利用更新的多重LN34实时反转录-聚合酶链式反应检测法对动物进行狂犬病死后诊断
2025年5月2日
本方案展示了泛丽沙病毒LN34实时反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测的完整流程，从组织采集到结果解读，包括引物序列和反应体系的优化更新，以提升该检测方法对部分非狂犬病丽沙病毒及兔形目动物样本的检测性能。我们还演示了单孔LN34多重化（LN34M）检测格式的实验设置。
狂犬病的致死率高达百分之百，因此必须进行快速准确的诊断，以便向最需要的人群提供挽救生命的治疗。可靠的实验室检测对于狂犬病的防控至关重要。美国疾病控制与预防中心（CDC）已开发出一套基于定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）的狂犬病检测分步操作方案，该方案采用经过验证的实时Alisa病毒检测方法LN34，可帮助实验室提高诊断准确性，支持狂犬病预防工作。
几十年来，狂犬病检测主要依赖直接荧光抗体试验，即 DFA 或 FAT。然而，由于 RT-PCR 具有极高的灵敏度和准确性，目前许多国际实验室也采用该方法进行狂犬病检测。DFA 检测需要使用专用显微镜、冷链储存、工作人员接受专门培训，且近年来试剂常出现短缺；因此，PCR 和 RT-PCR 现已广泛用于病原体检测。
许多实验室已具备 PCR 和 RT-PCR 设备、技术经验，且所需试剂可从商业供应商处获得。在人狂犬病病例最多的地区，检测成本是狂犬病检测的主要障碍。美国疾病控制与预防中心（CDC）开发了一种多重形式的 LN34 检测方法，可改进质量控制并降低每份样本的检测成本。
逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）正越来越多地应用于狂犬病诊断，因其广泛用于其他病原体的检测，且结果易于解读。然而，使用经过验证的检测方法极为重要，同时确保检测过程按预期进行同样关键。我们的分步操作方案包含了质量控制、安全注意事项以及PCR最佳实践，以帮助实验室顺利开展工作。
首先，穿戴个人防护装备，包括护目镜、前系式实验服和两副手套。使用季铵盐化合物或其他适用于灭活狂犬病病毒的合适消毒剂清洁并消毒工作台面。在工作台面上铺上带塑料衬里的吸水垫，使用洁净的一次性手术刀采集代表脑干和小脑完整横截面的组织样本。
为了最终实现组织匀浆和RNA提取，使用一次性手术刀切碎所需组织。用拭子涂抹切碎的组织，并将拭子转移至预装有匀浆缓冲液和珠子的离心管中。使用稀释至1:256的QAC消毒剂丢弃外层手套后，清洁并消毒工作台、设备以及样本管的外表面。
使用微型珠磨机均质样品，持续 60 秒。目视检查离心管。将样品在室温下静置五分钟。
最后，在进行RNA提取之前，使用季铵盐类消毒剂（QAC）对工作站、设备及样本管外表面进行清洁和消毒。首先，用1:256稀释的QAC对生物安全柜表面进行去污染处理，并进行额外清洁以去除灰尘或其他环境污染物。
在工作平台上铺好带塑料衬里的吸水工作垫。然后，在生物安全柜内摆放试剂和样本。将所有收集管整齐放置在用于微型离心管的洁净管架中。
为每个脑组织样本预先在1.5毫升微量离心管中加入300微升100%乙醇。将匀浆后的脑组织样本在台式微量离心机中以10,000至16,000 ×g离心2分钟。将澄清的粉红色上清液转移至含有100%乙醇的新无菌管中，用移液器吹打混匀，并将600微升乙醇-上清液混合物转移至收集管中的离心柱内。
离心一分钟，直至液体完全通过柱子，弃去滤过液，并将每根柱子转移至新的收集管中。向每根柱子中加入400微升RNA预洗缓冲液。在10,000至16,000 ×g条件下离心30秒，弃去滤过液。
将每个离心柱放回相同的收集管中，并重复预洗步骤第二次。接着，向每个离心柱中加入700 µL RNA洗涤缓冲液。在10,000至16,000 ×g条件下离心2分钟。
小心地将溶液转移至无RNase的离心管中。弃去流穿液和收集管，然后脱去并丢弃外层手套。现在直接向柱基质中加入50 µL无DNase和RNase的水，并孵育30秒。
然后在10,000至16,000 G条件下离心1分钟。小心将RNA转移至一个新的带螺口盖、平底、已标记编号的微量离心管中，用于RT-PCR检测。首先，在配制主混合液的工作区域，将一步法RT-PCR缓冲液、无模板对照、无核酸酶水、引物和探针置于冰上解冻。
将一步法 RT-PCR 酶置于冰上。计算 LN34 多重检测和 beta A 主混合液中每种试剂的体积。使用 96 孔板布局图，为 LN34 多重检测的每个样本指定三个复孔。
涡旋并离心后，将23 µL的LN34多重反应主混合液加入至每个指定用于LN34的孔中。为建立阴性模板对照反应，向每个阴性模板对照孔中加入2 µL的PCR级水。将96孔板置于冰上。
用70%乙醇清洁工作台。现在进入模板编辑工作区，将RNA样本和人工RNA的单次使用阳性对照在冰上解冻。涡旋混匀后，短暂离心含有RNA样本的管子，用移液器吸取两微升样本或阳性对照RNA加入相应的孔中。
