Name: 抗菌氧化石墨烯/铜纳米复合材料的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 学习制备氧化石墨烯/铜纳米复合材料的方法，用于对抗耐药细菌的抗菌应用。该低成本方案无需额外表面活性剂，适用于大规模生产和生物医学领域。

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本研究得到了2022年中央大学研究基金（在Jonghoon Choi教授学术休假期间）的支持。&#160;本研究还得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划的资助，该计划由教育部长资助（编号：RS-2023-00275006），以及韩国环境产业 &amp;#38; 科技研究院（KEITI）资助项目，由韩国环境部（MOE）提供资金支持（编号：2022002980003）。临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）及 P. aeruginosa 来自韩国中央大学医院。

1. GO/Cu 纳米复合材料的制备
注意：在氧化石墨烯纳米片上生长的铜纳米颗粒的尺寸和形貌由氧化石墨烯的氧化程度、铜前驱体的浓度以及还原剂的浓度决定26。
<ol>
	<li>在玻璃瓶中配制10 mL浓度为1 mg/mL的氧化石墨烯（GO）悬浮液。将GO悬浮液超声处理1小时，直至GO在去离子水（DI水）中充分分散。</li>
	<li>配制 20 mM CuCl 溶液2 溶液置于玻璃小瓶中。对CuCl进行超声处理2 溶液直至 CuCl2 在去离子水中分散良好。</li>
	<li>加入10 mL的20 mM CuCl溶液2 将溶液加入GO溶液中，并对混合物进行超声处理 70 °C 1小时。</li>
	<li>配制 20 mM NaBH₄4 溶液 
	警告：该步骤必须在化学通风橱中进行。还原剂 NaBH₄ 加入后立即发生氧化还原反应。4 加入水中。制备 NaBH4 实验前立即配制溶液。</li>
	<li>配制 NaBH₄ 混合液4，GO 和 CuCl2
	<ol>
		<li>加入 20 mL 20 mM NaBH4 GO 和 CuCl 的溶液2 混合物，同时用磁力搅拌器以200 rpm的速度搅拌。加入NaBH后4 溶液，持续搅拌30分钟。 
		警告：此操作必须在化学通风橱中进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>混合物的离心
	<ol>
		<li>将步骤1.5.1中的混合物转移至离心管中，在23,000 × g 室温孵育10分钟。弃去上清液。 
		警告：操作离心机时，务必通过放置重量相等的离心管来保持平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用10 mL去离子水重悬GO/Cu纳米复合材料混合物，并进行超声处理，使沉淀物均匀分散于溶液中。</li>
	<li>在 23,000 × g 条件下离心溶液 g 室温孵育10分钟，然后移除上清液。</li>
	<li>重复步骤 1.7–1.8 一次，以去除未反应的化学物质。</li>
	<li>向GO/Cu纳米复合材料中加入1 mL蒸馏水，超声处理混合物，使沉淀物在液相中均匀分散。 
	注意：将所有GO/Cu纳米复合材料溶液收集至一个锥形管中。</li>
	<li>在 −80 °C 下冷冻干燥该溶液60 °C 在真空条件下干燥过夜，直至氧化石墨烯/铜纳米复合材料完全干燥，得到氧化石墨烯/铜纳米复合粉末。</li>
	<li>将GO/Cu纳米复合粉末在−20 °C下保存20 °C 直至使用。</li>
</ol>
2. 抗菌试验用细菌的制备
警告：此操作必须在生物安全柜中进行，并使用酒精灯。细菌废弃物必须经高压灭菌后方可丢弃。处理耐抗生素细菌时，必须佩戴手套、防护服和口罩，实验结束后须使用肥皂或手部消毒剂彻底洗手。应始终彻底消毒；若实验区域发生污染，须立即使用70%乙醇进行消毒。
<ol>
	<li>细菌培养基制备
	<ol>
		<li>在锥形瓶中混合 20 g 胰蛋白胨大豆琼脂和 500 mL 蒸馏水。将混合物在高压灭菌器中于 121 °C 灭菌 15 分钟。</li>
		<li>在琼脂凝固前，将 15 mL 琼脂溶液倒入培养皿中以制备琼脂平板。将琼脂平板储存于 4 °C，待用。 
		注意：必须在琼脂溶液凝固前迅速操作。为防止污染，在琼脂凝固过程中使用紫外线照射灭菌 15 分钟。</li>
		<li>在锥形瓶中混合 15 g 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和 500 mL 蒸馏水。将混合物在高压灭菌器中于 121 °C 灭菌 15 分钟。</li>
