Name: 大鼠颌骨骨髓间充质干细胞的分离和培养技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: 学习从大鼠颌骨骨髓中分离和培养高纯度间充质干细胞的技术。该方法采用基于微环境的方法，可在短时间内获得具有强分化能力的优质细胞，为颌骨组织工程和骨缺损修复提供可靠的细胞来源。

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本研究由军事委员会后勤部医疗卫生项目（19BJZ22）、北京市&#160;自然科学基金（7232154）和第四军医大学临床研究项目（2021XB025）资助。

本实验方案经中国人民解放军总医院机构动物伦理委员会批准。实验使用13周龄雄性Wistar大鼠。有关动物、试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 实验准备
<ol>
	<li>将所有手术器械（包括眼科剪、镊子和咬骨钳）在高温高压下灭菌。</li>
	<li>提前准备培养基。
	<ol>
		<li>准备含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的α-MEM完全培养基。</li>
		<li>在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制0.1% II型胶原酶。</li>
		<li>在一次性无菌50 mL离心管中，用含1%青霉素-链霉素的PBS配制50 mL溶液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大鼠JBMMSCs的分离与培养
<ol>
	<li>按照以下步骤分离大鼠下颌骨： 
	注意：为保持样本无菌，所有金属外科器械在使用前必须在酒精灯火焰上高温消毒至少三秒钟。
	<ol>
		<li>通过腹腔注射 2% 戊巴比妥钠（2 mL/kg）对大鼠进行麻醉。</li>
		<li>待大鼠呼吸频率降低且肌肉完全松弛后，采用颈椎脱位法处死麻醉后的大鼠（遵循机构批准的实验动物操作规程）。</li>
		<li>将大鼠浸入 75% 乙醇中 30 分钟以消毒，然后转移至超净工作台。</li>
		<li>将大鼠置于一次性无菌布巾上或无菌容器中，保持仰卧位。</li>
		<li>沿下颌支从口角至关节处切开并分离皮肤和肌肉，然后使用眼科剪水平剪断颞下颌关节盘及双侧周围韧带，使髁突与关节窝分离。 
		注意：通过移动下颌骨并从外部观察髁突位置，确定颞下颌关节的位置。</li>
		<li>使用剪刀从下门齿颊侧的前庭沟向左右两侧剪开并分离下颌骨外侧的肌肉和结缔组织。</li>
		<li>从舌系带至下颌骨后部切开下颌骨的舌侧肌肉。</li>
		<li>将下颌骨从颅骨上完整取下。</li>
		<li>使用眼科剪在下门齿之间的联合部剪断，将下颌骨分为左右两半。</li>
		<li>使用眼科剪和镊子仔细去除下颌骨上残留附着的肌肉、筋膜及其他软组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离下颌骨骨髓间充质干细胞（JBMMSCs）。
	<ol>
		<li>将咬骨钳的钳尖置于门齿与第一磨牙近中部分的交界处，用咬骨钳切断下门齿与下颌骨的连接，并完全取出下门齿。</li>
		<li>使用骨咬钳去除所有磨牙。</li>
		<li>使用骨咬钳去除下颌支，并沿最后一颗磨牙远侧边缘分离下颌骨中部，暴露骨髓腔16。</li>
		<li>用 1 mL 一次性无菌注射器吸取 α-MEM 完全培养基。将针头插入骨髓腔，反复用 α-MEM 完全培养基冲洗骨髓至培养皿中，直至骨组织变白。</li>
		<li>将骨髓冲洗液收集至 15 mL 离心管中，在室温下以 800 × g 离心 3 分钟。</li>
		<li>用移液器弃去上清液，用 10 mL α-MEM 完全培养基重悬细胞，并接种至新的 10 cm 培养皿中。</li>
		<li>用咬骨钳将冲洗后的下颌骨切成 1–3 mm³ 的骨片，加入 3 mL 0.1% II 型胶原酶，在 37 °C、200 rpm/min 摇床中消化 90 分钟。</li>
		<li>将消化后的下颌骨在室温下以 800 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将收获的细胞与消化后的骨片置于 α-MEM 完全培养基中，在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中进行培养。</li>
		<li>72 小时后更换一半培养基为新鲜培养基，之后每 2 天完全更换一次培养基。 
		注意：前 3 天内不要移动培养皿。</li>
		<li>当贴壁细胞融合度达到 80%–90% 时，按 1:2 比例传代。在第二次传代时去除骨片。实验使用第 2 代（P2）或第 3 代（P3）细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 用于鉴定细胞表面标志物的流式细胞术
<ol>
	<li>将P2代JBMMSCs重悬于流式细胞术缓冲液中。使用自动细胞计数仪对细胞进行计数，并将细胞浓度调整至3 × 106 个/mL。</li>
	<li>向每支微量离心管中加入100 µL细胞悬液和2 µL单克隆抗体（CD11b/c、CD29、CD34、CD44、CD45和CD90）。在4 °C下孵育30分钟17,18。</li>
