Name: 通过更新的多重 LN34 实时逆转录聚合酶链反应测定法对动物狂犬病进行尸检诊断 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 了解使用LN34多重实时RT-PCR检测动物狂犬病的完整流程。该方案涵盖从脑组织采集、RNA提取到结果判读的标准化步骤，可显著提升诊断准确性并支持狂犬病防控工作。

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我们感谢众多狂犬病诊断检测实验室所付出的努力和开展的合作，他们通过公开共享数据和提供反馈，推动了LN34检测方法的实施、验证和优化。所使用的商品名称和商业来源仅用于识别目的，不意味着美国疾病控制与预防中心、美国卫生与公共服务部或作者所属机构对此表示认可。作者所表达的结论、研究结果和观点不一定代表美国卫生与公共服务部、美国疾病控制与预防中心或作者所属机构的官方立场。

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</ol>

无任何披露内容

一次成功的LN34检测运行必须包含阳性对照、提取对照和无模板对照，且这些对照在每次检测运行中均需表现正常，否则该次运行必须作废并重新进行。所有三个LN34阳性对照重复反应均应在规定的范围内跨越阈值，否则应重复实验。先前文献中描述的阳性对照RNA7,8在βA检测中不会发生扩增。无模板对照反应在LN34或βA检测中均不应出现跨越阈值线的扩增曲线。提取对照在LN34检测中不应出现扩增。若在无模板对照或提取对照中观察到意外扩增，可能提示存在污染，需作废本次运行并对所有样本重新进行检测（见表5）。用户可考虑增加其他对照，例如无处理对照或无样本提取对照，以监测提取试剂是否受到宿主βA的污染。
由于狂犬病的致死率接近100%，因此建议对任何微弱或异常的扩增信号进行进一步调查，即使未产生Ct值。阴性样本或NTC（无模板对照）反应不应出现任何扩增，荧光曲线在多组分视图中应表现为一条与ROX荧光平行的平直线。若观察到扩增曲线，尤其是在多个重复样本中出现，可能提示存在交叉污染或弱阳性结果。对于阳性样本，所有重复样本均应出现扩增，方可判定为有效的阳性结果。如果在任一检测中仅有部分重复样本出现扩增，则应对该样本重新检测。此外，任何产生高度变异结果的样本（重复样本间的Ct值差异&#62; ±1.5）均应视为无效，并需重新检测。若问题持续存在，应对样本重新进行核酸提取。
从正确采集并妥善保存的脑干和小脑组织中提取的狂犬病阳性样本，在LN34检测中预期Ct值应低于35个循环。所有不确定结果的样本必须使用LN34实时RT-PCR重新检测。如果重复检测后样本仍为不确定结果，且所有对照均表现正常，则建议重新提取RNA。病毒RNA含量较低的样本（LN34 Ct &#62; 35）可能提示存在某些问题，例如污染、病毒载量低、PCR抑制或提取失败。应从原始组织中采集新鲜的脑组织样本，重新进行RNA提取，并再次检测。同样，βA检测中Ct值 &#62; 33（单重反应）、37（LN34M）或无扩增，可能表明RNA提取失败。对此类样本应重复提取RNA，然后对LN34和肌动蛋白（actin）均重新检测。如果样本在多次重复检测后仍产生不确定结果，应采用第二种方法进行检测，例如直接荧光抗体检测（DFA，也称FAT）、DRIT或病毒分离。若持续出现结果不一致或不确定结果，请咨询狂犬病参考实验室以进行确证检测。
如果RNA提取物中存在抑制剂，PCR检测可能会产生假阴性结果。若怀疑存在抑制作用，或某个样本的βA对照反应出现抑制现象（例如Ct值&#62;33或Ct值&#62;37），应对提取的RNA进行两种或更多稀释度（例如，用无核酸酶水稀释1:10和1:100）检测，以稀释可能存在的PCR抑制物。对于难以处理的样本，可通过不添加水的方式将RT-PCR反应中的RNA加样量增加至8.5 µL。这可能揭示出更强的抑制作用（与2 µL RNA加样量相比，Ct值延迟）或原始样本中RNA含量较低（使用8.5 µL RNA加样量时Ct值早于2 µL加样量的情况）。
LN34 检测无法区分丽沙病毒或确定狂犬病病毒变异株。LN34 检测扩增子可用于低分辨率的狂犬病病毒变异株分型或丽沙病毒种类的鉴定11。

