Name: 使用实时荧光显微镜定量人结肠类器官中细胞因子诱导的细胞死亡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学习使用实时荧光显微镜定量分析人结肠类器官中细胞因子诱导的细胞死亡。该方法利用荧光染料和活细胞成像技术，可在单类器官水平精确量化细胞死亡，为研究炎症性肠病和黏膜免疫学提供可靠的实验工具。

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作者谨此感谢患者提供知情同意并参与本项研究，同时感谢临床工作人员给予的出色协助。图1A 使用 BioRender.com 制作。&#160;本研究由爱尔兰科学基金会资助，包括授予 K.N. 的职业发展奖（CDA）（SFI-13/CDA/2171）、研究中心资助（SFI-12/RC/2273）以及授予 APC Microbiome Ireland 的研究中心分支项目奖（SFI-14/SP/2710）。P.F. 还获得了 SFI/20/RP/9007 项目的资助。

Quantifying Cell Death in Human Colonoids in Response to Cytotoxic Perturbagens

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<li>Wakisaka, Y., Sugimoto, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+medicine+for+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Organoid medicine for Inflammatory Bowel Disease.</a> Stem Cells. 40 (2), 123-132 (2022).</li>
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<li>Flood, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sensor-associated+type+I+interferon+signaling+is+increased+in+ulcerative+colitis+and+induces+jak-dependent+inflammatory+cell+death+in+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">DNA sensor-associated type I interferon signaling is increased in ulcerative colitis and induces jak-dependent inflammatory cell death in colonic organoids.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G439-G460 (2022).</li>
<li>Grabinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+intestinal+crypt+organoids+as+a+model+system+for+assessing+cell+death+induction+in+intestinal+epithelial+cells+and+enteropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy.</a> Cell Death Dis. 5 (5), e1228(2014).</li>
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<li>Mertens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-repurposing+screen+on+patient-derived+organoids+identifies+therapy-induced+vulnerability+in+KRAS-mutant+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Drug-repurposing screen on patient-derived organoids identifies therapy-induced vulnerability in KRAS-mutant colon cancer.</a> Cell Rep. 42 (4), 112324(2023).</li>
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<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+BCL-G+regulates+secretion+of+inflammatory+chemokines+but+is+dispensable+for+induction+of+apoptosis+by+IFN-%CE%B3+and+TNF-%CE%B1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Human BCL-G regulates secretion of inflammatory chemokines but is dispensable for induction of apoptosis by IFN-γ and TNF-α in intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 11 (1), 68(2020).</li>
<li>Edgar, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-associated+DNA+methylation+changes+impact+on+cellular+function+of+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Culture-associated DNA methylation changes impact on cellular function of human intestinal organoids.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (6), 1295-1310 (2022).</li>
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K.N. 在完成本工作期间获得了艾伯维公司（AbbVie Inc.）的研究资助。该资助属于爱尔兰APC微生物组研究所获得的科学基金会爱尔兰中心分支奖项（SFI-14/SP/2710）的一部分。