		<li>将 40–50 mL 肉汤溶液分装至 50 mL 锥形管中。将肉汤储存于 4 °C，待用。 
		注意：为防止污染，对分装后的肉汤使用紫外线照射灭菌 15 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌培养
	<ol>
		<li>使用接种环将 MSRA 或 P. aeruginosa 菌种接种至琼脂平板上。将琼脂平板置于 37 °C 摇床培养箱中培养 24 小时。</li>
		<li>使用接种环将单个细菌菌落接种至 10 mL 肉汤中。将肉汤置于 37 °C 摇床培养箱中，以 200 rpm 振荡培养 24 小时。</li>
		<li>重复步骤 2.2.1–2.2.2 一次，以获得具有相同特性的细菌。</li>
		<li>培养 24 小时后，使用无菌蒸馏水对细菌溶液进行十倍系列稀释。取 100 µL 稀释后的细菌悬液接种至琼脂平板上，并用涂布棒均匀涂布。将琼脂平板置于 37 °C 摇床培养箱中培养 24 小时。 
		注意：稀释程度取决于细菌种类。目标是使一个琼脂平板上的菌落数少于 100 个。</li>
		<li>培养 24 小时后计数细菌菌落，利用公式（1）计算菌落形成单位（CFU）。 
		<img alt="细菌CFU计算公式，显示微生物分析中的稀释因子与菌落计数。" src="/files/ftp_upload/66762/66762eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> （1）</li>
		<li>重复步骤 2.2.4–2.2.5 至少三次，以确认细菌的 CFU 是否相对恒定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 采用微量稀释肉汤法进行抗菌试验
<ol>
	<li>第1天）用接种环从琼脂平板上挑取单个细菌菌落，接种至10 mL液体培养基中。将培养基置于37 °C、200 rpm的摇床培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>第2天）使用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）配制至少三种浓度的GO/Cu纳米复合材料混合液。对GO/Cu纳米复合材料悬浮液进行超声处理，直至纳米复合材料在DPBS中充分分散。 
	注意：本实验方案中测试了500、250、125和62.5 µg/mL的GO/Cu纳米复合材料混合液浓度。</li>
	<li>制备对照溶液。阴性对照为DPBS，阳性对照为含1%青霉素/链霉素的DPBS溶液，可杀死细菌。</li>
	<li>将100 µL GO/Cu纳米复合材料悬浮液及对照溶液加入96孔板中。所有样品均设三个复孔。 
	注意：在施加于细菌前，需用紫外光对样品灭菌15分钟。</li>
	<li>根据孵育24小时后的菌落形成单位（CFU）数值，用TSB培养基将细菌悬浮液稀释至1 × 106 CFU/mL。 
	注意：本研究中，根据步骤2.2.5，MRSA和P. aeruginosa的初始培养悬浮液浓度分别为4.5 × 109 CFU/mL和3 × 109 CFU/mL。通过分别稀释4,500倍和3,000倍，获得1 × 106 CFU/mL的细菌浓度。</li>
	<li>向96孔板的各样品孔中加入100 µL浓度为1 × 106 CFU/mL的稀释细菌悬浮液。将96孔板置于37 °C、200 rpm的摇床培养箱中孵育24小时。 
	注意：与100 µL样品混合后，细菌的终浓度为5 × 105 CFU/mL。</li>
	<li>第3天）使用200 µL移液枪头剧烈混匀样品与细菌悬浮液。用无菌蒸馏水对样品-细菌混合物进行10倍系列稀释。 
	注意：稀释程度取决于细菌种类。目标是在琼脂平板上获得少于100个菌落。</li>
	<li>取100 µL稀释后的细菌悬浮液接种于琼脂平板上，并用涂布棒均匀涂布。将琼脂平板置于37 °C摇床培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>第4天）计数细菌菌落，利用公式（2）计算CFU值，以确认GO/Cu纳米复合材料的抗菌活性。 
	<img alt="活菌百分比，CFU比值公式，微生物分析用数学方程。" src="/files/ftp_upload/66762/66762eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"> (2)</li>
</ol>