	<li>用200 µL流式细胞术缓冲液洗涤样品两次，于室温下以250 × g 离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向每支管中加入100 µL流式细胞术缓冲液和2 µL PE标记的荧光二抗。在4 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>重复步骤3.3。</li>
	<li>将JBMMSCs每管用300–500 µL流式细胞术缓冲液重悬。</li>
	<li>使用流式细胞仪进行流式细胞术分析。 
	注意：使用同源抗体作为阴性对照，以消除抗体非特异性结合导致的背景染色。</li>
</ol>
4. 细胞增殖测定
<ol>
	<li>将第3代JBMMSCs以每孔5 × 103个细胞的密度接种至96孔板中。</li>
	<li>向每孔中加入10 µL CCK-8溶液。</li>
	<li>将96孔板放入培养箱中孵育2小时，然后使用酶标仪测定吸光度（450 nm处的OD值）。 
	注意：连续七天每天在同一时间进行检测。</li>
</ol>
5. 克隆形成能力
<ol>
	<li>将第3代的1000个JBMMSC细胞接种至10 cm培养皿中，在37 °C、5% CO2条件下进行培养。</li>
	<li>每3天更换一次培养基。</li>
	<li>连续培养15天后，进行结晶紫染色。</li>
	<li>随后，用甲醇固定细胞5分钟，并用2%结晶紫染色5分钟。</li>
</ol>
6. JBMMSCs 的多系分化
注意：使用第3代 JBMMSCs 进行多向分化。对照组使用 α-MEM 完全培养基进行培养。
<ol>
	<li>进行成骨分化。
	<ol>
		<li>在六孔板中每孔接种 1 × 105 个 JBMMSCs。</li>
		<li>当细胞融合度达到 70% 时，更换为成骨诱导培养基。 
		注意：每 3 天更换一次成骨诱导培养基。</li>
		<li>成骨诱导 7 天后进行碱性磷酸酶（ALP）染色。</li>
		<li>从六孔板中移除培养基，用 4% 多聚甲醛在室温下固定细胞 30 分钟，然后用 PBS 洗涤三次。</li>
		<li>用 ALP 染色液在室温下染色 30 分钟，并避光处理。</li>
		<li>用 PBS 冲洗细胞直至无染色液残留，在显微镜下观察样本。</li>
		<li>成骨诱导 21 天后进行茜素红染色。</li>
		<li>用 4% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟后，加入茜素红染色液染色 5 分钟。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞直至无茜素红染色液残留。</li>
		<li>在显微镜下观察钙结节的数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行成脂分化。
	<ol>
		<li>在六孔板中每孔接种 1 × 105 个 JBMMSCs。</li>
		<li>当细胞融合度达到 70% 时，更换为成脂诱导培养基。 
		注意：每三天更换一次成脂诱导培养基。</li>
		<li>成脂诱导 14 天后进行油红 O 染色。</li>
		<li>从六孔板中移除培养基，用油红 O 固定液固定细胞 20–30 分钟，然后用 PBS 洗涤三次。</li>
		<li>移除固定液，用蒸馏水洗涤细胞两次。</li>
		<li>将细胞浸入 60% 异丙醇中 20–30 秒。</li>
		<li>移除 60% 异丙醇，加入油红 O 染色液染色 20–30 分钟。</li>
		<li>移除染色液，用 60% 异丙醇冲洗 20–30 秒，然后用蒸馏水洗涤。</li>
		<li>用苏木精溶液对细胞核染色 1–2 分钟。</li>
		<li>移除苏木精溶液，用蒸馏水洗涤 2–3 次，加入油红 O 缓冲液 1 分钟后移除。</li>
		<li>在显微镜下观察脂滴的数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行软骨分化。
	<ol>
		<li>在六孔板中每孔接种 1 × 105 个 JBMMSCs。</li>
		<li>当细胞融合度达到 70% 时，更换为软骨诱导培养基。 
		注意：每 3 天更换一次软骨诱导培养基。</li>
		<li>软骨诱导 21 天后进行阿利新蓝染色。</li>
		<li>从六孔板中移除培养基，用 4% 多聚甲醛在室温下固定细胞 30 分钟，然后用 PBS 洗涤三次。</li>
		<li>用阿利新蓝染色液在 37 °C 下染色 1 小时。</li>
		<li>用 PBS 冲洗细胞直至无染色液残留，在显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 实时荧光定量 PCR
<ol>
	<li>使用RNA提取试剂盒提取总RNA，并用酶标仪测定RNA浓度（按照制造商说明书操作）。</li>
	<li>使用500 ng RNA合成cDNA19。</li>
	<li>在实时定量PCR系统上进行qRT-PCR反应，反应体系为10 µL，包含1 µL cDNA、3.5 µL双蒸水、5 µL SYBR和0.5 µL引物混合液（0.1 µM）。 
	注意：引物序列见表1。扩增程序如下：50 °C 2分钟，95 °C 2分钟，随后进行40个循环（95 °C 15秒，60 °C 2分钟），最后从60 °C到95 °C以每步0.5 °C递增、每步5秒进行熔解曲线分析。</li>
	<li>以GAPDH作为内参基因16。</li>
</ol>