目前已开发出多种用于定量分析肠道类器官中细胞死亡的方法。通过光学显微镜观察肠道类器官形态结构的破坏，是一种量化细胞毒性物质效应的直接方法11。然而，形态学变化并非细胞死亡的直接测量指标，该方法仅为半定量。另一种方法是利用MTT或ATP检测来评估类器官的代谢活性10,11。需要注意的是，这些检测仅能确定细胞活力的变化，必须通过细胞死亡检测进行验证。已有研究报道使用DNA结合染料的其他荧光细胞死亡检测方法12,13。可采用非成像方式，利用荧光酶标仪进行检测，实现高通量分析12。然而，该方法测量的是整个孔的平均信号，因此不适用于异质性细胞群体。此外，该方法需要使用具备Z轴高度调节功能的酶标仪。基于荧光成像的技术可用于单个类器官分析，并可获取细胞/亚细胞及形态学数据。自动化共聚焦高内涵成像（HCI）系统能够以高通量生成大量数据13。但遗憾的是，共聚焦高内涵成像需要专用设备，操作流程复杂，通常需依赖商业化的图像分析软件，且成本较高。
我们用于在多个时间点对类结肠体细胞死亡进行定量分析的方案简单、直接且成本低廉。然而，与自动化的高内涵成像（HCI）和酶标仪系统相比，该方法耗时较长，通量较低。本方法的另一个局限性在于使用了宽场显微镜而非共聚焦显微镜。共聚焦显微镜更适合成像类器官等较厚的三维样本，因为它可减少非焦平面信号，并能获取连续的光学切片（Z-stack）。然而，共聚焦成像通常需要更长的采集时间以及高强度激光，这会增加光毒性/光漂白效应。需要特别注意的是，SYTOX Green等荧光细胞死亡染料仅适用于检测伴随细胞膜完整性丧失的细胞死亡形式，例如坏死、晚期凋亡相关的继发性坏死、坏死性凋亡和细胞焦亡21。某些调控性细胞死亡在早期阶段细胞膜仍保持不透性，例如半胱天冬酶（caspase）依赖性凋亡。但本方案可轻松改进，以同时纳入caspase 3/7活性的荧光报告系统成像22，从而提供额外数据，有助于进一步明确具体的细胞死亡方式。
我们利用本方案展示了细胞因子 IFN-γ 与 TNF-α 之间的细胞毒性协同作用（图 2C），此前我们已在克罗恩病（CD）患者来源的类器官中报道过这一现象9,10。这种协同作用的生理相关性也已在噬血细胞性淋巴组织细胞增生症和脓毒症的小鼠模型中得到证实23。目前已有多种数学参考模型和方法被用于量化生物制剂组合之间的协同效应24,25。这些模型在复杂性、所考虑因素的数量以及判定协同作用的阈值方面各不相同24,25。部分模型需要预先了解所测试生物制剂的特性，对制剂活性作出特定假设，并且可能需要针对每种单一处理及组合处理获取完整的剂量-反应曲线25。我们选用的协同效应检测方法是对药物相互作用系数（CDI）模型的一种改进，该模型此前已被用于评估化疗药物组合对癌细胞系增殖的抑制作用26。CDI 属于 Bliss 独立性模型；在计算两种扰动因子联合作用的预测效应时，Bliss 独立性假设它们作用于不同的通路且具有独立的作用机制27。当扰动因子之间的实际联合作用强于预测作用时，即可判定为协同作用。该模型适用于我们的实验设计，因为已知 IFN-γ 和 TNF-α 具有不同的受体及下游信号组分。此外，Bliss 独立性模型可通过计算相互作用系数来量化协同程度，且无需依赖剂量-反应数据集。
为确保本实验方案获得最佳结果，必须考虑几个关键因素。结肠类器官应培养至较高密度（图1Bi），直径约为25–50 µm，并在接种细胞前处于活跃增殖状态。若使用状态欠佳的类器官进行实验，可能导致细胞数量不足、类器官回收率低以及实验结果不一致。为获得可重复的结果，还需在不同实验间保持一致的类器官接种密度。已有研究表明，细胞接种密度可能影响类器官对炎症性细胞因子的体外反应28,29。另一个常见问题是基质胶（BME）滴中的气泡形成，这会影响成像效果。可通过使用反向移液技术避免此问题，该技术也有助于实现更一致的接种效果。
此外，如果需要对多个时间点进行成像，应为每个时间点分别准备一个最大毒性（Max Toxicity）条件。Triton-X 100 是一种非离子型表面活性剂，通常用作细胞毒性检测中的阳性对照（即最大毒性条件）。加入 Triton-X 100 可导致类器官裂解并死亡，从而使荧光细胞死亡染料进入细胞内。若使用较早时间点的最大毒性条件，会因荧光信号随时间衰减而导致数据归一化结果不准确且不一致。
最后需要考虑的是用于结肠类器官培养的基底膜提取物（BME）的选择。目前有多个厂商生产BME；然而，在本实验方案中，我们仅测试了材料表中列出的品牌。最近一项使用患者来源的胰腺癌类器官的研究发现，不同商业来源的BME会影响细胞增殖速率，但对化疗药物反应或基因表达无显著影响30。基于此，我们预计在本方案中不同BME品牌所得结果的趋势相似，但仍建议持续使用同一品牌。
我们展示了如何利用克罗恩病（CD）患者来源的结肠类器官，通过该方案分析干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的细胞死亡。患者来源的肠道类器官是研究克罗恩病的有力工具，因其保留了该疾病的多种特征，包括对TNF-α细胞毒性作用的敏感性增加31。然而，该方案也可轻松修改，用于研究除细胞因子以外的其他干扰因素的细胞毒性作用，或除炎症性肠病（IBD）以外的其他疾病状态，例如结直肠癌（我们已成功在非IBD来源的结肠类器官中测试了该方案）。我们认为，该方法适用于任何关注细胞死亡机制、上皮屏障功能或肠道黏膜免疫学的研究领域。

