骤中格外小心，并使用最佳的解剖器械。本方案的另一个关键环节是电穿孔操作本身，因为质粒注射不足可能导致不良结果。因此，建议在单个心脏上进行多次注射，且以相对表浅的方式注射可能有助于提高器官存活率。最后，在心脏处理过程中的细胞解离必须严格按方案规定的时间进行，以最大限度地提高细胞活力。
综上所述，鉴定心脏形成过程中的关键基因对于理解先天性心脏病的潜在机制及心脏再生具有重要意义。本文建立的方法可实现对发育中心脏的基因功能获得（GOF）和功能缺失（LOF）效应的快速筛选。尽管存在某些局限性，该方法仍具有较大的拓展潜力，可用于不同发育阶段的研究，或用于追踪胚胎期心外膜细胞的命运。通过本文提供的可视化操作指南，我们旨在为评估发育中心外膜的复杂性与潜能提供一套有价值的工具箱。

心脏是胚胎发育过程中最先形成的器官。这一过程涉及来自胚胎不同区域的多种前体细胞群在时空上的协调作用。在此期间，发育中的心脏持续跳动并发挥功能，凸显了其形成过程中所需的精妙协调性1,2,3。鉴于心脏的重要作用，其正常发育依赖于细胞和分子水平上的严密调控4,5。揭示调控心脏发育的机制一直备受关注，因为这些机制对于阐明影响全球大量患者的先天性心脏病至关重要6。此外，理解心脏发育过程对于解析心脏再生机制也具有关键意义，因为哺乳动物出生后的心脏仍具备一定的再生能力，但在成年后该能力丧失或受到抑制7,8。因此，解析心脏发育的分子调控机制对于推进先天性心脏病和心脏再生的研究至关重要。
为了实现这一目标，人们日益关注研究心外膜在心脏发育和再生中的作用9。心外膜是一层薄薄的间皮组织，构成哺乳动物心脏的最外层（图1）。最近的研究表明，心外膜在心脏损伤过程中具有重要作用，能够向受损区域的心肌细胞传递增殖信号，从而减轻损伤10,11。尽管心外膜至关重要，但其高度异质性为深入开展分子研究带来了挑战。单细胞RNA测序实验揭示了心外膜的异质性，其中包含多个具有不同转录组特征的细胞亚群12,13,14,15,16。因此，筛选心脏发育潜在调控因子的策略必须考虑到心外膜前体细胞的多样性。
从这一角度来看，小鼠模型易于进行遗传修饰的特性促进了众多心脏发育关键基因的鉴定，使得研究人员能够构建特定基因获得功能（GOF）或丧失功能（LOF）的突变品系。然而，这些方法需要耗费大量时间和实验资源，因此在评估大量候选基因功能时并不切实际。此外，发育相关基因通常在不同组织中具有多效性功能，或在早期胚胎发育过程中发挥必需作用，这使得解析其在特定发育过程中的具体贡献变得困难。尽管可以针对特定结构或发育时间点进行基因功能调控，但这通常需要使用更为复杂的遗传构建策略，而这类策略往往难以实现或通常无法获得。
为克服这些局限性，我们提出了一种电穿孔小鼠胚胎心脏以实现瞬时转基因的方法图2）。配对使用 离体 培养与荧光激活细胞分选（FACS），该策略通过瞬时过表达Meis1（一个在心脏发育与再生中作用明确的基因）来展示其功能17,18,19本文还探讨了该方法的其他潜在应用，并讨论了其优势与局限性，同时将其与现有的瞬时调控基因表达的实验方案进行了比较。我们相信，本文所呈现的框架和可视化示例将有助于加深对发育及疾病过程中心外膜生物学的理解。
<img alt="显示心腔和心壁各层（心包膜、心外膜、心肌层、心内膜）的心脏解剖图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：小鼠胚胎心脏各层结构。 E13-14期小鼠胚胎心脏冠状切面示意图。心脏的三个主要细胞层分别用黄色（心内膜）、红色（心肌层）和蓝色（心外膜）表示。心包膜以棕色线条表示。心脏的四个腔室缩写如下：LV，左心室；RV，右心室；LA，左心房；RA，右心房。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎心脏电穿孔示意图；质粒制备、解剖、培养、分选时间线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：心脏电穿孔实验方案的示意图概述。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>#55 镊子</td><td>杜蒙特&amp;nbsp;</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>12孔透明平底多孔细胞培养板</td><td>BD Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 台式虎钳&amp;nbsp;</td><td>Grandado</td><td>SKU 