Niche-Based Isolation of Rat Jaw Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

骨髓间充质干细胞（BMMSCs）是一类存在于骨髓中的非造血干细胞，具有自我更新能力、多向分化潜能以及支持造血的功能。这些细胞在组织再生、血管生成及细胞活动调控等多种生理过程中发挥关键作用20。因此，BMMSCs 常被用作组织修复与再生工程中的理想种子细胞来源21。
下颌骨骨髓间充质干细胞（JBMMSCs）最初由Matsubara等人于2005年从人下颌骨骨髓抽吸物中分离获得22，其具有独特的分化特性，这归因于下颌骨与其他骨骼部位在起源和发育途径上的差异4,23。鉴于颅面骨独特的发育和病理机制，利用具有同源发育特征的JBMMSCs进行颅面骨缺损修复显得尤为必要23。此外，由于JBMMSCs与口腔微环境具有共同的胚胎组织来源，因而表现出更高的组织相容性24,25。尽管具有上述优势，目前仍缺乏标准化且安全的JBMMSCs分离方案，相关研究也相对有限。
目前，骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的分离与培养尚无统一标准，常用的方法包括免疫磁珠分选、流式细胞术分选、密度梯度离心法以及全骨髓贴壁培养法26。其中，免疫磁珠法和流式细胞术分选法通过识别细胞表面的特异性抗原实现细胞分离。然而，这些方法操作繁琐，需要专用仪器，且尽管可获得高纯度细胞，但可能影响细胞活性27。密度梯度离心法通过离心和分层实现细胞分离，但可能改变细胞微环境，导致细胞生长减缓和衰老增加28。相比之下，全骨髓贴壁培养法利用骨髓中不同类型细胞贴壁能力的差异，通过间歇更换培养基和传代实现BMMSCs的分离与纯化。该方法对细胞损伤小，操作简便16。
与股骨相比，下颌骨体积较小，骨髓腔更窄，且易受到牙齿或牙周韧带中细胞的干扰。骨髓冲洗及贴壁法需要相对较多的骨髓量，适用于大型动物和人类29。采用传统骨髓冲洗法提取的大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞（JBMMSCs）数量稀少、增殖缓慢且质量较差30,31。骨髓中JBMMSCs的含量极低，主要分布于密质骨和骨内膜中。Bu-Kyu Lee 等人32采用下颌骨穿刺抽吸法分离JBMMSCs，结果显示，获取10 mL下颌骨骨髓血所需时间是髂嵴穿刺的五倍，且下颌骨来源间充质干细胞的初始得率仅为髂嵴来源的三分之一。单纯冲洗骨髓无法有效分离密质骨和骨内膜中的细胞。
近年来，研究发现密质骨是骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的一种新的可靠来源，并已衍生出一种相对简单的BMMSC分离方法——骨片消化培养法。33采用该方法分离的BMMSCs具有高纯度34. 郭等人35采用骨片消化培养法成功从小鼠股骨中分离出骨髓间充质干细胞。Yamaza等12 和 Cheng 等人15 采用骨片消化培养法分离小鼠下颌骨骨髓间充质干细胞，并通过细胞增殖、免疫表型及多向分化能力验证其间充质干细胞特性。