Antibacterial Graphene Oxide/Copper Nanocomposites for Resistant Bacteria

<ol><li>Doron, S., Gorbach, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+infections%3A+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22International+Encyclopedia+of+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Bacterial infections: Overview.</a> International Encyclopedia of Public Health. , 273-282 (2008).</li>
<li>Van Duin, D., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug-resistant+bacteria+in+the+community%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Dis+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Multidrug-resistant bacteria in the community: An update.</a> Infect Dis Clin North Am. 34 (4), 709-722 (2020).</li>
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<li>Sánchez-López, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal-based+nanoparticles+as+antimicrobial+agents%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Metal-based nanoparticles as antimicrobial agents: An overview.</a> Nanomaterials (Basel). 10 (2), 292(2020).</li>
<li>Makabenta, J. M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterial-based+therapeutics+for+antibiotic-resistant+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nanomaterial-based therapeutics for antibiotic-resistant bacterial infections.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (1), 23-36 (2021).</li>
<li>Liang, X., Govindaraju, S., Yun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+applicability+of+polyaniline+coated+gold+nanorods%3A+A+study+of+antibacterial+and+redox+activity%5BTitle%5D)+AND+%22BioChip+J%22%5BJournal%5D)">Dual applicability of polyaniline coated gold nanorods: A study of antibacterial and redox activity.</a> BioChip J. 12 (2), 137-145 (2018).</li>
<li>Niño-Martínez, N., Salas Orozco, M. F., Martínez-Castañón, G. A., Torres Méndez, F., Ruiz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+bacterial+resistance+to+metal+and+metal+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of bacterial resistance to metal and metal oxide nanoparticles.</a> Int J Mol Sci. 20 (11), 2808(2019).</li>
<li>Kim, J., Choi, Y., Park, J., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin-gallic+acid+microcomplexes+release+go%2Fcu+nanomaterials+to+eradicate+antibiotic-resistant+microbes+and+their+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Gelatin-gallic acid microcomplexes release go/cu nanomaterials to eradicate antibiotic-resistant microbes and their biofilm.</a> ACS Infect Dis. 9 (2), 296-307 (2023).</li>
<li>Jang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+antibiofilm+nanocomposites%3A+Ag%2Fcu+bimetallic+nanoparticles+synthesized+on+the+surface+of+graphene+oxide+nanosheets%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Development of antibiofilm nanocomposites: Ag/cu bimetallic nanoparticles synthesized on the surface of graphene oxide nanosheets.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 12 (32), 35826-35834 (2020).</li>
<li>Jang, J., Choi, Y., Tanaka, M., Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+silver%2Fgraphene+oxide+nanocomposites+for+antibacterial+and+antibiofilm+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Eng+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of silver/graphene oxide nanocomposites for antibacterial and antibiofilm applications.</a> J Ind Eng Chem. 83, 46-52 (2020).</li>
<li>Bankier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+antibacterial+effects+of+metallic+nanoparticle+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Synergistic antibacterial effects of metallic nanoparticle combinations.</a> Sci Rep. 9 (1), 16074(2019).</li>
<li>Mendes, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+action+and+target+mechanisms+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Antibacterial action and target mechanisms of zinc oxide nanoparticles against bacterial pathogens.</a> Sci Rep. 12 (1), 2658(2022).</li>
<li>Yoon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+benign+multi-functional+mesoporous+silica+encapsulated+gold%2Fsilver+nanorods+for+anti-bacterial+applications+by+on-demand+release+of+silver+ions%5BTitle%5D)+AND+%22BioChip+J%22%5BJournal%5D)">Biologically benign multi-functional mesoporous silica encapsulated gold/silver nanorods for anti-bacterial applications by on-demand release of silver ions.</a> BioChip J. 13 (4), 362-369 (2019).</li>
