Name: 解离人和小鼠肿瘤组织样品用于单细胞 RNA 测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学习快速解离人和小鼠肿瘤组织样品用于单细胞RNA测序的方法。该技术有助于研究肿瘤免疫反应机制，识别治疗反应的预测因子，并克服免疫治疗耐药性，为肿瘤微环境分析提供重要工具。

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本研究由阿德尔森医学研究基金会（AMRF）、黑色素瘤研究联盟（MRA）和 U54CA224068 资助。图 1、图 4 和 图 5 使用 BioRender.com 制作。

本研究遵守所有关于人体组织取样的机构指南。已从患者处获得知情同意，且可识别的样本数据均已匿名化处理。样本在手术室采集后，置于RPMI、生理盐水或PBS溶液中，并经病理科确认为癌组织后方可用于研究。除特别说明外，所有步骤均应在4 °C或冰上进行。处理人体组织时应在生物安全柜内操作。有关本方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。
1. 获取样本
<ol>
	<li>将实体瘤样本放入含有培养基的离心管中，并置于冰上。
	<ol>
		<li>指示手术室工作人员将样本置于含有足够RPMI、生理盐水或PBS的离心管中，液面需完全浸没组织，以避免样本脱水。 
		注意：确保样本不发生干燥非常重要，因为脱水会降低细胞活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有离心机预冷至4 ˚C，并将温控混匀仪升至37 ˚C。</li>
	<li>取出预先配制的人源或鼠源肿瘤解离酶（材料表），在37 ˚C温控混匀仪上解冻，解冻后立即置于冰上。</li>
	<li>取20 mL RPMI培养基。</li>
	<li>记录相关样本信息（例如，患者编号、去标识化编号、样本类型）。</li>
	<li>将样本转移至60 mm细胞培养皿中（培养皿预先置于冰上），通过反复倒置离心管并将内容物倒入培养皿，确保所有样本材料均被转移。若样本送达时未浸泡在培养基中，则向培养皿中加入新鲜RPMI培养基。
	<ol>
		<li>若样本已破碎，将含有样本的离心管在450 × g、4 ˚C条件下离心5分钟，弃去上清液，用420 µL RPMI重悬样本，然后进入第2节操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 机械和酶解消化
<ol>
	<li>从60 mm样品培养皿中吸取420 µL培养基至1.5 mL微量离心管中，尽量包含悬浮在培养基中的任何样品碎片。</li>
	<li>使用镊子将60 mm培养皿中的样品组织转移至含有培养基的1.5 mL离心管中。用干净的剪刀在管内将样品剪碎，使组织块直径最大为2–3 mm。</li>
	<li>根据制造商说明（材料表）向样品中加入消化酶，体积如下：人源样品加入42 µL酶H（非特异性蛋白酶），小鼠样品加入酶D（非特异性蛋白酶），21 µL酶R（非特异性蛋白酶）以及5 µL酶A（核酸酶）。</li>
	<li>从培养皿中再加入420 µL培养基，或加至管上1 mL刻度线处。培养基总体积不得超过420 µL。</li>
	<li>涡旋振荡管子5秒，然后将其垂直侧置于恒温混匀仪中（图1B）。在37 ˚C、450 rpm条件下孵育15分钟。 
	注意：孵育期间，取出生成GEM所需的全部10x Genomics材料，因其需30分钟恢复至室温。</li>
</ol>
3. 样本过滤
<ol>
	<li>将一个50 µm细胞滤网置于新的15 mL锥形管上方，并通过向管内加入1 mL新鲜RPMI培养基预润滤网。</li>
	<li>消化完成后，使用1,000 µL低吸附宽口移液吸头将样品转移至15 mL离心管中。用1 mL新鲜培养基冲洗1.5 mL离心管，并将冲洗液转移至滤网上，以确保所有样品均通过滤网。</li>
	<li>取一个1 mL塑料注射器，仅取出活塞（其余部分丢弃）。使用注射器活塞的尾部，在滤网上以旋转方式研磨并推动样品。</li>
	<li>用5 mL培养基以及来自盛放样品的培养皿（第1节）中的剩余液体冲洗滤网，以收集可能从组织脱落的细胞。</li>
	<li>将一个30 µm细胞滤网置于新的15 mL锥形管上方，用1 mL培养基预润滤网，然后将含有解离样品的管中内容物通过该滤网转移。 
	注意：此步骤可去除较大碎片，防止在使用10x Genomics微流控芯片时发生堵塞或润湿失败。</li>
</ol>
4. 红细胞裂解
<ol>
	<li>将样品在 450 × g 离心 &#215; g, 4 &#730;4 ℃离心5分钟。吸除上清液，注意不要扰动沉淀。</li>
	<li>用ACK裂解缓冲液重悬以去除红细胞（RBCs），并记录所用体积。体积取决于沉淀物的大小及沉淀中红细胞的含量。 
	注意：当加入足量ACK裂解缓冲液后，重悬的ACK-样本溶液应呈无色，因为这会清除样本中的红细胞。</li>
	<li>将样品管在450 × g下离心 &#215; g, 4 &#730;4°C 下离心 5 分钟，吸除上清液。</li>
	<li>根据需要重复步骤 4.2–4.3，直至离心后样品沉淀物无可见红色图2记录此步骤中使用的额外体积的ACK裂解缓冲液。</li>
	<li>将样本沉淀重悬于新鲜培养基中，以备计数。</li>
</ol>
5. 细胞计数
<ol>
	<li>放置 10 &#181;L 台盼蓝加入 1.5 mL 离心管中。轻轻混匀解离后的细胞，取 10 &#181;L 样本，与台盼蓝按 1:1 混合，加入 10 &#181;在血细胞计数板两侧各加一滴样本，计数细胞。</li>
	<li>记录细胞浓度、活细胞总数、存活率百分比及计数后的最终培养基体积。</li>
	<li>确保细胞计数在 700 至 1,200 个细胞/&#181;L (7 &#215; 105- 1.2 &#215; 106/mL，以获得最佳的 10x Genomics 运行效果。
	<ol>
		<li>如果样本浓度过高，用培养基稀释后重新计数。</li>
		<li>如果样本过于稀释，以 450 × g 离心样本 &#215; g, 4 &#730;4℃离心5分钟，用较少体积的培养基重悬。</li>
		<li>如果细胞活力低于80%，则进行活死细胞分离步骤以去除死细胞。</li>
		<li>如果细胞数量少于一百万，请参见第6节。</li>