8798771617573</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m细胞筛</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m细胞筛</td><td>康宁</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP多克隆抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A10262</td><td>使用1:1000稀释度</td></tr><tr><td>抗肌球蛋白4（MF20）单克隆抗体</td><td>Invitrogen</td><td>14-6503-82</td><td>使用1:500稀释度</td></tr><tr><td>CD1 野生型小鼠</td><td></td><td></td><td>由中国实验动物中心（CNIC）提供</td></tr><tr><td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) 抗体</td><td>细胞信号转导技术</td><td>9661</td><td>使用1:400稀释度</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>细胞信号传导技术</td><td>4083</td><td>使用1:1000稀释度</td></tr><tr><td>中性蛋白酶/胶原酶</td><td>罗氏</td><td>10269638001</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM - 达尔伯克改良伊格尔培养基</td><td>Gibco</td><td>10313021</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i CO2 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51032720</td><td></td></tr><tr><td>Leica 体视显微镜 S8AP0</td><td>Leica</td><td>11524102</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>罗氏</td><td>5401119001</td><td></td></tr><tr><td>显微移液器拉制仪 型号 P-97</td><td>Sutter Instrument</td><td>SU-P-97</td><td></td></tr><tr><td>pCAG表达质粒</td><td>Addgene</td><td>#89689</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>35 毫米培养皿 &amp;times; 10 mm</td><td>BD Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿 &amp;times; 15 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>默克</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td></td><td></td><td>来自旧实验室设备的再利用</td></tr><tr><td>大鼠血清培养胚胎，雄性大鼠 SPRAGUE DAWLEY RjHan SD</td><td>Janvier Labs</td><td>9979</td><td></td></tr><tr><td>重组抗威尔姆斯肿瘤蛋白1（WT1）抗体</td><td>Abcam</td><td>ab89901</td><td>使用1:300稀释度</td></tr><tr><td>方波电穿孔仪 CUY21SC</td><td>Nepa 基因</td><td>CUY664-10X15</td><td></td></tr><tr><td>无菌 PBS</td><td></td><td></td><td>由技术部门提供并灭菌</td></tr><tr><td>蔗糖&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>可调间隙镊子电极</td><td>Nepa 基因</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr></tbody></table>