本方案描述了从样本采集到结果解读，使用LN34泛型狂犬病毒实时反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法进行狂犬病诊断检测的完整流程。该流程分为三个部分：与LN34检测相关的脑组织样本采集（第1部分）、使用Direct-zol RNA Miniprep试剂盒（Zymo Research R2051）进行的手动柱式RNA提取（第2部分），以及使用AgPath-ID One-Step RT-PCR试剂盒（ThermoFisher Scientific AM1005）建立LN34实时RT-PCR检测体系（第3部分）。RNA提取和RT-PCR步骤可使用其他产品完成，但所用试剂盒在使用前必须经过验证，以确保狂犬病毒RNA能够被有效提取并正确扩增。
第1节描述了用于LN34实时RT-PCR检测的合适脑组织的采集。不包括动物尸检、断头及脑组织取出的操作说明。样本可能含有传染性病原体。应遵循《微生物和生物医学实验室生物安全手册》第6版1中详述的生物安全程序，以降低风险。在完成灭活之前，应将样本视为具有传染性。病毒灭活及检测方法验证应在各实验室根据本机构的标准进行。实验室在实施新的诊断检测时，应遵循本机构规定的标准安全与质量操作规程。
根据已知的狂犬病病毒感染传播机制，脑干和小脑是进行狂犬病诊断的最佳组织，世界卫生组织和世界动物卫生组织均推荐将这些组织用于狂犬病检测2,3,4,5。由于病毒扩散可能是单侧性的（图1），尤其是在较大的动物中，因此应检查脑干的完整横切面以及小脑的三个叶，以排除狂犬病。对于未达到上述最低标准的样本，实验室可能因样本不足而拒收，或选择出于监测或确诊目的进行检测。如果未收到所需组织，但实验室仍决定检测该样本，则阴性结果应被视为对该动物无法得出明确结论，因为其他组织中病毒RNA的存在可能延迟出现、丰度较低、间歇性存在或根本不存在。在此情况下，需要采集符合要求的样本或进行额外检测，才能排除狂犬病。然而，在任何组织中检测到丽沙病毒RNA均为狂犬病感染的确诊依据3,6。可用于狂犬病病毒RNA检测以支持确诊或监测（但不能用于排除诊断）的样本示例包括大脑皮层、海马体、脊髓、降解样本、皮肤、唾液和角膜。每个样本送达实验室后，应对其状态进行定性评估。冷藏可使样本保持至少72小时，但不应长期使用。反复冻融可能降低检测灵敏度，应避免超过五次冻融循环。如果组织状况导致无法准确识别脑部结构，则应判定该样本为不合格。对于不合格标本，仍可进行检测以支持确诊（但不能用于排除诊断）。阳性结果应如实报告；而不合格组织上的阴性或不确定结果应报告为“不确定”，以防止被误读为阴性诊断。
本方案基于已发表的实验流程7,8,9 改进而来，包含针对狂犬病病毒属基因组 leader 区域和核蛋白编码序列的更新引物。探针靶向一段短而高度保守的序列，并采用锁核酸（locked nucleotides）以实现广谱检测。该检测方法可在不同浓度下检测多种狂犬病病毒属的 RNA8。本方案展示了进行 LN34 实时 PCR 检测的实验室操作步骤，但对狂犬病病毒属 RNA 的准确且灵敏的检测还依赖于其他未在本方案中详述的要素，例如样本储存、记录管理、人员培训与能力评估、结果追踪、结果解读、质量保证、实验室安全措施以及问题排查。由于 PCR 检测具有高灵敏度，易发生交叉污染。通过遵循良好的实验室规范可避免交叉污染，例如频繁更换手套、一次只处理一个样本、在样本之间使用有效的去污剂对工作台面进行消毒，以及保持管盖封闭并将样本与 PCR 试剂分开。通过采用单向工作流程并分离扩增前与扩增后操作区域，可有效分离 PCR 试剂与样本。例如，应在与样本处理区域物理分离的位置配制 PCR 主混合液。应频繁更换手套，以避免样本、碎屑或阳性对照 RNA 污染 PCR 试剂。在加入主混合液后，应将 PCR 板或管转移至另一个独立区域，用于添加样本和对照 RNA。重要的是，不得在样本或主混合液制备区域操作 PCR 产物。
进行诊断检测时，动手实践和经验积累无可替代。所有新员工均应接受培训，检测人员应至少每年接受一次能力评估，评估需遵循相关实验室主任的要求。任何关于异常结果或检测失败的观察均应立即记录、调查并纠正。每一批新到的试剂都应使用已知Ct值的样本（如阳性对照或存档样本）进行验证。所有设备均应按照制造商建议进行常规维护，并在任何维护或维修后验证检测性能。应监测相关设备的温度，确保冰箱和冷冻柜的温度保持在诊断检测所用试剂可接受的温度范围之内。
操作步骤的修改可能影响检测性能，并可能导致假阳性、假阴性或无法解读的结果。应严格遵循本建议，以确保检测具有高灵敏度和特异性。实验室若希望对本方案进行修改，应在修改前与美国疾病控制与预防中心（CDC）协商，并对修改后的方法进行验证和确认。