<li>Slavin, Y. N., Asnis, J., Häfeli, U. O., Bach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+nanoparticles%3A+Understanding+the+mechanisms+behind+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Metal nanoparticles: Understanding the mechanisms behind antibacterial activity.</a> J Nanobiotechnology. 15 (1), 65(2017).</li>
<li>Ismail, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonochemical+synthesis+of+a+copper+reduced+graphene+oxide+nanocomposite+using+honey+and+evaluation+of+its+antibacterial+and+cytotoxic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Sonochemical synthesis of a copper reduced graphene oxide nanocomposite using honey and evaluation of its antibacterial and cytotoxic activities.</a> Front Mol Biosci. 9, 995853(2022).</li>
<li>Tu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remarkable+antibacterial+activity+of+reduced+graphene+oxide+functionalized+by+copper+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Remarkable antibacterial activity of reduced graphene oxide functionalized by copper ions.</a> Adv Funct Mater. 31 (13), 2008018(2021).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+molecular+understanding+of+the+antibacterial+mechanism+of+copper-bearing+titanium+alloys+against+staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Toward a molecular understanding of the antibacterial mechanism of copper-bearing titanium alloys against staphylococcus aureus.</a> Adv Healthc Mater. 5 (5), 557-566 (2016).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+antibacterial+stable+reduced+graphene+oxide+nanocomposites+loaded+with+cuprous+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term antibacterial stable reduced graphene oxide nanocomposites loaded with cuprous oxide nanoparticles.</a> J Colloid Interface Sci. 533, 13-23 (2019).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%2Fcopper+nanoderivatives-modified+chitosan%2Fhyaluronic+acid+dressings+for+facilitating+wound+healing+in+infected+full-thickness+skin+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide/copper nanoderivatives-modified chitosan/hyaluronic acid dressings for facilitating wound healing in infected full-thickness skin defects.</a> Int J Nanomedicine. 15, 8231-8247 (2020).</li>
<li>Mao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide-copper+nanocomposites+suppress+cariogenic+streptococcus+mutans+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide-copper nanocomposites suppress cariogenic streptococcus mutans biofilm formation.</a> Int J Nanomedicine. 16, 7727-7739 (2021).</li>
<li>Ravikumar, V., Mijakovic, I., Pandit, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activity+of+graphene+oxide+contributes+to+alteration+of+key+stress-related+and+membrane+bound+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activity of graphene oxide contributes to alteration of key stress-related and membrane bound proteins.</a> Int J Nanomedicine. 17, 6707-6721 (2022).</li>
<li>Afreen, G., Shoeb, M., Upadhyayula, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+reactive+oxygen+species+generated+from+rgo%2Fcds+qd+heterostructure+for+photodegradation+and+disinfection+of+pollutants+in+waste+water%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of reactive oxygen species generated from rgo/cds qd heterostructure for photodegradation and disinfection of pollutants in waste water.</a> Mater Sci Eng C. 108, 110372(2020).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+graphene+oxide%2Fcopper+synergistic+antibacterial+coating+for+medical+titanium+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Fabrication of graphene oxide/copper synergistic antibacterial coating for medical titanium substrate.</a> J Colloid Interface Sci. 638, 1-13 (2023).</li>
<li>Rajapaksha, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+properties+of+graphene+oxide-copper+oxide+nanoparticle+nanocomposites%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Bio+Mater%22%5BJournal%5D)">Antibacterial properties of graphene oxide-copper oxide nanoparticle nanocomposites.</a> ACS Appl Bio Mater. 2 (12), 5687-5696 (2019).</li>
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<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+icmf3+locus+is+involved+in+multiple+adaptation-+and+virulence-related+characteristics+in+pseudomonas+aeruginosa+pao1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The icmf3 locus is involved in multiple adaptation- and virulence-related characteristics in pseudomonas aeruginosa pao1.</a> Front Cell Infect Microbiol. 5, 70(2015).</li>
</ol>