加入所有样品后，将光学粘合盖覆盖在孔板上，以完全密封。在室温下以500 G离心1分钟，将密封好的孔板放入已校准用于FAM和VIC Hex报告染料的实时或定量PCR仪中。将仪器设置为适当的扩增循环参数。
运行结束后，将LN34的阈值设为0.2，β-actin的阈值设为0.05。检查对照样品曲线是否存在任何质量问题。在对数尺度下观察，LN34检测显示出成功的扩增曲线，阳性结果在不同的循环阈值（Ct值）处跨越阈值线。
在LN34和β-肌动蛋白的线性尺度上均呈现S形扩增曲线。阴性结果表现为无扩增的平坦曲线。异常扩增曲线表现为部分样本的荧光信号呈线性增长而非S形，提示结果异常。
相应的多组分图显示了不规则的波浪状荧光信号，而非预期的平滑曲线，凸显了需要分析扩增曲线，而不能仅依赖循环阈值（Ct值）。
概述
本方案展示了从组织采集到结果解读的泛丽沙病毒LN34实时反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法。其中包括引物序列和配方的更新，以提高该检测方法对非狂犬病丽沙病毒及兔形目动物样本的检测性能。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 病毒学
- 诊断方法
背景
- 狂犬病是一种致命性疾病，需要快速诊断以实现有效治疗。
- 可靠的实验室检测对于狂犬病防控至关重要。
- 美国疾病控制与预防中心（CDC）开发了一种经过验证的RT-PCR检测方法，称为LN34。
- 与传统检测方法相比，RT-PCR具有优异的灵敏度和准确性。
研究目的
- 提供使用RT-PCR进行狂犬病检测的逐步操作方案。
- 提高诊断准确性，支持狂犬病防控工作。
- 展示LN34多重检测体系的操作流程。
使用的方法
- 脑组织样本的采集与匀浆化处理。
- RNA的提取与纯化步骤。
- LN34多重RT-PCR检测的建立。
- 整个实验流程中的质量控制措施与安全注意事项。
主要结果
- LN34 检测显示出对 RNA 的成功扩增。
- 多重检测格式提高了质量控制水平并降低了成本。
- 结果易于解读，增强了诊断能力。
- 实验方案包含全面的质量控制措施。
结论
- LN34 RT-PCR 检测法对狂犬病诊断具有良好的效果。
- 检测性能的改进有助于狂犬病防控工作的开展。
- 经过验证的检测方法对于准确诊断狂犬病至关重要。
常见问题
行业重要性概要
准确的狂犬病死后诊断对于公共卫生和人畜共患病管理至关重要，直接影响风险评估和干预策略。多重LN34实时逆转录PCR检测可实现对丽沙病毒RNA的标准化、高灵敏度检测，支持可靠的靶标验证，并减少诊断的不确定性。将其整合到实验室工作流程中，有助于提高病原体监测和疫情应对的整体可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够稳健检测狂犬病毒RNA，为诊断开发中的靶标确证提供可靠依据。
- 通过区分真阴性结果与不确定或假阴性结果，支持机制层面的风险排除。
- 通过提供高置信度的排除或确认结果，助力狂犬病感染的项目组合筛选。
筛选与检测方法开发
- 为下游诊断工作流程提供标准化、可重复的检测条件。
- 确保定量输出（Ct值），实现样本间及运行间结果的客观比较。
- 制备经过验证的生物系统，用于病原体检测中的可扩展筛选及平台重复利用。
转化与临床前研究
- 使诊断结果与传染病模型的转化生物标志物要求保持一致。
- 通过支持跨物种检测，实现从发现到临床前验证的连续性。
- 通过确保检测方法的特异性和灵敏度，降低推进诊断候选物的风险。
流程与工作流整合
LN34 RT-PCR 检测适用于病原体检测系统的诊断发现连续过程，涵盖从早期假设验证到临床前验证的各个阶段。
- 发现生物学：为狂犬病病毒检测中的假设验证和机制阐明提供经过验证的框架。
- 筛查：提供可重复、定量的检测结果（Ct 阈值），用于可靠的样本评估。
- 分析：通过手动阈值调整和对照监控，实现标准化数据分析及不同运行间的可比性。
- 转化研究：支持在不同动物模型和组织类型中进行生物标志物的比对与连续性分析。
- 企业级复用：可作为可重复使用的诊断能力，适用于多种实验室环境和病原体检测面板。
运营与企业影响
- 科学价值：提高病原体检测的预测可信度，降低诊断不确定性。
- 操作价值：促进实验室网络间检测方法的标准化、可重复性和成本效益。
- 战略价值：支持诊断开发过程中基于信息的决策，优化资源分配。
- 组合影响：支持基于风险调整的诊断资产优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备逆转录PCR（RT-PCR）实验操作、数据分析和质量控制方面的专业技术知识。
- 依赖于实时PCR仪器设备以及经过验证的试剂的可及性。
- 要求在不同实验团队之间对样本采集、处理和分析进行严格的标准化统一。
- 必须根据本方案所支持的不同组织类型和动物模型进行相应调整。
- 必须严格遵守操作规程，以避免出现假阳性、假阴性或无法得出结论的结果。