本实验结合全骨髓冲洗贴壁法与骨片消化法，用于分离和培养原代大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞。骨髓自骨髓腔中被彻底冲洗出，未经滤过处理&#160;以维持骨髓中原始的细胞组成和生长因子。随后，将骨片切割成小块，并使用II型胶原酶消化，以促进细胞从骨碎片中迁移出来。最后，将骨片接种于培养皿中进行培养，使细胞从骨片中爬出。该联合方法使得原代细胞培养体系同时包含造血干细胞、松质骨和皮质骨成分，能够更好地模拟体内骨髓间充质干细胞的微环境，更有利于维持细胞原有的生物学特性。因此，该方法被称为 &#34;基于生态位的干性研究方法&#34;36. Lue 等37 还强调了干细胞微环境在分离骨髓间充质干细胞（BMMSCs）中的重要性，但其研究仅涉及骨髓内的微环境，未包含皮质骨。该方法已成功应用于从小鼠下颌骨中分离骨髓间充质干细胞38.
我们还利用基于微环境的方法成功分离并培养了大鼠JBMMSCs。首先，分离的细胞呈现成纤维细胞样形态，并贴附于塑料培养皿上 体外第二，这些细胞表面标志物CD90、CD29和CD44呈阳性表达，而CD45、CD34和CD11b/c呈阴性表达。第三，这些细胞可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。所获得的细胞形态良好，增殖速度快，并具备分化潜能，符合国际细胞治疗学会提出的人源间充质干细胞鉴定的最低标准。17.
JBMMSCs 的分离方法已被开发并用于分离人体内的细胞。Matsubara 等人22 最早于口腔手术期间从人类牙槽骨骨髓样本中分离出 JBMMSCs。在下颌骨穿刺过程中可能出现一些潜在并发症，包括邻近组织损伤、因口腔细菌污染导致的感染等。Zong 等人39 通过冲洗松质骨标本碎片的骨髓腔来获取人类 JBMMSCs。Park 等人40 采用连续消化法，从种植钻孔过程中获得的人类牙槽骨碎片中分离 JBMMSCs。Mason 等人41 则直接从接受常规牙种植体植入的患者下颌骨骨髓核心组织及穿刺液中分离人类 JBMMSCs。无论是穿刺液还是骨髓核心组织，细胞分离的成功率均较高，而两者联合使用时成功率更高。然而，尽管上述方法已成功分离出人类 JBMMSCs，但不同方法之间的有效性差异仍需进行比较。目前，本文所述方法仅在小鼠和大鼠中应用，尚无研究将其用于人类 JBMMSCs 的分离。该方法存在一定的局限性，尤其是在应用于人类时：第一，结合骨髓冲洗与骨片消化的方法相对复杂，步骤较多；第二，复杂的操作流程对无菌条件提出了更高要求，而无菌性对该实验方案至关重要；第三，无法对人类下颌骨的整个骨髓腔进行冲洗，因此有必要探索一些替代方法，例如冲洗松质骨碎片。
总之，本研究基于骨髓冲洗与骨组织块消化相结合的方法，成功分离并培养了大鼠JBMMSCs。 &#34;干细胞微环境&#34; 细胞鉴定结果证实，该方法能够分离出数量充足且高纯度的下颌骨髓间充质干细胞（JBMMSCs），为颌骨组织工程尤其是骨缺损修复提供了充足的细胞来源，具有重要意义。