Jonghoon Choi 博士是纳米医学公司费曼技术研究所的首席执行官兼创始人，Yonghyun Choi 博士是该研究所的首席技术官。

本文报道了一种低成本且简便的方法，用于制备负载铜纳米颗粒的氧化石墨烯（GO）纳米片，该方法有望高效清除耐药性细菌。合成GO/Cu纳米复合材料的关键步骤是将GO和CuCl2在溶液中充分分散，并在混合过程中维持较高温度。此外，还原反应步骤必须迅速进行，因为还原剂一旦接触水即刻引发还原反应。通常情况下，铜纳米颗粒极易发生自聚集，在生理介质中稳定性较差28。GO可作为锚定纳米颗粒的基底，有效促进铜纳米颗粒在水中的分散29。本研究中，鉴于其潜在的生物医学应用价值，我们在合成GO/Cu纳米复合材料时未使用额外的表面活性剂和封端剂。
因此，干燥的氧化石墨烯/铜（GO/Cu）纳米复合材料表现出明显的静电和团聚现象，但在水中分散良好。我们采用临床耐药菌模拟真实环境，以帮助确定在实际条件下影响耐药菌所需的GO/Cu纳米复合材料浓度。在我们之前的研究中，50 µg/mL的GO/Cu对非临床来源的P. aeruginosa生长抑制率达到67%8。此外，Mao等人研究表明，80 µg/mL的GO/Cu可清除超过99%的非临床来源的Streptococcus mutans20。相比之下，临床菌株表现出更高的存活率。这凸显了开发具有优化抗菌效果的抗菌物质并准确评估其抗菌效能的必要性。
银、ZnO 和 TiO2 也可用于制备石墨烯纳米复合材料，它们各有优缺点，因此可制备出针对特定应用领域优化的抗菌材料。在合成 GO/Cu 纳米复合材料时，必须考虑多种因素，以实现最佳的抗菌效果。GO 的氧化程度显著影响 Cu 纳米粒子的沉积。如果能够控制氧化位点，则可在纳米片表面设计 Cu 纳米粒子的沉积位置。此外，通过调节 Cu 纳米粒子的尺寸和形貌，可以调控纳米复合材料的抗菌性能，而这些参数取决于 GO 的氧化程度、Cu 前驱体的浓度以及还原剂的浓度26。在适当浓度下，这种优化的纳米复合材料可对细菌产生杀伤作用，同时对人类或动物细胞不表现出毒性8。
评估金属纳米复合材料抗菌效果时，最重要的方面是考虑细菌的倍增时间。由于需要同时接种细菌，应先将样品加入96孔板中，随后加入细菌悬液，这是因为铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的倍增时间约为20分钟30,31。此外，在使用细菌时，剧烈涡旋振荡始终是保持菌液浓度均匀的关键步骤。通常通过微量稀释肉汤法测定吸光度，以确定最低抑菌浓度。然而，金属纳米颗粒会干扰吸光度，使得通过吸光度判断细菌活性变得困难。因此，在使用不透明的金属纳米颗粒时，必须采用菌落计数法。
本研究制备的氧化石墨烯/铜（GO/Cu）纳米复合材料对源自真实患者慢性伤口的耐药菌——耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和P. aeruginosa——表现出显著的抗菌活性。换言之，所开发的纳米复合材料能够有效杀灭革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。GO/Cu 纳米复合材料可强烈附着于细菌膜，导致细菌细胞壁破裂并增加其通透性15,16。由于无需使用表面活性剂或封端剂，可降低对宿主细胞的毒性，同时实现低成本制备抗菌材料。这些发现凸显了 GO/Cu 纳米复合材料作为应对耐药菌株（特别是在医院感染背景下）的有前景材料的潜力。该类纳米复合材料可应用于感染治疗及抗菌涂层，是清除耐药菌应用中的可行候选材料。