		<li>如果细胞数量超过一百万个且存活率&#160;&#62; 10%，参见第6节</li>
		<li>如果细胞数量超过一百万个且存活率 &#60; 10%，参见第7节</li>
		<li>若细胞活力高于80%，将处理后的细胞置于冰上，并立即按照制造商说明书进行GEM生成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 去除死细胞 - 试剂盒 1
注意：使用死细胞去除试剂时，应在生物安全柜内操作，因为这些试剂容易受到污染。
<ol>
	<li>在 450 × g、4 ˚C 条件下离心样品 5 分钟。</li>
	<li>在 15 mL 圆锥形离心管中配制分离培养基，并置于室温：9.8 mL PBS、10 µL CaCl2 和 200 µL 热灭活 FCS（在生物安全柜中添加）。</li>
	<li>离心后，吸除沉淀物中的上清液，并将沉淀重悬于 1 mL 分离培养基中。</li>
	<li>再次在 450 × g、4 ˚C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 100 µL 分离培养基中。</li>
	<li>将 100 µL 含分离培养基的样品转移至 0.2 mL PCR 条形管的一个孔中。</li>
	<li>在生物安全柜中，向含有 100 µL 样品（溶于分离培养基）的孔中加入 10 µL Annexin V 混合液和 10 µL 生物素筛选混合液。用移液器吹打混匀，室温孵育 4 分钟。</li>
	<li>孵育 4 分钟后，涡旋振荡葡聚糖包被磁性颗粒 30 秒。向样品中加入 20 µL 磁珠和 60 µL 分离培养基（总体积为 200 µL）。若细胞活力低于 40%，可将磁珠用量按比例增加至 40 µL，同时相应调整分离培养基体积（最多增加 40 µL），保持总体积为 200 µL。用移液器吹打混匀，室温静置 3 分钟。</li>
	<li>将条形管置于 10x Genomics 磁力分离器（高设置）上，室温放置 5 分钟。</li>
	<li>将液体从条形管转移至新的 1.5 mL 低吸附微量离心管中，注意不要扰动磁珠。条形管仍保留在磁铁上。</li>
	<li>将含有样品的 1.5 mL 离心管在 450 × g、4 ˚C 条件下离心 5 分钟。吸除上清液，根据沉淀大小用适量 RPMI 培养基重悬细胞，并按第 5 节所述进行细胞计数。若细胞活力仍低于 80%，请重复去死细胞步骤（图 3 和 图 4）。 
	注意：后续 GEM 生成步骤中不得使用分离培养基重悬细胞，因为氯化钙会干扰包封过程和逆转录（RT）步骤。</li>
	<li>若细胞活力高于 80%，将处理后的细胞置于冰上，并立即按照制造商说明书进行 GEM 生成。</li>
</ol>
7. 去除死细胞 - 试剂盒2
注意：使用试剂盒试剂时，应在生物安全柜内操作。
<ol>
	<li>将磁珠和20倍结合缓冲液储存液放入生物安全柜中。</li>
	<li>将样品悬液在450 × g下离心 &#215; g, 4 &#730;5 分钟，4°C</li>
	<li>在无菌条件下，取1 mL 20x结合缓冲液原液，加入19 mL无DNA酶、无RNA酶的去离子水中，配制1x缓冲液溶液。</li>
	<li>离心完成后，吸除上清液，加入微珠，轻轻混匀样品，并在室温下孵育15分钟。
	<ol>
		<li>当细胞计数为10时7 或更少，加入100 &#181;微珠的升数。</li>
		<li>对于高于 10 的计数7 总细胞数，调整微珠至终浓度为 100 &#181;L 每 107 活细胞</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育期间，取一个MACS阳性选择柱、MACS多支柱架及相应的磁力分离器。确保分离器在多支柱架上放置水平，且支架周围无其他金属或磁性物体，因为磁力较强，可能影响死细胞去除效率。将分离柱牢固地插入分离器支架中，柱体带翼部分朝外。</li>
	<li>孵育样本后，如果总重悬体积小于500 &#181;L，加入1×结合缓冲液直至总体积为500 &#181;L.</li>
	<li>在柱下方放置一个15 mL圆锥形离心管，并用3 mL 1×结合缓冲液预处理柱子。</li>
	<li>将锥形管更换为新的15 mL锥形管用于细胞样品收集，并将样品加入柱中，使其完全流过柱子。</li>
	<li>用1×结合缓冲液洗涤柱子4次，每次3 mL，每次需待前一次洗涤液完全流经柱子后，再加入下一次洗涤。</li>
	<li>第四次洗涤后，将含有分离细胞的锥形管在450 × g下离心5分钟 &#215; g, 4 &#730;C. 弃去柱子和剩余的1×结合缓冲液。</li>
	<li>根据沉淀物大小，用适量的RPMI培养基重悬样本溶液，并按照第5节所述方法计数分离的细胞图3 以及 图5).
	<ol>
		<li>若细胞活性仍低于80%，且细胞总数为106 或更少时，重复第6节。</li>
		<li>若细胞活力高于80%，将处理后的细胞置于冰上，并立即按照制造商说明书进行GEM生成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Tumor Dissociation Protocol for Single-Cell RNA Sequencing Analysis

<ol><li>Liu, C., Yang, M., Zhang, D., Chen, M., Zhu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+cancer+immunotherapy%3A+Current+progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clinical cancer immunotherapy: Current progress and prospects.</a> Front Immunol. 13, 961805(2022).</li>