间充质干细胞（MSCs）最初在骨髓中被发现，具有在培养中形成贴壁克隆的能力以及强大的成骨潜能1。Pittinger 等人2进一步发现其具有向骨、脂肪和软骨多向分化的潜能。尽管来源于不同组织的间充质干细胞均具备多向分化潜能，但与来自其他组织的间充质干细胞相比，骨髓间充质干细胞具有最强的软骨分化能力，因此被认为是骨组织工程中最理想的候选细胞3。然而，许多研究已证实，不同来源的骨髓间充质干细胞在成骨分化能力及细胞增殖活性等方面表现出部位特异性的特征和性质4,5。这可能是由于颌骨与四肢骨或髂嵴来源于不同的胚层所致6。
下颌骨骨髓间充质干细胞（JBMMSCs）起源于神经外胚层的神经嵴细胞，而股骨来源的BMMSCs则起源于中胚层7。与长骨和髂嵴来源的BMMSCs相比，JBMMSCs具有更高的增殖速率、碱性磷酸酶（ALP）活性以及成骨潜能8。此外，BMMSCs在不同组织和器官中的应用效果可能因细胞类型和微环境的不同而存在差异9。颌骨缺损的修复主要依赖于颌源性间充质干细胞的募集。因此，对JBMMSCs的研究可为其在颌骨组织工程中的临床应用提供实验依据10。然而，目前的基础研究和临床应用主要集中于四肢骨和中轴骨来源的BMMSCs11。关于JBMMSCs的研究仍较为有限，这可能与下颌骨中松质骨含量较低有关，而大鼠颌骨中的松质骨含量更低12。因此，使用常规的骨髓冲洗法——即常用于从四肢骨或髂嵴分离BMMSCs的方法——难以有效分离出颌骨来源的骨髓间充质干细胞13。基于Hong等14和Cheng等15的方法，我们提出假设：结合致密骨组织消化法与骨髓冲洗法可高效分离大鼠JBMMSCs。
本研究旨在建立一种高效分离大鼠JBMMSCs的方法，为颌骨组织工程提供充足的种子细胞来源。