细菌感染对公共健康具有重大影响。特别是致病性细菌能够逃避人体的保护机制并引发疾病1。抗生素被广泛用于治疗细菌感染。然而，抗生素的不当使用已加速了耐药细菌的出现。目前，由耐药细菌引起的医院内感染已在医疗机构中导致显著的临床难题2。不幸的是，针对目前所有抗生素，细菌均已存在相应的耐药机制3。因此，开发新型抗生素至关重要，&#160;尽管&#160;耐药机制出现的可能性仍然很高。
由于金属纳米颗粒具有显著的抗菌特性，其作为对抗耐药菌的有效制剂已受到广泛关注4,5,6。细菌难以对金属纳米颗粒产生耐药机制，因为这些颗粒不会与特定的细菌受体结合7。特别是银、铜和氧化锌纳米颗粒，因其卓越的抗菌效果，已成为大量研究的重点8,9,10,11,12,13。金属纳米颗粒对细菌的毒性主要归因于三种机制：1）金属离子的释放；2）活性氧（ROS）的产生，如•OH和•O2−；以及3）物理相互作用与附着4,14。
在本研究中，开发了氧化石墨烯/铜（GO/Cu）纳米复合材料作为抗菌剂。铜（Cu）能够有效杀灭接触其表面的病原体，并干扰细菌的基因复制。然而，铜是人体必需的微量元素，由于哺乳动物细胞具有调节细胞内铜浓度的稳态机制，因此对哺乳动物细胞的毒性较低4。当铜纳米颗粒被氧化时，会生成铜离子，这些离子对带负电荷的细菌具有相对较高的亲和力15,16。铜离子可结合细胞结构（如蛋白质、膜和DNA），破坏细胞功能17。通过在氧化石墨烯（GO）表面合成铜纳米颗粒，可以控制金属离子的释放速率18,19,20。此外，氧化石墨烯（GO）本身也具有抗菌作用，其粗糙表面可通过氧化应激或活性氧（ROS）的形成来抑制细菌黏附21,22。更重要的是，GO/Cu纳米复合材料通过Cu2+的化学作用比GO产生更多的ROS，从而损伤细菌的蛋白质和DNA，导致细菌死亡23,24。
本文概述了氧化石墨烯/铜（GO/Cu）纳米复合材料的合成方案，并介绍了一种针对临床细菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和P. aeruginosa的抗菌测试方法，这两种细菌是最常见的多重耐药菌株，可引起医院内感染25。本方案旨在介绍一种简便的化学还原法，用于合成能够抑制耐药细菌生长的GO/Cu纳米复合材料。我们分别使用氯化铜（II）（CuCl2）和硼氢化钠（NaBH4）作为前驱体和还原剂。该方案还详细描述了采用微量稀释肉汤法将这些纳米复合材料应用于细菌的具体操作步骤。为排除金属纳米颗粒吸收干扰带来的误差并实现准确评估，抗菌能力通过菌落计数法进行评价。

<table><tbody><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>临床多重耐药细菌菌株&amp;nbsp;</td><td>Chung-Ang University Hospital (韩国首尔)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化铜(II)</td><td>Duksan</td><td>10125-13-0</td><td></td></tr><tr><td>场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）</td><td>Carl Zeiss</td><td>SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>氧化石墨烯</td><td>Sigma</td><td>796034</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Sigma</td><td>71320</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜（TEM）</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆琼脂</td><td>BD difco</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>BD difco</td><td>211825</td><td></td></tr></tbody></table>

抗菌型氧化石墨烯/铜纳米复合材料的制备

Fabrication of Antibacterial Graphene Oxide/Copper Nanocomposites

抗生素目前是最常用的杀菌抗菌治疗方法。然而，细菌在持续过度暴露于抗生素的情况下会逐渐产生耐药性。开发&#160;开发能够替代现有抗生素的抗菌剂至关重要，因为耐药性细菌对所有当前抗生素均具有耐药机制，并可能促进医院内感染的发生。为应对这一挑战，本研究提出以氧化石墨烯/铜（GO/Cu）纳米复合材料作为可替代现有抗生素的抗菌材料。采用透射电子显微镜和扫描电子显微镜对GO/Cu纳米复合材料进行表征，结果显示铜（Cu）纳米颗粒在氧化石墨烯片层上良好生长。此外，采用微量稀释肉汤法验证该抗菌物质对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 （耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）以及 铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa），这些细菌常与医院内感染相关。具体而言，99.8% 的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和 84.7% 的 P. aeruginosa 通过500 µg/mL的GO/Cu纳米复合材料可完全消除。金属纳米复合材料可通过释放离子、产生活性氧以及对细菌造成物理损伤来杀灭耐药菌。本研究证实了抗菌性GO/Cu纳米复合材料在清除耐药菌方面的潜力。

