使用 RGD 功能化亲和素-生物素系绳研究血小板迁移的体外测定

血小板对于防止血管损伤后失血、抵抗感染和在炎症期间维持血管完整性至关重要。虽然止血栓需要血小板的集体激活和聚集，但它们在保护发炎血管方面的作用是在单细胞水平上进行的。在这种情况下，最近的研究发现血小板可以自主迁移，这一过程取决于其粘附微环境的机械感应。

这种方法可以精确控制底物粘附特性，并作为一种简单的体外测定来研究血小板迁移的潜在机制。结果表明，与整合素配体结合的迁移血小板可以施加能够破坏亲和素-生物素键的力。该测定提供了一种简单可靠的方法来可视化血小板迁移。

结合活细胞成像，它将帮助我们更好地了解不同细胞骨架成分在这一重要血小板功能中的相互作用和调节。首先，将玻璃盖在 20% 硝酸中超声处理 1 分钟，然后在异丙醇、乙醇和水中超声处理各 1 分钟。在等离子清洁器中用氧气等离子体处理预清洁的盖玻片 2 分钟，然后用粘性载玻片组装它们。

现在用 2.5 微升 PLL-PEG-生物素填充通道，用 97.5 微升 PLL-PEG 稀释，在室温下孵育 30 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。接下来，加入 100 微升中性亲和素-FITC，在室温下避光孵育 30 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。最后，加入 100 μL 环 RGD 生物素，在室温下孵育 30 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。

麻醉小鼠并去除胸腔皮肤后，将针头插入胸骨左侧的第二和第三肋骨之间，从心脏抽血。将血液与 1 毫升 Tyrode 缓冲液混合，在室温下以 70 g 离心 20 分钟，关闭制动器，然后取含有富血小板血浆的上部。与 3 毫升 Tyrode 缓冲液混合，每毫升添加 100 纳克前列环素以防止血小板活化。

然后，在室温下以 1200 g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 500 微升 Tyrode 缓冲液中。然后，使用血细胞计数器测量血小板计数。

首先，在生物素 - 中性亲和素 - 生物素 cRGD 涂层通道中采集小鼠血小板，并使用配备载物台培养箱的倒置显微镜记录活血小板迁移。要计算血小板粘附或迁移的数量，请右键单击工具栏中点工具的下拉菜单，然后选择多点工具。通过测量印在 neutravidin-FITC 涂层中的迁移路径的长度，提取固定样品的迁移距离。

右键单击工具栏中直线工具的下拉菜单，然后选择自由手线工具。要量化血小板的形状，请在工具栏中选择 Image、Adjust 和 Threshold，通过分割荧光血小板来生成二进制掩码。在 Analyze and Set Measurements 中选择形状描述符，然后选择使用 Analyze 和 Analyze Particles 显示结果。

血小板在 2.5% PLL-PEG-生物素浓度下表现出最佳迁移。在较低和较高的配体密度下，迁移均减少。血小板在 1% 配体密度下扩散不充分，表现为面积和周长低，表明整合素激活不足。

在 2.5% 配体密度下，血小板有效扩散，破坏 cRGD 配体并迁移。高配体密度导致血小板在没有极化的情况下扩散，从而减少了由于未能破坏 cRGD 配体而导致的迁移。