<table><tbody><tr><td>0.2%茜素红S溶液</td><td>Solarbio</td><td>G1450</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96实时荧光定量系统</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCK8试剂盒</td><td>Dujindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿 10 cm</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>离心管 15 mL&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>离心管 50 mL&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Fisher</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>恒温振荡器</td><td>上海智城分析仪器制造有限公司</td><td>ZWY-100H</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD</td><td>FACS C6&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>倒置相差显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX41&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>间充质干细胞（大鼠）表面标志物检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Oricell</td><td>RAXMX-09011</td><td></td></tr><tr><td>多功能酶标仪&amp;nbsp;</td><td>BioTek</td><td>Synergy LX Multi-Mode</td><td></td></tr><tr><td>油红O染色试剂盒</td><td>Solarbio</td><td>G1262</td><td></td></tr><tr><td>4%多聚甲醛</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>MACGENE</td><td>CC008</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 0.25%</td><td>MACGENE</td><td>CC004</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Mix&amp;nbsp;</td><td>Takara</td><td>RR036A</td><td></td></tr><tr><td>大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化试剂盒</td><td>Oricell</td><td>RAXMX-90031</td><td></td></tr><tr><td>大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化试剂盒</td><td>Oricell</td><td>RAXMX-90041</td><td></td></tr><tr><td>大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化试剂盒</td><td>Oricell</td><td>RAXMD-90021</td><td></td></tr><tr><td>RNA提取试剂盒</td><td>TIANGEN</td><td>DP419</td><td></td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>北京亚泰科隆仪器技术有限公司</td><td>KLCZ-1220A</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp; 0.25%</td><td>MACGENE</td><td>CC012</td><td></td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>Solarbio</td><td>C8150</td><td></td></tr><tr><td>Wistar大鼠</td><td>北京亚泰科隆仪器技术有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>C12571500BT</td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞的分离与培养技术

Technique for Isolation and Culture of Rat Jaw Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

骨髓间充质干细胞（BMMSCs）是一类具有多向分化潜能的干细胞。与来源于四肢骨的BMMSCs相比，来源于颌骨的BMMSCs具有更强的增殖能力和成骨分化能力，逐渐成为颌骨缺损修复的重要种子细胞。然而，下颌骨具有复杂的骨结构，且松质骨含量少于四肢骨，采用传统方法难以获取大量高质量的颌骨来源骨髓间充质干细胞。本研究提出一种基于“干细胞微环境”的方法，用于分离和培养大鼠颌骨骨髓间充质干细胞（JBMMSCs）。采用全骨髓贴壁法结合骨片消化法分离培养原代大鼠JBMMSCs，并通过细胞形态学观察、细胞表面标志物检测及多向分化诱导实验对分离细胞进行鉴定。结果表明，该方法获得的细胞呈“成纤维细胞样”梭形，细胞细长、呈梭形且类似成纤维细胞。流式细胞术分析显示，这些细胞表达CD29、CD44和CD90，而不表达CD11b/c、CD34和CD45，符合BMMSCs的表型特征。细胞具有较强的增殖能力，并可向成骨、成脂和成软骨方向分化。本研究提供了一种高效、稳定的方法，可在短时间内获得足量且高质量、具有强分化能力的JBMMSCs，有助于进一步开展其生物学功能、再生医学及相关临床应用的研究。