通过透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）分析，确认了GO/Cu纳米复合材料的形成。图1A、B显示，非均相的Cu纳米颗粒生长在GO片层上。如图1C所示，EDS元素分布图证实了GO片层上的颗粒为Cu纳米颗粒。
<img alt="纳米颗粒分布分析；显示 Cu、C、O 元素分布的电子显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66762/66762fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：GO/Cu 纳米复合材料的特性。（A）透射电子显微镜图像，（B）扫描电子显微镜图像，以及（C）能量色散X射线光谱图像，证实了 GO/Cu 纳米复合材料的形成。比例尺 = 500 nm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66762/66762fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
从患者伤口中分离出的细菌菌株，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa），对多种抗生素具有耐药性，如表1和表2所示。图2A、B分别展示了GO/Cu纳米复合材料对MRSA和P. aeruginosa的抗菌效果。值得注意的是，随着GO/Cu纳米复合材料浓度的增加，细菌生长受到显著抑制。我们发现，125 µg/mL的合成GO/Cu纳米复合材料已足以对MRSA和P. aeruginosa产生有效的抗菌作用。具体而言，使用500 µg/mL的GO/Cu纳米复合材料处理后，可清除99.8%的MRSA和84.7%的P. aeruginosa。不同的细菌清除率可归因于革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之间独特的生物学结构差异。革兰氏阳性菌（如MRSA）的细胞壁中肽聚糖含量超过90%；而革兰氏阴性菌（如P. aeruginosa）的细胞壁中肽聚糖仅占5%-20%，并具有一层外膜。该外膜通过阻碍抗菌物质的渗透，使革兰氏阴性菌对抗菌剂具有较强的抗性27。然而，GO/Cu纳米复合材料仍可有效杀灭耐药性细菌。
<img alt="GO/Cu 抗微生物检测；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌活性；浓度效应；柱状图，培养皿。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66762/66762fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：GO/Cu 纳米复合材料的抗菌效果。（A）耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和（B）来自临床伤口的Pseudomonas aeruginosa。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示（n = 4）。***p &lt; 0.001；****p &lt; 0.0001。MRSA = 耐甲氧西林Staphylococcus aureus；P = 阳性对照；N = 阴性对照。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66762/66762fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗生素</td>
			<td>MIC (μg/mL)</td>
			<td>解释</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clindamycin</td>
			<td>≤ 0.25</td>
			<td>R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>≥ 8</td>
			<td>R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>≥ 8</td>
			<td>R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>≥ 16</td>
			<td>R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mupirocin</td>
			<td>≥ 512</td>
			<td>R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-G</td>
			<td>≥ 0.5</td>
			<td>R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tigecycline</td>
			<td>≤ 0.12</td>
			<td>S</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：对抗生素的敏感性试验 耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌. 缩写：MIC = 最小抑菌浓度；S = 敏感；R = 耐药。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗生素</td>
			<td>MIC (μg/mL)</td>
			<td>解释</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime</td>
			<td>32</td>
			<td>R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>≤ 0.25</td>
			<td>S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>2</td>
			<td>S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minocycline</td>
			<td>≥ 16</td>
			<td>R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ticarcillin/CA</td>
			<td>32</td>
			<td>I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tigecycline</td>
			<td>≥ 8</td>
			<td>R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim/Sulfa</td>
			<td>80</td>
			<td>R</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：针对P. aeruginosa的抗生素敏感性试验。 缩写：MIC = 最小抑菌浓度；S = 敏感；I = 中介；R = 耐药。

本文介绍了氧化石墨烯/铜（GO/Cu）纳米复合材料作为一种抗菌纳米材料。评估了GO/Cu纳米复合材料对耐药性革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌效果。