一种高效转基因方法用于小鼠胚胎心脏的基因递送

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

哺乳动物的心脏是在发育过程中形成的复杂器官 通过 高度多样化的前体细胞群体。这些前体细胞的来源、招募时间及其命运对器官的正常发育至关重要。调控心脏形态发生的分子机制，对于理解先天性心脏病的发病机制以及胚胎期心脏再生具有重要意义。传统研究这些机制的方法依赖于构建转基因小鼠，以评估特定基因在心脏发育过程中的功能。然而，小鼠转基因技术复杂且耗时，通常难以用于快速评估特定基因在心脏发育中的作用。为解决这一问题，我们建立了一种高效的小鼠胚胎心脏电穿孔与培养方案，可实现瞬时转基因，从而快速评估与心脏发育相关基因的功能获得或功能缺失效应。利用该方法，我们成功在胚胎心脏中过表达了Meis1，且该基因转染更倾向于心外膜细胞，充分展示了该技术的应用潜力。

为了验证该技术在心脏发育相关调控因子的功能获得（GOF）实验中的有效性，通过电穿孔导入了过表达Meis1转录因子的构建体。为此，从E9.5胚胎中提取RNA，并进行逆转录以获得互补DNA（cDNA）。以cDNA为模板，将Meis1编码序列克隆至pCAG表达质粒中（后文简称pCAG::Meis1）（补充表 1），同时使用组成型表达GFP的质粒（pCAG::GFP）作为对照。随后对心脏组织进行电穿孔，分别导入pCAG::GFP单独或与pCAG::Meis1联合的质粒。
电穿孔后24小时（hpe），心脏仍在跳动，且外观状态良好（图4A；补充视频 1；补充视频2）。为评估电穿孔细胞的存活能力，通过caspase 3的免疫组织化学染色分析细胞凋亡情况。尽管在心脏中检测到少量阳性细胞，但电穿孔细胞主要分布的心肌层和心外膜层均未受到凋亡影响（补充图 1C）。在检测荧光活性时，几乎心脏所有四个腔室均观察到嵌合型GFP信号，表明该方案能够有效转染大部分心脏结构（图4A）。为确定哪些心脏细胞类型被成功电穿孔，对pCAG::GFP电穿孔后的心脏组织进行免疫染色，分别使用心外膜标志物WT12和心肌层标志物MF2023进行标记，并通过共聚焦显微镜成像（图4B）。大多数GFP阳性细胞主要分布于心脏的外层区域，该区域与WT1信号高度重合，表明该方法对心外膜细胞的转染效率最高（图4B，白色箭头）。
另一方面，将pCAG::Meis1电穿孔或对照（仅pCAG::GFP）的心脏进行解离，并对细胞进行荧光激活细胞分选（FACS），以从整个器官中分离出GFP+细胞，具体步骤如方案第4步所述。从分选后的细胞中提取RNA，并进行逆转录定量PCR（RT-qPCR）以检测转染细胞中Meis1的表达水平（图4C，补充表 1）。使用小鼠看家基因Eef224的表达水平对总Meis1基因表达进行标准化，并采用ΔΔCt法25计算相对基因表达量。与仅转染pCAG::GFP质粒的心脏相比，转染pCAG::Meis1质粒的心脏中Meis1的RNA水平显著上调（图4C）。因此，该结果表明该技术具有过表达目的基因并研究其分子效应的潜力。
<img alt="免疫荧光显示心腔发育；图表显示 Meis1 表达分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：电转染 E12.5 胚胎心脏的分子分析。（A）CAG::GFP 电转染心脏在电转染后 24 小时的 GFP 荧光图像。下方图像显示 GFP 荧光，上方图像为同一心脏的 GFP 荧光与明场图像的叠加。（B）E12.5 胚胎心脏组织切片的免疫荧光染色。MF20 标记心肌细胞，WT1 标记心外膜细胞。右侧图像为白色方框区域的放大图。白色箭头指示位于心外膜内的 GFP+ 细胞，该区域大致由白色虚线界定。（C）对电转染了 pCAG::Meis1 或 pCAG::GFP（对照）的心脏进行 RT-qPCR 分析。每个点代表来自三个心脏合并样本的一个生物学重复。总共进行了三次技术重复，包含三个独立的生物学重复。统计分析采用学生 t 检验（*P &lt; 0.05）。比例尺：200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：心脏电穿孔效率与细胞活力。（A）在电穿孔后24小时或48小时（hpe），使用对照质粒pCAG::GFP对两个不同的E12.5期心脏进行电穿孔，GFP表达情况。GFP信号图像叠加于同一心脏的明场图像之上。（B）使用对照质粒pCAG::GFP电穿孔后24 hpe和48 hpe心脏中GFP阳性细胞的定量分析。每个点代表一个独立样本；实线表示均值，误差线表示标准差。两种条件下未观察到显著差异（非参数t检验；P &gt; 0.9）。（C）E12.5期心脏经pCAG::GFP电穿孔后，使用cleaved caspase 3和MF20抗体进行免疫染色的共聚焦图像。虚线表示心脏的心肌层。右侧图像为白色方框区域的放大图。比例尺：100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/Supplementary_fig1.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 1：引物序列汇总。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频1：pCAG::GFP电转后24小时的心脏 该视频记录了一颗在操作后24小时使用pCAG::GFP对照质粒进行电穿孔的心脏。心脏持续跳动，且电转细胞表达GFP信号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/Supplementary%20Movie%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频</a>
补充视频 2：转染 pCAG::GFP 后 48 小时的心脏。 该视频展示了一颗经电转染 pCAG::GFP 对照质粒后 48 小时的心脏。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/Supplementary_Movie_2.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