肠上皮在肠腔内容物与下方组织之间形成一道物理性的半透屏障。为了有效维持这一屏障，肠上皮细胞（IECs）具有极高的细胞更新率，持续进行着细胞死亡与再生的循环过程。然而，在炎症性疾病（如炎症性肠病（IBD））期间，异常的细胞死亡水平升高1。这可能导致屏障功能受损，并激活免疫系统，进而引发进一步的炎症反应。在克罗恩病（CD）（一种IBD）中，已有研究表明，细胞因子信号传导可导致IEC死亡水平升高2。通过研究细胞因子信号如何诱导IEC死亡，有望为IBD及其他肠道炎症性疾病患者开发出更有效的治疗方法1。
在生物学和药物靶点发现研究中，协同作用通常指生物系统在接受单独刺激物的组合处理后，其对组合刺激的反应强于各单独刺激物效应的简单加和。细胞因子之间的协同作用在驱动先天抗病毒反应方面已有充分报道3。已知细胞因子还可协同诱导细胞死亡，包括在肠上皮细胞（IECs）中的作用4。然而，协同性细胞毒性细胞因子信号在炎症性肠病（IBD）等肠道炎症性疾病中的作用尚未得到充分研究。
人类肠道类器官是由三维微组织构成的 体外 由肠上皮干细胞生成的类器官。炎症性肠病（IBD）患者的肠道黏膜活检样本可培养出肠类器官，且这些类器官保留了该疾病的多种特征5,6类器官已被证明是研究肠道炎症背景下细胞因子细胞毒性的理想模型系统7,8此前，我们的研究团队已表征了炎症性肠病相关细胞因子IFN-γ和TNF-α在克罗恩病患者来源的结肠类器官（colonoids）中协同杀伤作用9,10然而，介导这种协同性细胞死亡的确切机制仍不明确。此外，可能还存在许多尚未被表征的、与肠道炎症性疾病相关的细胞毒性细胞因子相互作用。
目前已有多种方案可用于研究肠道类器官中的细胞死亡10,11,12,13；然而，这些方法均存在一定的局限性。其中一些技术仅能检测细胞活力，而无法直接测量细胞死亡，或无法评估单个类器官的反应，或需要昂贵的设备和复杂的操作流程。因此，迫切需要建立可靠且简便的方法，以定量分析肠道类器官中的细胞死亡及其与扰动因子的相互作用。本文所介绍的方案是一种简单且经济的方法，可用于检测单个类器官对细胞毒性细胞因子的反应，但也可适用于任何其他类型的刺激物或扰动因子。我们还展示了如何利用 Bliss 独立性协同作用模型计算扰动因子相互作用系数（CPI），以描述细胞毒性细胞因子之间的相互作用。