<table><tbody><tr><td>7500 Fast</td><td>Applied Biosystems</td><td>N/A</td><td>未经验证不得替换</td></tr><tr><td>7500 Fast Dx&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>N/A</td><td>未经验证不得替换</td></tr><tr><td>ABI ViiA 7</td><td>Applied Biosystems</td><td>N/A</td><td>未经验证不得替换</td></tr><tr><td>AgPath-ID 一步法 RT-PCR 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AM1005</td><td>未经验证不得替换</td></tr><tr><td>Beadbug6</td><td>Benchmark Scientific</td><td>D1036</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>R2052</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyser 绿色珠子&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>3358941001</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5425 R</td><td></td></tr><tr><td>光学 96 孔反应板</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>光学粘合盖膜</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>4311971</td><td>替代品：封口帽</td></tr><tr><td>聚酯纤维头采样拭子&amp;nbsp;</td><td>BD BBL 聚酯纤维头采样拭子</td><td>220690</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6Flex</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485691</td><td>未经验证不得替换</td></tr><tr><td>季铵盐类消毒剂（1:256）</td><td>LYSOL</td><td>WBB56939</td><td>未经验证不得替换</td></tr><tr><td>RNase AWAY</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>7002PK</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀，带安全装置的手术刀&amp;nbsp;</td><td>Integra Miltex&amp;nbsp;</td><td>4-510</td><td></td></tr><tr><td>无菌聚丙烯微量离心管（1.5 mL），无核酸酶</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.405</td><td></td></tr><tr><td>无菌聚丙烯微量离心管（2 mL），无核酸酶</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.600</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15596026</td><td>未经验证不得替换</td></tr></tbody></table>

利用更新的多重ln34实时反转录-聚合酶链式反应检测法对动物进行狂犬病死后诊断

Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by the Updated, Multiplexed LN34 Real-Time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay

狂犬病是一种由狂犬病病毒属（Lyssavirus）的狂犬病病毒（RABV）及其他相关的负链RNA病毒（弹状病毒科 Rhabdoviridae）引起的致命性人畜共患病。LN34检测针对狂犬病病毒基因组中高度保守的 leader 区域和核蛋白基因，采用简并引物和含有锁核酸的TaqMan探针，以实现对整个Lyssavirus属病毒RNA的广谱检测。只有在对脑干的完整横切面以及小脑的三个叶进行检查后，方可做出狂犬病阴性判断；然而，任何组织中检测到狂犬病病毒属RNA即可确诊为狂犬病感染。组织样本采集后在TRIzol试剂中进行匀浆处理，该试剂同时可灭活病毒。RNA提取采用基于离心柱的商用提取试剂盒完成。在洁净环境中配制预混液，并分装至96孔板中，随后加入样本RNA。在临床检测中，每个样本需通过实时逆转录PCR（real-time RT-PCR）进行三重平行检测以确定是否存在狂犬病病毒属RNA，同时单次检测宿主β-actin mRNA。在提取和实时RT-PCR步骤中均需包含阳性和阴性对照。数据分析需手动调整阈值，以标准化不同仪器运行间的Ct值。阳性结果的判定标准为广谱狂犬病病毒属检测中出现典型的扩增曲线（Ct ≤ 35）；阴性结果的判定标准为广谱狂犬病病毒属检测中无典型扩增（Ct > 35），且宿主β-actin mRNA被成功检出（Ct ≤ 33）。若Ct值超出上述范围，或检测对照出现异常，则该次实验运行无效，或导致样本结果无法判读。必须严格遵循本实验方案，以确保检测具有高灵敏度和特异性。任何操作步骤的修改均可能影响检测性能，导致假阳性、假阴性或无法解释的结果。