<li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Commun Signal. 18 (1), 59(2020).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+in+cancer%3A+Applications%2C+advances%2C+and+emerging+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing in cancer: Applications, advances, and emerging challenges.</a> Mol Ther Oncolytics. 21, 183-206 (2021).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+single-cell+RNA+sequencing+and+its+applications+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Advances in single-cell RNA sequencing and its applications in cancer research.</a> J Hematol Oncol. 16 (1), 98(2023).</li>
<li>Ottaiano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+chaos+to+opportunity%3A+decoding+cancer+heterogeneity+for+enhanced+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">From chaos to opportunity: decoding cancer heterogeneity for enhanced treatment strategies.</a> Biology. 12 (9), 1183(2023).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Erfanian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+applications+in+single-cell+genomics+and+transcriptomics+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Deep learning applications in single-cell genomics and transcriptomics data analysis.</a> Biomed Pharmacother. 165, 115077(2023).</li>
<li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications%3A+A+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).</li>
<li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+RNA+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Sade-Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+T+cell+states+associated+with+response+to+checkpoint+immunotherapy+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma.</a> Cell. 176 (1-2), 404(2019).</li>
<li>Pelka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+organized+multicellular+immune+hubs+in+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer.</a> Cell. 184 (18), 4734-4752 (2021).</li>
<li>Bill, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL9%3ASPP1+macrophage+polarity+identifies+a+network+of+cellular+programs+that+control+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers.</a> Science. 381 (6657), 515-524 (2023).</li>
<li>Al'Khafaji, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+RNA+isoform+sequencing+using+programmed+cDNA+concatenation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation.</a> Nat Biotechnol. 42 (4), 582-586 (2024).</li>
<li>Xing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cell+isolation+methods+on+the+human+transcriptome+profiling+and+microbial+transcripts+of+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">The effect of cell isolation methods on the human transcriptome profiling and microbial transcripts of peripheral blood.</a> Mol Biol Rep. 48 (4), 3059-3068 (2021).</li>
<li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Curr Opin Hematol. 28 (3), 221-229 (2021).</li>