<table><tbody><tr><td>高级DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B溶液</td><td>Sigma-Merck</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Sigma-默克</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>BioRender</td><td>Science Suite 公司</td><td>N/A</td><td>科学绘图软件</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-默克</td><td>A2058</td><td>基本不含IgG，低内毒素</td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Sigma-默克</td><td>SML1046</td><td></td></tr><tr><td>Corning 48孔透明TC处理细胞培养板，单个包装，无菌</td><td>康宁</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 基底膜提取物，2 型，Pathclear</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3532-010-02</td><td>基底膜提取物</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-默克</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;prime;磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL 数字倒置荧光显微镜</td><td>Invitrogen</td><td>AMF4300</td><td>数字倒置落射荧光显微镜</td></tr><tr><td>EVOS 40倍物镜，萤石，长工作距离，相差</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AMEP4683</td><td>长工作距离40倍荧光物镜</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ（Windows 版本）</td><td>开源软件</td><td>N/A</td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-默克</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素溶液</td><td>Sigma-默克</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>温和细胞解离试剂</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td>无酶细胞解离试剂</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-丙氨酰-L-谷氨酰二肽补充剂</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5（Windows 版本）</td><td>Dotmatics</td><td>N/A</td><td>数据图表与统计软件</td></tr><tr><td>Greiner 15 mL 聚丙烯离心管，无菌，锥底 &amp;和螺帽盖</td><td>Cruinn</td><td>188261CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>人重组表皮生长因子（无动物源成分）</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma-默克</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma-Merck</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>诺尔霉素</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-05</td><td>广谱抗菌试剂</td></tr><tr><td>Nunc Edge 96孔，Nunclon Delta处理，平底微孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15543115</td><td></td></tr><tr><td>N2 补充剂</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>重组人IFN-γ蛋白</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF</td><td>用无菌过滤的 0.1% PBS/BSA 重悬</td></tr><tr><td>重组人TNF-α蛋白</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>210-TA</td><td>用无菌滤过的 0.1% PBS/BSA 重悬</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-默克</td><td>S7067</td><td></td></tr><tr><td>低吸附带盖微量离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3451</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green 核酸染料 - DMSO 中 5 mM 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>荧光细胞死亡染料，避光保存</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-默克</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-默克</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>酶解离试剂</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10071</td><td>ROCK-I 和 ROCK-II 抑制剂</td></tr></tbody></table>

利用活细胞荧光显微镜定量人结肠类器官中细胞因子诱导的细胞死亡

Quantification of Cytokine-Induced Cell Death in Human Colonic Organoids Using Live Fluorescence Microscopy

炎症性肠病（IBD）患者，如溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）患者，其肠上皮细胞（IEC）死亡增加。这可能导致肠道屏障功能缺陷、炎症加重以及疾病免疫病理发生。细胞因子和死亡受体配体部分介导了IEC死亡的增加。与IBD相关的细胞因子，如TNF-α和IFN-γ，无论是单独作用还是联合使用，均对IEC具有细胞毒性。本实验方案描述了一种简单且实用的检测方法，利用荧光细胞死亡染料（SYTOX Green核酸染料）、活细胞荧光显微镜和开源图像分析软件，定量检测来自CD患者结肠类器官中细胞因子诱导的细胞毒性。我们还展示了如何使用Bliss独立性数学模型，基于类器官细胞毒性计算扰动因子相互作用系数（CPI）。该CPI可用于判断细胞因子组合或其他类型扰动因子之间的相互作用是拮抗性、相加性还是协同性。本方案可用于利用患者来源的结肠类器官研究细胞因子及其他扰动因子的细胞毒性活性。