在 ABI ViiA7 实时荧光定量 PCR 仪上成功运行 LN34 检测的代表性图像如图 2所示。以对数刻度显示结果可便于观察 Ct 值，即扩增曲线与阈值线相交的点（图 2A、C）。当以线性刻度显示时，成功扩增的结果呈现为S型（或“S”形）曲线（图 2B、D），而阴性结果则表现为一条直线且无上升趋势。建议同时在对数和线性刻度下查看结果，以识别可能的异常或错误。在多组分荧光图中，典型的阳性与阴性结果分别如图 2E、F所示，其中可观察到探针标记染料（LN34 使用 FAM，βA 使用 VIC/HEX）相对于反应缓冲液中被动参比染料（ROX）的荧光信号水平。
异常结果的示例如图3所示。通过比较成功运行的图表（图2）与异常图表（图3），可识别出非典型运行情况及仪器问题。图3A显示信号穿过阈值，为LN34产生了一个Ct值，但扩增曲线极为非典型，呈线性上升趋势。多组分图（图3B）也显示出波浪状线条，不符合阳性样本的典型特征。此示例强调了查看扩增曲线图的重要性，而不仅仅是复制Ct值。务必确保所有样本的扩增曲线形态正常。建议同时查看多组分图，以确认不存在任何异常。有时，在未发生扩增的情况下，杂乱的基线信号也可能生成Ct值。如果扩增信号呈线性，建议调整基线，观察曲线是否消失。若出现任何异常信号，应重复整个实验运行。若问题持续存在，建议对实时荧光定量PCR仪进行清洁，并运行空白对照板。如有条件，可通过琼脂糖凝胶电泳和/或测序分析PCR产物，以排查异常结果。但不建议将凝胶电泳或测序结果用于诊断判断。
既往研究表明，LN34 检测在重复样本、检测运行、操作人员和实验室之间均表现出较低的变异性7。如果同一标本的重复检测之间出现高变异性（&gt;±1.5 Ct 差异），应对该 RNA 重新检测。高变异性可能由移液器问题、实验室操作不规范、移液错误或实时荧光定量 PCR 仪故障引起。若在多个样本或多次检测运行中反复出现高变异性，可能提示存在系统性问题。对于 RNA 含量较低、接近阳性样本检测阈值（Ct 35）的样本，其重复检测间的 Ct 值可能表现出更高的变异性。如持续出现变异性高、结果不一致或检测失败的情况，建议咨询美国疾病控制与预防中心（CDC）并进行故障排查。
基于PCR的检测方法具有高灵敏度，因此 inherently 易受污染。严格遵守良好的实验室规范是减少交叉污染的最佳方式。了解如何识别潜在污染非常重要。如果在一次检测运行中，无模板对照（NTC）和可疑阴性样本孔均产生相似的Ct值，则应怀疑试剂污染。应使用新的PCR试剂（缓冲液、水、引物和酶）分装 aliquots 以及相同的RNA重新进行检测。如果所有样本和提取对照均产生相似的CT值，但NTC为阴性，则应调查提取试剂是否污染，并使用新试剂重新进行提取。为降低污染风险并避免丢弃大量昂贵试剂，建议将试剂分成小份 aliquots 使用。样本间的交叉污染较难识别。若怀疑样本被污染，应从原始组织重新开始采集样本。在某些情况下，对病毒RNA进行测序可确认污染，特别是当污染RNA与预期病毒变异株差异较大时（例如实验室中使用的对照病毒）。同时处理的两个样本若测序结果完全相同，可能提示污染；但如果预期序列本身就非常相似（例如同一县采集的相同变异株），则测序结果可能无法提供明确信息。若怀疑样本被阳性对照RNA污染，可将LN34检测的扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，以区分丽沙病毒RNA（165 bp）与阳性对照RNA（99 bp）。阳性对照RNA所用模板序列来自美国疾病控制与预防中心（CDC）8。
对于其他病原体，实验室人员可能习惯于手动设置阈值，以消除“噪声”，例如 图4 中以青色显示的微弱扩增信号。然而，这种做法在狂犬病诊断中并不推荐，因为可能导致假阴性结果，造成严重后果，毕竟狂犬病的致死率几乎高达100%。切勿手动调整阈值，将微弱或延迟扩增的样本结果判读为阴性。此类样本必须重新提取核酸和/或重新检测，以排除狂犬病的可能性。
<img alt="细胞结构的显微镜图像；荧光显微镜；光学分析；细胞研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66761/66761fig01.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：通过直接荧光抗体检测法显示感染驴体内狂犬病病毒抗原单侧扩散的视野。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/66761fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Real-time PCR amplification, multicomponent plots; gene expression analysis; cyclic amplification." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66761/66761fig02.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 2"> 
图2：LN34检测成功运行后的扩增曲线及多组分图。 (A-D) 结果数据绘制在 (A,C) 对数尺度和 (B,D）LN34 和 βA 检测的线性范围。图示 A 和 B 显示两个样本（粉色和青色）与阳性对照（黄色）的LN34结果。在图中 B，有一条平坦的绿色线条表示运行中的另一个阴性样本。在图A中，绿色线条未显示任何扩增，以断开的线段表示。LN34检测的阈值手动设置为0.2，由红色水平线表示。C,DβA 检测两项样本（红色和青色）的结果。βA 检测的阈值手动设置为 0.05。E,F多组分图显示了每个循环中FAM（LN34）、VIC（βA）和ROX（AgPath-ID缓冲液中存在的被动染料）的荧光值（RFU）。ROX水平应在所有循环中保持平稳。图中展示了典型的阳性样本结果 E；该样本的FAM荧光从第18个循环开始呈S形曲线增长。典型阴性样本如图中所示 F，其中FAM水平在所有循环中与ROX水平保持平行。数据来自ABI ViiA7实时PCR仪。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/66761fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="PCR扩增和多组分图；ΔRn与循环数；荧光与循环数；FAM、ROX指示剂。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66761/66761fig03.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图3"> 