细胞接种72小时后，大多数细胞呈悬浮状态且形态为圆形，仅有极少数细胞贴壁（图1B）。至第5天，出现贴壁细胞克隆，呈梭形或成纤维细胞样形态（图1C）。至第7天，贴壁细胞达到约90%融合度，形成“鱼群样”排列，其间散在少量间歇性悬浮细胞（图1D）。传代后细胞增殖迅速，每3天传代一次。细胞形态相对均一，主要呈梭形，融合后呈漩涡状排列（图1E-G）。
流式细胞术分析显示，间充质干细胞表面标志物 CD90、CD29 和 CD44 表达水平较高，阳性率分别为 97.2%、97.7% 和 95.7%。相反，造血干细胞表面标志物 CD45、CD34 和 CD11b/c 表达水平较低，阳性率分别为 1.37%、0.66% 和 1.49%（图 2A）。培养 2 周后，JBMMSCs 表现出成克隆能力，结晶紫染色结果可见（图 2B）。体外培养中，细胞具有稳定的扩增能力，细胞生长曲线呈典型的“S 型”（图 2C）。细胞增殖过程包括潜伏期、对数生长期和平台期。接种后两天开始快速生长，六天后生长速度减缓。单个细胞表现出自我复制和增殖的特性。
细胞在第7天表现出蓝紫色的ALP染色颗粒th 天，红色矿化结节在第21天st 天。此外，在进行14天的成脂诱导后，细胞呈现出红色串珠状的脂滴，而成软骨分化诱导则形成了蓝色类软骨组织（图3A此外，在成骨诱导7天后，JBMMSCs中ALP、OCN和Runx2的mRNA表达水平升高15 (图3B).
<img alt="大鼠下颌骨骨髓分离与消化示意图；显微镜图像展示细胞培养过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66765/66765fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1JBMMSCs的分离与培养 (A) 实验方案概述。B-D) 分别为细胞在原代培养中培养3天、5天和7天后的图像。 (E-GP1、P2 和 P3 细胞的图像。比例尺： 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66765/66765fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术标记物 CD11b/c、CD90、CD45、CD29、CD34、CD44；细胞培养显微镜图像；OD生长曲线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66765/66765fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：JBMMSCs的鉴定。（A）大鼠JBMMSCs的流式细胞术分析结果。流式细胞术分析显示，这些细胞表达CD29、CD44和CD90，符合BMMSCs的特征；相反，它们不表达CD11b/c、CD34和CD45。（B）经结晶紫染色的JBMMSCs集落代表性图像（比例尺：100 µm）。（C）细胞生长曲线显示了细胞增殖速率。数据和误差条表示均值±标准差，n = 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66765/66765fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="成骨诱导实验；染色细胞显微镜观察，ALP、OCN、Runx2 表达的柱状图分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66765/66765fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3JBMMSCs的多向分化（成骨、成脂和成软骨分化） (A经过7天成骨诱导后，碱性磷酸酶（ALP）活性增强。成骨诱导21天后，茜素红染色显示大量矿化结节呈红色。油红O染色可见大量脂滴。软骨诱导后，阿利新蓝染色突出显示了向软骨细胞分化的细胞。B) JBMMSCs 经成骨诱导 7 天后成骨相关基因 ALP、OCN 和 Runx2 的 mRNA 表达水平。（***P &lt; 0.001, 与对照组）。数据和误差线表示均值 ± 标准差，n = 3。比例尺： 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66765/66765fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>基因</td>
			<td>引物序列 (5'-3')</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">GADPH</td>
			<td>F:  ACCCAGAAGACTGTGGATGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R:  CACATTGGGGGTAGGAACAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">ALP</td>
			<td>F: CACGTTGACTGTGGTTACTGCTGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R: CCTTGTAACCAGGCCCGTTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">OCN</td>
			<td>F: GGTGGTGAATAGACTCCGGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R: GCAACACATGCCCTAAACGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Runx2</td>
			<td>F: GCACCCAGCCCATAATAGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R: TTGGAGCAAGGAGAACCC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：实时PCR中使用的引物。

下颌骨骨髓来源的间充质干细胞在多种分化、自我更新及免疫调节方面具有重要功能。它们已成为基因治疗、组织工程和再生医学中前体细胞的关键来源。本文介绍一种从大鼠下颌骨骨髓中分离间充质干细胞的独特方法。