通过本方案，我们展示了如何利用克罗恩病（CD）患者的结肠类器官研究与炎症性肠病（IBD）相关的细胞因子IFN-γ和TNF-α对原代上皮细胞的细胞毒性作用。我们使用了一种 commercially available 的荧光细胞死亡染料（SYTOX Green Nucleic Acid Stain），该染料仅能进入细胞膜受损的细胞，并通过与核酸结合而被激活。我们将结肠类器官与细胞因子及荧光细胞死亡染料共同孵育，并在8小时和24小时时使用倒置落射荧光显微镜进行活细胞成像。8小时时的代表性明场/荧光叠加图像显示，仅IFN-γ + TNF-α处理的结肠类器官呈现荧光信号阳性；然而，荧光标记的细胞数量较少（图2A）。在IFN-γ + TNF-α处理条件下，还可观察到细胞出泡现象，这是细胞死亡的一种形态学标志20。在24小时时，经IFN-γ + TNF-α处理的结肠类器官显示出大范围的荧光信号阳性区域（图2A）。此外，类器官的形态结构明显崩解，中央腔不再可见，上皮屏障已完全被破坏。
为了定量细胞死亡染料信号，我们使用开源图像分析软件计算每个结肠类器官的荧光强度。随后，通过将每种条件的平均值表示为最大毒性处理（Max Toxicity）的百分比来对数据进行归一化。在8小时时，BSA对照组类器官中的稳态或背景细胞死亡水平相对较低（占最大毒性的7.7%）（图2B）。在此时间点，各组之间的细胞死亡水平无统计学显著差异；然而，经TNF-α处理的组显示出细胞毒性轻微升高（图2B）。在24小时后，所有经细胞因子处理组的细胞死亡水平均有所上升。然而，BSA对照组在不同时间点之间的细胞死亡变化极小（24小时时为最大毒性的7.5%）。经IFN-γ + TNF-α联合处理的类器官相较于BSA对照组表现出最大的细胞死亡水平升高（占最大毒性的29.4%）。联合处理组与单细胞因子处理组（IFN-γ、TNF-α）之间的细胞死亡水平差异极为显著。这些结果提示IFN-γ与TNF-α在24小时时可能存在细胞毒性的协同作用。
我们使用CPI来量化细胞因子处理之间的细胞毒性相互作用，并确定它们是否具有协同作用。当CPI值<1时，细胞因子之间的相互作用被视为协同作用；等于1时为相加作用；>1时为拮抗作用。我们计算了每个时间点的CPI值（图2C）。在8小时时，CPI值表明存在轻微的协同作用（0.99），而在24小时时CPI值显著降低（0.83）。该分析证实，IFN-γ与TNF-α在24小时时的相互作用具有协同性。此外，这也说明在此背景下，IFN-γ与TNF-α之间的协同作用具有时间依赖性。
<img alt="结肠类器官培养示意图、细胞因子处理、活细胞成像过程、显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：实验流程及故障排除示意图。（A）实验方案的示意图概览。（B）代表性图像。（Bi）明场显微镜图像，显示检测前传代时类器官培养的最佳密度和理想大小。比例尺 = 500 µm。（Bii）明场显微镜图像，显示解离后结肠类器官片段的理想大小；红色高亮部分为片段。比例尺 = 100 µm。（Biii）经MT处理（使用Triton X-100）后出现坏死形态的结肠类器官明场图像。比例尺 = 25 µm。（Biv）两个结肠类器官在同一焦平面重叠的明场图像。比例尺 = 25 µm。（Bv）传代后存在的结肠类器官细胞碎片明场图像；红色高亮部分为碎片。比例尺 = 25 µm。缩写：ROI = 感兴趣区域；MFI = 平均荧光强度；MT = 最大毒性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示显微镜图像和柱状图的细胞毒性分析；BSA、TNF-α存在下IFN-γ作用8小时/24小时。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：细胞因子诱导的人源克罗恩病结肠类器官细胞死亡的定量分析。（A）在8小时和24小时使用SYTOX Green核酸染料（荧光细胞死亡染料）和细胞因子处理后的克罗恩病结肠类器官代表性活细胞显微图像；透射光与GFP（绿色）通道叠加。处理方式如下：1）PBS/BSA，2）10 ng/mL IFN-γ，3）10 ng/mL TNF-α，4）10 ng/mL IFN-γ + 10 ng/mL TNF-α。比例尺 = 25 µm。（B）在8小时和24小时使用荧光细胞死亡染料和细胞因子处理的克罗恩病结肠类器官的定量分析；数据以MT条件的百分比表示。N = 2个克罗恩病结肠类器官系，每种条件下成像11–16个类器官。（C）基于B中数据集计算每个时间点的CPI，N = 2个克罗恩病结肠类器官系。数据以均值 ± 标准误表示。在B中，采用双因素方差分析，随后进行Bonferroni多重比较检验，*P &lt; 0.05，***P &lt; 0.001，如图所示。缩写：CD = 克罗恩病（Crohn's disease）；GFP = 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）；CPI = 干扰因子相互作用系数（coefficient of perturbagen interaction）；PBS = 磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline）；BSA = 牛血清白蛋白（bovine serum albumin）；TNF-α = 肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alfa）；IFN-γ = γ-干扰素（interferon-gamma）；MT = 最大毒性（Max Toxicity）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：实验方案中培养基的组成。 制备类器官增殖培养基时，将L-WRN条件培养基与无血清培养基按1:1比例混合，然后加入补充成分。类器官增殖培养基应在配制后2周内使用。请注意，所有完全培养基均应于4 °C保存。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：实验用96孔板布局及细胞因子处理方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%202%20(1).xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本方案描述了一种简单且经济高效的方法，用于研究和量化人结肠类器官在细胞毒性干扰物（如细胞因子）作用下的细胞死亡。该方法采用荧光细胞死亡染料（SYTOX Green 核酸染色剂）、活细胞荧光显微镜和开源图像分析软件，以量化单个类器官对细胞毒性刺激的反应。