图3：在ViiA7实时PCR仪上运行LN34检测时观察到的罕见且非典型信号的代表性图像。（A-F）由于孔污染导致的扩增（A、C、E）和多组分（B、D、F）图谱。FAM荧光信号的线性上升（A、C）和波动状起伏（B、D）并不反映真实的扩增，依据是曲线的形态以及荧光变化的幅度。尽管在图A和B所示的重复孔中产生了Ct值，图A至D很可能代表阴性样本。图E和F显示了一种异常的波动信号，在多组分图中更易观察到。此类信号应进一步调查，可能提示仪器存在问题，尽管本实验中所有对照均表现正常。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/66761fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="qPCR扩增曲线图，ΔRn 对循环数，双样本比较，荧光检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66761/66761fig04.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图4"> 
图4：来自两个疑似狂犬病样本的LN34实时反转录PCR扩增曲线，展示两种设定阈值的方法。（A）LN34的阈值设定为0.2（建议所有实验均采用此设定）。（B）手动为每次实验设定不同的阈值，以屏蔽被判定为“噪音”的信号（晚期扩增信号）。由于漏检真正阳性结果可能导致严重后果，因此不推荐在狂犬病检测中使用图B所示的方法。晚期扩增可能提示弱阳性样本、PCR抑制或阳性样本提取失败，也可能提示交叉污染。金色样本（由黑色箭头指示）在检测的临界值处产生Ct值，不应视为阴性。对于出现晚期扩增的样本，应重新提取核酸并重新检测。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/66761fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：在LN34lys（单重LN34）和LN34M（LN34与βA多重）实时RT-PCR检测中所用的引物和探针序列及其浓度。 LN34探针在5ʹ端标记有FAM荧光染料，在3ʹ端标记有黑洞淬灭剂（BHQ1）。βA探针在5ʹ端标记有HEX荧光染料，在3ʹ端标记有黑洞淬灭剂（BHQ1）。锁核酸修饰碱基在序列中以碱基前的加号（+）表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：LN34lys、Actin3和LN34M检测的实验设置。 引物和探针的名称、序列及浓度见表1。LN34_F1对应于ACGCTTAACAACCAGATCAAAGAA7。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：ABI仪器的循环参数。重要提示：务必在标准模式下运行，而非快速模式。应选择ROX作为被动参比染料。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/Table%203.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4：单重（上方，蓝色表格）和多重（下方，红色表格）格式下LN34实时RT-PCR结果判读算法。 只要LN34结果为阳性，无论βA结果为阴性或不确定，均应判为阳性。若未检测到LN34扩增子，则只有当βA的Ct值小于或等于表中列出的Ct值判定阈值时，方可判为阴性。βA的Ct值可反映被测样本的质量，并提示是否存在可能的抑制效应。原始临床标本中核酸浓度较低可能影响βA扩增曲线，导致无法识别出扩增信号。除上述因素外，未能检测到β-actin的其他可能原因还包括：RNA提取效率低（如RNA丢失或PCR抑制物残留）、实验操作或加样技术不当、样本类型或质量不佳，以及试剂或仪器故障。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/Table%204.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表5：LN34检测对照组的预期操作及常见结果解读。 三项对照（狂犬病阳性对照RNA、狂犬病阴性提取对照和无模板对照）均需产生预期结果，检测运行方可通过。若阳性对照或无模板对照失败，可能提示移液错误、试剂或仪器故障，此时整个实验运行（包括所有检测的RNA样本）必须重复。若提取对照失败，可能提示提取过程中存在问题，例如试剂失效、移液错误或交叉污染，所有样本的提取步骤必须重新进行。对于经验丰富的实验室人员而言，对照失败应属罕见情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66761/Table%205.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本方案展示了泛丽沙病毒LN34实时反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测的完整流程，从组织采集到结果解读，包括引物序列和反应体系的优化更新，以提升该检测方法对部分非狂犬病丽沙病毒及兔形目动物样本的检测性能。我们还演示了单孔LN34多重化（LN34M）检测格式的实验设置。