抗生素目前是最常用的抗菌治疗方法，用于杀灭细菌。然而，当细菌持续过度暴露于抗生素时，会产生耐药性。

抗生素被广泛用于治疗细菌感染，但过度使用导致细菌产生耐药性。为解决这一问题，我们一直致力于开发具有抗菌性能的金属纳米复合材料，这类材料可使细菌难以产生耐药机制。本实验方案的优势在于，与其他方法相比，该方法制备氧化石墨烯/铜纳米复合材料成本较低且操作简便。这使得该方法适用于大规模生产，非常适合商业应用。此外，我们的方法不需要额外的表面活性剂或封端剂，因此在生物医学应用中具有优势。我们课题组致力于开发用于伤口感染治疗的生物相容性金属纳米复合材料。因此，我们正在研究将这些纳米复合材料涂覆在表面或利用其递送药物，旨在有效根除实际感染场景中的耐药菌及其生物膜。首先，在玻璃瓶中制备10毫升浓度为1毫克/毫升的氧化石墨烯（GO）悬浮液。将GO悬浮液超声处理一小时，直至GO在蒸馏水中充分分散。在玻璃小瓶中配制 20 毫摩尔的氯化铜溶液，并超声处理溶液，直至氯化铜在蒸馏水中充分分散。接着，将 10 毫升 20 毫摩尔的氯化铜溶液加入 GO 悬液中，并在 70 摄氏度下超声处理混合物 1 小时。使用前立即在化学通风橱中配制 20 毫摩尔的硼氢化钠溶液。在磁力搅拌器以 200 rpm 搅拌的条件下，向氧化石墨烯（GO）与氯化铜的混合物中加入 20 毫升溶液。然后将混合物转移至离心管中，在室温下以 23,000 × g 离心 10 分钟。离心后弃去上清液，以洗涤氧化石墨烯/铜纳米复合材料混合物。用10毫升蒸馏水重悬沉淀物，并超声处理溶液以使沉淀均匀分散。接着，在室温下以23,000 × g离心10分钟，去除上清液。然后向纳米复合物中加入1毫升蒸馏水，超声处理混合物，使沉淀物在液相中均匀分散。将超声处理后的混合物转移至另一试管中，在真空条件下于60摄氏度冷冻干燥过夜，直至纳米复合材料完全干燥。将纳米复合材料粉末储存于20摄氏度直至使用。透射电子显微镜和扫描电子显微镜图像证实了氧化石墨烯（GO）片层上异质铜纳米颗粒的生长，能量色散X射线光谱映射进一步验证了这些颗粒为铜纳米颗粒。首先，制备氧化石墨烯-铜纳米复合材料。在第一天，用接种环从琼脂平板上挑取一环细菌单菌落，接种于10毫升液体培养基中。将培养基置于37°C、200 rpm的摇床中孵育24小时。第二天，使用DPBS稀释纳米复合材料混合物，制备三种不同浓度，并准备实验用对照溶液。随后将100微升纳米复合材料悬浮液和对照溶液分别加入96孔板中。根据菌落形成单位（CFU）结果，用胰蛋白胨大豆肉汤将细菌悬浮液稀释至每毫升1 × 10⁶ CFU。取100微升稀释后的细菌悬液接种至96孔板的样品孔中，将该板置于37摄氏度、200 rpm振荡培养箱中培养24小时。第3天时，先用200微升移液器剧烈混匀样品和细菌悬液，再用无菌蒸馏水对样品菌液混合物进行10倍系列稀释。随后，用涂布棒将100微升稀释后的细菌悬液涂布于琼脂平板上，并将平板置于37摄氏度培养24小时。第四天，计数细菌菌落并利用公式计算CFU值，以确认纳米复合材料的抗菌活性。该纳米复合材料在500微克/毫升浓度下对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌表现出显著的抗菌效果，分别杀灭了99.8%和84.7%的细菌。

fabrication-of-antibacterial-graphene-oxidecopper-nanocomposites

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

抗菌氧化石墨烯/铜纳米复合材料的制备

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氧化锌纳米颗粒的制备及其抗菌效果评价

本文介绍了级联设计氧化过程和强碱性还原反应的实验方案，用于将石墨创新性地、可规模化地转化为多层氧化石墨粉末、氧化石墨烯纳米片、超分子还原氧化石墨烯水凝胶以及还原氧化石墨烯纳米材料。...

采用级联设计氧化与强碱性还原反应实现氧化石墨烯和还原氧化石墨烯的可规模化合成

学习制备氧化石墨烯/铜纳米复合材料的方法，用于对抗耐药细菌的抗菌应用。该低成本方案无需额外表面活性剂，适用于大规模生产和生物医学领域。

抗菌型氧化石墨烯/铜纳米复合材料的制备

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