炎症性肠病（IBD）患者，如溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病患者的肠道上皮细胞（IEC）死亡增加……

炎性细胞因子干扰素γ和TNFα已存在数亿年，对于有效抵御胞内病原体的宿主防御至关重要。我们的研究团队正致力于阐明这些细胞因子如何发挥作用以杀伤细胞，例如肠道上皮细胞和癌细胞。目前研究肠道上皮细胞死亡机制的常用体系包括小鼠模型和永生化癌细胞系。人源睾丸类器官具有优势，因为它们直接由患者活检组织生成，并保留了组织中睾丸的许多生理和形态学特征，这意味着其转化应用价值更高。然而，类器官研究在实验可重复性方面存在一些问题，与传统细胞培养相比，还面临多项技术挑战。目前用于检测类器官细胞死亡的技术也存在局限性。其中一些方法仅能进行半定量分析，无法直接测量细胞死亡，不能检测单个类器官的反应，或需要昂贵的设备和复杂的操作流程。我们提出的类器官细胞死亡定量分析方案操作简便、结果可靠且成本低廉。我们利用本方案检测了单个类器官对细胞毒性细胞因子组合的反应，但该方案可轻松调整用于研究任何类型的扰动因子。该方法适用于细胞死亡、上皮屏障功能或黏膜免疫学相关研究。近期我们报道了干扰素γ与TNFα协同作用可诱导肠道上皮细胞和结肠癌细胞发生炎性细胞死亡。他们通过JAK1、JAK2和STAT1信号通路实现这一过程。在后续研究中，我们希望明确这种细胞死亡的具体类型，以及JAK1和JAK2如何介导细胞死亡。在48孔板中扩增克罗恩病患者来源的结肠类器官后，从孔的边缘轻轻移除培养基，避免损伤结肠类器官的穹顶结构。向每个孔中加入300微升酶解解离试剂，其中添加10微摩尔ROCK1和两种抑制剂Y-27632。使用P1000移液枪头刮擦孔表面，以破坏类器官的圆顶结构，并将细胞悬液上下吹打混匀。将细胞悬液转移至15毫升离心管中。将收集的结肠类器官在37摄氏度水浴中孵育5分钟。以400 ×g离心3分钟，然后弃去上清液，保留约1.2毫升于离心管中。接下来，将 P1000 移液器的枪头插入悬液中，枪头尖端置于管底上方，快速反复吹打悬液，以解离类器官。在显微镜下观察管内样品，确保无完整类器官残留，且类器官碎片大小约为 30 至 40 微米。随后，向 15 毫升离心管中加入 10 毫升预冷的类器官洗涤培养基。将离心管在400 G条件下离心三分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升冰上预冷的类器官洗涤培养基中。将悬液转移至1.5毫升微量离心管中，并标记为结肠类器官片段管。混匀后，取50微升样品转移至新管中，并标记为细胞计数管。以400 × g离心3分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于500微升含有10微摩尔Y-27632的酶解解离试剂中。将单细胞计数管置于37摄氏度水浴中孵育5分钟。使用设置为400微升的P1000移液器快速吹打混匀样品。然后在显微镜下观察样品，以确保形成单细胞悬液。向单细胞计数管中加入1毫升类器官洗涤培养基。然后离心悬浮液，弃去上清液，再用50微升类器官洗涤培养基重悬沉淀。