利用更新的多重LN34实时反转录-聚合酶链式反应检测法对动物进行狂犬病死后诊断

狂犬病是一种由狂犬病病毒（Lyssavirus rabies，RABV）及丽沙病毒属（Lyssavirus）其他负链RNA病毒（科：...）引起的致命性人畜共患病。

狂犬病的致死率高达百分之百，因此必须进行快速准确的诊断，以便向最需要的人群提供挽救生命的治疗。可靠的实验室检测对于狂犬病的防控至关重要。美国疾病控制与预防中心（CDC）已开发出一套基于定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的狂犬病检测分步操作方案，该方案采用经过验证的实时Alisa病毒检测方法LN34，可帮助实验室提高诊断准确性，支持狂犬病预防工作。几十年来，狂犬病检测主要依赖直接荧光抗体试验，即 DFA 或 FAT。然而，由于 RT-PCR 具有极高的灵敏度和准确性，目前许多国际实验室也采用该方法进行狂犬病检测。DFA 检测需要使用专用显微镜、冷链储存、工作人员接受专门培训，且近年来试剂常出现短缺；因此，PCR 和 RT-PCR 现已广泛用于病原体检测。许多实验室已具备 PCR 和 RT-PCR 设备、技术经验，且所需试剂可从商业供应商处获得。在人狂犬病病例最多的地区，检测成本是狂犬病检测的主要障碍。美国疾病控制与预防中心（CDC）开发了一种多重形式的 LN34 检测方法，可改进质量控制并降低每份样本的检测成本。逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）正越来越多地应用于狂犬病诊断，因其广泛用于其他病原体的检测，且结果易于解读。然而，使用经过验证的检测方法极为重要，同时确保检测过程按预期进行同样关键。我们的分步操作方案包含了质量控制、安全注意事项以及PCR最佳实践，以帮助实验室顺利开展工作。首先，穿戴个人防护装备，包括护目镜、前系式实验服和两副手套。使用季铵盐化合物或其他适用于灭活狂犬病病毒的合适消毒剂清洁并消毒工作台面。在工作台面上铺上带塑料衬里的吸水垫，使用洁净的一次性手术刀采集代表脑干和小脑完整横截面的组织样本。为了最终实现组织匀浆和RNA提取，使用一次性手术刀切碎所需组织。用拭子涂抹切碎的组织，并将拭子转移至预装有匀浆缓冲液和珠子的离心管中。使用稀释至1:256的QAC消毒剂丢弃外层手套后，清洁并消毒工作台、设备以及样本管的外表面。使用微型珠磨机均质样品，持续 60 秒。目视检查离心管。将样品在室温下静置五分钟。最后，在进行RNA提取之前，使用季铵盐类消毒剂（QAC）对工作站、设备及样本管外表面进行清洁和消毒。首先，用1:256稀释的QAC对生物安全柜表面进行去污染处理，并进行额外清洁以去除灰尘或其他环境污染物。在工作平台上铺好带塑料衬里的吸水工作垫。然后，在生物安全柜内摆放试剂和样本。将所有收集管整齐放置在用于微型离心管的洁净管架中。为每个脑组织样本预先在1.5毫升微量离心管中加入300微升100%乙醇。将匀浆后的脑组织样本在台式微量离心机中以10,000至16,000 ×g离心2分钟。将澄清的粉红色上清液转移至含有100%乙醇的新无菌管中，用移液器吹打混匀，并将600微升乙醇-上清液混合物转移至收集管中的离心柱内。离心一分钟，直至液体完全通过柱子，弃去滤过液，并将每根柱子转移至新的收集管中。向每根柱子中加入400微升RNA预洗缓冲液。在10,000至16,000 ×g条件下离心30秒，弃去滤过液。将每个离心柱放回相同的收集管中，并重复预洗步骤第二次。接着，向每个离心柱中加入700 µL RNA洗涤缓冲液。在10,000至16,000 ×g条件下离心2分钟。小心地将溶液转移至无RNase的离心管中。弃去流穿液和收集管，然后脱去并丢弃外层手套。现在直接向柱基质中加入50 µL无DNase和RNase的水，并孵育30秒。然后在10,000至16,000 G条件下离心1分钟。小心将RNA转移至一个新的带螺口盖、平底、已标记编号的微量离心管中，用于RT-PCR检测。首先，在配制主混合液的工作区域，将一步法RT-PCR缓冲液、无模板对照、无核酸酶水、引物和探针置于冰上解冻。将一步法 RT-PCR 酶置于冰上。计算 LN34 多重检测和 beta A 主混合液中每种试剂的体积。使用 96 孔板布局图，为 LN34 多重检测的每个样本指定三个复孔。涡旋并离心后，将23 µL的LN34多重反应主混合液加入至每个指定用于LN34的孔中。为建立阴性模板对照反应，向每个阴性模板对照孔中加入2 µL的PCR级水。将96孔板置于冰上。用70%乙醇清洁工作台。现在进入模板编辑工作区，将RNA样本和人工RNA的单次使用阳性对照在冰上解冻。涡旋混匀后，短暂离心含有RNA样本的管子，用移液器吸取两微升样本或阳性对照RNA加入相应的孔中。加入所有样品后，将光学粘合盖覆盖在孔板上，以完全密封。在室温下以500 G离心1分钟，将密封好的孔板放入已校准用于FAM和VIC Hex报告染料的实时或定量PCR仪中。将仪器设置为适当的扩增循环参数。运行结束后，将LN34的阈值设为0.2，β-actin的阈值设为0.05。检查对照样品曲线是否存在任何质量问题。在对数尺度下观察，LN34检测显示出成功的扩增曲线，阳性结果在不同的循环阈值（Ct值）处跨越阈值线。在LN34和β-肌动蛋白的线性尺度上均呈现S形扩增曲线。阴性结果表现为无扩增的平坦曲线。异常扩增曲线表现为部分样本的荧光信号呈线性增长而非S形，提示结果异常。相应的多组分图显示了不规则的波浪状荧光信号，而非预期的平滑曲线，凸显了需要分析扩增曲线，而不能仅依赖循环阈值（Ct值）。