骨髓间充质干细胞（BMMSCs）是一类具有多向分化潜能的干细胞。与来源于……的BMMSCs相比，……

本研究提供了一种高效且稳定的方法，可在短时间内获取足量高质量、具有强分化能力的下颌骨骨髓间充质干细胞。基于微环境的方法可用于大鼠骨髓间充质干细胞的分离。本研究成功分离出高纯度的下颌骨骨髓间充质干细胞，为下颌骨组织工程，特别是骨缺损修复领域，提供了充足的细胞来源。这些进展对该领域具有重要意义。首先，从已实施安乐死的大鼠体内取出下颌骨。将持骨钳的钳喙置于大鼠下颌骨门齿与第一磨牙交界处。切断下门齿与下颌骨的连接，然后完全拔除下门齿。移除所有磨牙，随后去除下颌支。沿最后一颗磨牙的远端边缘分离下颌骨的中央部分，并暴露骨髓腔。接着，用1毫升一次性注射器吸取含完全培养基的α-MEM。将针头插入骨髓腔中，反复用含完全培养基的α-MEM冲洗骨髓至培养皿中，直至骨骼变白。将冲洗出的溶液转移至15毫升离心管中。在室温下以800 G离心3分钟。离心结束后，用移液器吸去上清液，然后向管中加入10毫升α-MEM完全培养基。将沉淀物重悬于培养基中，并将悬液转移至新的直径10厘米的培养皿中。现在使用骨剪将冲洗后的下颌骨切成骨片。将骨片转移至含有3毫升0.1% II型胶原酶溶液的离心管中。将骨片混合物置于摇床中，在37摄氏度、200转/分钟条件下振荡90分钟。孵育完成后，在室温下以800 ×g离心3分钟，收集消化后的下颌骨。用移液器吸出上清液并弃去，然后将收获的细胞和消化后的骨片转移至含有10毫升α-MEM完全培养基的孔板中。将培养物置于加湿的培养箱中，37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。72小时后，更换一半培养基为新鲜培养基。当贴壁细胞融合度达到80%至90%时，按1:2的比例传代。在第二次传代时移除骨片。培养72小时后，大多数细胞呈悬浮圆形，仅有少数贴壁。培养五天后出现 spindle 形或成纤维细胞样的贴壁克隆。贴壁细胞在第7天达到90%融合度，并形成鱼群样形态。传代后的细胞表现出均一性，主要呈梭形，融合后呈漩涡状排列。

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从大鼠肺组织中分离CD146+ 驻留型肺间充质基质细胞

破骨细胞是来源于造血干细胞单核-巨噬细胞系的组织特异性多核巨噬细胞。本方案描述了如何分离骨髓细胞，以获得大量破骨细胞，同时降低传统方法中存在的事故风险。...

从大鼠骨髓中分离、纯化及诱导破骨细胞前体细胞分化

本文介绍了一种结合全骨髓贴壁法与流式细胞术分选的方法，用于分离、培养、分选和鉴定大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞。...

大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞的分离与培养

本文介绍了一种从SD大鼠分离BMMs的方案，称为二次贴壁法。<br...

通过二次贴壁法从大鼠骨骼中分离单核-巨噬细胞系细胞

本研究概述了两种从大鼠骨髓中分离大量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的技术。一种方法结合使用商业化的中性粒细胞分离试剂盒与密度梯度离心法，另一种方法仅采用密度梯度离心法。这两种方法获得的功能性NETs均优于外周血中性粒细胞来源的NETs。...

分离大鼠骨髓中性粒细胞的独到方法及其功能可比性

所述方法通过使用以下任一方式分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs） 牙髓组织的酶解离（DPSC-ED） 或 牙髓组织外植体中干细胞的直接迁出（DPSC-OG）。随后 体外...

利用两种不同方法分离、鉴定及比较源自恒牙的人牙髓干细胞的分化特性

本文介绍了如何将新鲜获取的黑色素瘤组织制备成原代细胞培养物，以及如何去除肿瘤细胞中红细胞和成纤维细胞的污染。最后，我们描述了如何利用磁性激活细胞分选技术（MACS）从CD133-主体细胞中分选出CD133+的黑色素瘤干细胞样细胞。...

患者来源的细胞培养及从黑色素瘤中分离CD133+潜在肿瘤干细胞

受体酪氨酸激酶在多种癌症中异位表达，并已被确定为急性白血病治疗的靶点。本文描述了一种用于评估酪氨酸激酶抑制剂治疗急性白血病的高效临床前策略。...

急性白血病治疗中酪氨酸激酶抑制剂的临床前评价

学习从大鼠颌骨骨髓中分离和培养高纯度间充质干细胞的技术。该方法采用基于微环境的方法，可在短时间内获得具有强分化能力的优质细胞，为颌骨组织工程和骨缺损修复提供可靠的细胞来源。

大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞的分离与培养技术

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