加入50微升台盼蓝染液，使用血细胞计数板进行细胞计数。根据此结果，计算类结肠体片段管中的细胞浓度。在新的 1.5 毫升微量离心管中离心所需体积，然后弃去上清液。将沉淀重悬于基底膜提取物（BME）中。现在，在预温育的96孔微孔板中，每孔反向吹打10 µL结肠类器官BME溶液，并定期小心混匀溶液，以防止接种不均。将培养板倒置，在37°C和5% CO₂条件下孵育。20分钟后，向类器官上覆盖200微升预热的类器官增殖培养基，继续培养三天。将克罗恩病患者来源的结肠类器官培养三天后，倾斜培养板，从孔的边缘移除培养基。每孔加入含2.5微摩尔荧光细胞死亡染料的细胞因子处理培养基200微升。将类结肠器官在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育所需的处理时间。孵育结束后，将培养板转移至数字倒置落射荧光显微镜的载物台上，确认最大毒性条件下的类结肠器官已完全裂解。使用透射光通道，聚焦于含有SYTOX阳性细胞的类结肠器官。然后切换到 GFP 通道。调整光照强度和曝光时间，以在最小化背景信号的同时最大化荧光信号。使用优化后的成像参数，观察无染料和最大毒性条件下的样本，确保样本未出现曝光过度或曝光不足的情况。采用随机抽样方法，选择覆盖类器官穹顶的固定网格模式视野，获取类器官的透射光和GFP图像。将图像以便携式网络图形格式保存并导出。将图像数据集文件拖放到ImageJ工具栏上，然后依次点击图像、堆栈和图像到堆栈，以合并文件。然后依次点击图像（Image），选择类型（Type）并转换为8位（8-bit），将图像堆栈转换为8位文件。点击自由手绘选择工具（freehand selections tool），在透射光图像上手动选择感兴趣区域。随后在图像堆栈中切换至对应的GFP通道图像。从工具栏中点击“Analyze”（分析）并选择“Set Measurements”（设置测量）。在“Set Measurements”对话框中，勾选“mean gray value”（平均灰度值），其余选项保持未勾选状态。选中GFP图像后，点击“Analyze”（分析）并选择“Measure”（测量）。数据分析完成后，将结果窗口中的所有数据复制并粘贴到电子表格中。计算每种条件下技术重复的平均灰度值的均值。用各处理条件的均值减去未处理条件的均值。然后将每个处理组的数值除以最大毒性组扣除背景后的平均值。为计算处理后的细胞活力，用1减去归一化后的数值。根据给定的公式，计算扰动剂相互作用系数。八小时时的结肠类器官透射荧光叠加图像显示，仅干扰素γ联合TNFα处理的结肠类器官呈现荧光信号阳性。24小时时，经干扰素γ联合TNFα处理的结肠类器官显示出大范围荧光信号阳性区域，并伴有明显的类器官形态破坏。在八小时时间点，BSA对照组结肠类器官的细胞死亡水平较低，而TNFα处理组则略有升高。在24小时时，经干扰素γ联合TNFα处理的结肠类器官显示出最高的细胞死亡水平。CPI值表明，在8小时时具有轻微协同作用，而在24小时时具有显著协同作用。这证实了干扰素γ与TNFα之间存在时间依赖性的协同相互作用。

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