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生物学

通过更新的多重 LN34 实时逆转录聚合酶链反应测定法对动物狂犬病进行尸检诊断

直接快速免疫组织化学检测法（DRIT）是被世界动物卫生组织和世界卫生组织（OIE/WHO）认可的狂犬病诊断直接荧光抗体（DFA）检测的替代方法。该检测可在现场应用，利用光学显微镜对脑组织涂片进行检测，约1小时内即可完成。...

增强型狂犬病监测：采用直接快速免疫组织化学检测法

已开发出一种广谱丽沙病毒巢式逆转录聚合酶链式反应，可特异性检测所有已知的丽沙病毒。使用不同动物种类的狂犬病脑组织样本进行验证表明，该方法的灵敏度和特异性与金标准荧光抗体检测相当，可用于常规狂犬病诊断。...

一种用于检测丽沙病毒的通用巢式逆转录聚合酶链式反应的评估

本方案的目的是演示在小型和大型动物中进行安全剖检的技术，以获得用于狂犬病检测的满意组织样本。...

大型与小型动物狂犬病尸检技术

这种使用双链DNA嵌 intercalating...

泛丽沙病毒实时逆转录聚合酶链式反应用于狂犬病诊断

我们提供了一套完整的现场条件下动物狂犬病死后诊断方案，采用快速免疫层析诊断试验（RIDT），从脑组织活检取样到最终结果判读。我们还描述了该设备在分子分析和病毒基因分型中的进一步应用。...

适用于资源有限地区的现场尸体解剖后狂犬病快速免疫层析诊断检测及后续分子应用

本文介绍一种用于检测狂犬病病毒抗原的免疫组织化学检测方案，可作为福尔马林固定组织的替代诊断方法。...

免疫组织化学检测法用于检测福尔马林固定组织中的丽沙病毒抗原

本方案介绍了一种基于qRT-PCR的方法，通过体外转录技术测定牛脑不同解剖结构中狂犬病病毒核蛋白（N）基因的拷贝数。...

定量分析不同牛脑结构中的狂犬病病毒

Solaris qPCR 基因表达检测试剂盒是一类新型的预设计 qPCR 引物/探针组合，旨在简化 qPCR...

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利用实时荧光定量PCR分析翡翠灰螟（Agrilus planipennis）中的基因表达

聚合酶链式反应（PCR）已成为许多分子生物学实验室中常用的技术。本文提供若干常规PCR方案的快速指南。由于每个反应都是一个独特的实验，因此生成产物所需的最适条件各不相同。理解反应中的各种变量将极大提高故障排除的效率，从而增加获得预期结果的可能性。...

聚合酶链式反应：基础方案及故障排除与优化策略

了解使用LN34多重实时RT-PCR检测动物狂犬病的完整流程。该方案涵盖从脑组织采集、RNA提取到结果判读的标准化步骤，可显著提升诊断准确性并支持狂犬病防控工作。

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