本方案介绍了一种基于电穿孔技术在发育中鼠心心脏细胞中进行转基因操作的详细方法学框架。所提供的视频资料将有助于学习和掌握这一多功能技术。

哺乳动物心脏是一个复杂的器官，在发育过程中由高度多样化的前体细胞群体形成。这些前体细胞的来源、招募时间……

我们的目标是建立一种新方法，以促进特定基因的过表达或下调，从而理解心脏发育过程。小鼠转基因技术需要投入大量的时间和精力。由于基因组具有高度复杂性，逐一评估基因不仅不现实，而且效率极低。因此，迫切需要一种快速的筛选方法。我们提供了一种可供任何研究人员使用的工具，用于分析候选基因在心脏发育过程中功能的获得或丧失。本方案的主要优势在于，与小鼠转基因技术相比，该方法更快且成本更低。或许可以在开始转基因实验之前，利用该方法评估不同的目的基因。首先，使用拉针仪拉伸一根直径为20微米的玻璃毛细管。将取出的小鼠子宫置于干燥的纸巾上，然后将精细剪刀的尖端插入子宫的系膜侧，沿刀刃方向缓慢地将整个子宫纵向剪开。现在暴露并切除蜕膜组织，将其转移至含有生长培养基的培养皿中，解剖蜕膜以分离胚胎。将胚胎转移至含有温热培养基的60毫米培养皿中。用一对精细镊子小心剪除胚胎的尾部和头部，仅保留躯干部。在不损伤心脏及肺动脉和主动脉的前提下，小心尽可能多地去除躯干部的其他组织。将一根新的拉长针插入移液管的尖端，小心吸取并加载10微升的制备好的质粒混合物至拉长针中。将一个心脏放入含有预热PBS的洁净60毫米培养皿中。将培养皿置于解剖显微镜下。将正负电极之间的距离调整至约四毫米。接着，使用口吸管上的针头轻轻刺破心脏最表层。将一到两微升质粒混合物注入心脏，然后小心取出针头。将电极固定，使心脏位于两个电极之间，然后对心脏进行电穿孔。将电穿孔后的心脏转移至新的12孔板中，每孔加入1毫升生长培养基。将培养板置于37°C、5% CO₂条件下孵育，直至进行分析。首先，获取交配后12至12.5天的野生型CD-1小鼠经电穿孔处理后提取的心脏。将心脏转移至含有1毫升冰冷消化液的离心管中。使用注射器对心脏轻轻施压数次，以切碎组织。将切碎的组织置于37摄氏度的加热板上，以每分钟600转的速度孵育45分钟，然后将消化混合物通过70微米细胞筛过滤至新离心管中。接着，将滤过液体再次通过40微米细胞筛过滤至新的50毫升离心管中。向滤液中加入500微升胎牛血清（FBS）。用冷的DMEM补足体积至30毫升。在室温下以240 ×g离心悬浮液10分钟。弃去上清液，然后将离心管倒置在纸巾上，使其完全干燥。进行细胞分选时，将细胞重悬于300微升分选缓冲液中。最后加入0.3微升DAPI，进行细胞分选。心脏仍在跳动，且外观状态良好。电穿孔后24小时。心肌和心外膜未显示任何凋亡迹象。荧光活性分析显示，心脏几乎全部四个腔室均呈现嵌合型GFP信号。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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