<li>Fan, X. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cold+ischemic+time+and+freeze-thaw+cycles+on+RNA%2C+DNA+and+protein+quality+in+colorectal+cancer+tissues+biobanking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Impact of cold ischemic time and freeze-thaw cycles on RNA, DNA and protein quality in colorectal cancer tissues biobanking.</a> J Cancer. 10 (20), 4978-4988 (2019).</li>
<li>LoCoco, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+approaches+to+extract+high-integrity+RNA+from+skin+and+other+pertinent+tissues+used+in+pain+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Rep%22%5BJournal%5D)">Reliable approaches to extract high-integrity RNA from skin and other pertinent tissues used in pain research.</a> Pain Rep. 5 (2), e818(2020).</li>
<li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701(2022).</li>
<li>Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+tissue+dissection+to+isolate+viable+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells.</a> J Vis Exp. (195), (2023).</li>
<li>Janssen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+background+noise+and+its+removal+on+the+analysis+of+single-cell+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The effect of background noise and its removal on the analysis of single-cell expression data.</a> Genome Biol. 24 (1), 140(2023).</li>
<li>Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychrophilic+proteases+dramatically+reduce+single+cell+RNA-seq+artifacts%3A+A+molecular+atlas+of+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Psychrophilic proteases dramatically reduce single cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development.</a> Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).</li>
<li>Sutermaster, B. A., Darling, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+high-yield%2C+high-throughput+cell+enrichment%3A+fluorescence+versus+magnetic+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting.</a> Sci Rep. 9 (1), 227(2019).</li>
</ol>

M.S-F. 获得了百时美施贵宝和Istari Oncology的资助，并担任Galvazine Therapeutics的顾问。

本方案描述了使用10x Genomics微流控系统将人或小鼠肿瘤样本解离为单细胞悬液以进行单细胞RNA测序的步骤。在处理常来源于罕见癌症的组织样本，或涉及小鼠肿瘤的临床试验及长期实验样本时，必须在各步骤之间对样本进行最佳且谨慎的保存。所有操作步骤均应迅速在冰上或4 ˚C条件下进行，以维持细胞内源性RNA的原始状态并防止其降解，因为在室温下长时间操作将影响转录组质量17,18。
为确保整个操作过程中细胞损失最小化，应采取多个步骤，尤其是在处理细针穿刺活检样本时尤为关键17。确保肿瘤样本的所有碎片均被纳入消化过程，将获得最理想的结果，因为从样本中提取的细胞越多，后续10x Genomics的微滴包裹与测序效果越好，最终回收用于分析的细胞数量和转录本总数也越多。若样本卡在送达时所用的管壁中，可加入培养基，将管子颠倒混匀，再转移至培养皿中进行处理。若初始样本已发生破碎或溶液浑浊，提示已有细胞悬浮于液体中，则应将样本连同送达时的液体一同离心，以确保所有样本均被收集，随后重悬于适当体积的培养基中进行酶消化（方案第1节）。
吸取时，确保在整个操作过程中不扰动沉淀。吸取时应留下额外体积，可用P200移液器进一步去除。若沉淀被扰动，可将液体重新排入离心管并再次离心。在ACK裂解或活死细胞去除后，样品体积可能低至25 µL。因此，至关重要的是不要丢失任何含有细胞的上清液。充分的机械消化对于确保目标细胞充分接触酶消化至关重要。对于较大的样品，可能需要使用适当的酶和温控混匀仪进行更长时间的酶消化9,19,20。尽管具体的酶名称属于商业机密，但生产商指出酶A为核酸酶，酶H、D和R为非特异性蛋白酶。尽可能将肿瘤样品全部通过滤膜，这对于获得最高的细胞得率至关重要。成功的过滤应使滤膜上无可见残留物或仅有极少量残留。若样品中含有大量脂肪或结缔组织，则部分组织可能无法通过滤膜。若滤膜表面仍有可见样品碎片，应继续使用注射器活塞尾部以旋转方式研磨并推挤样品通过滤膜，同时用更多培养基冲洗滤膜表面。
红细胞裂解步骤是否成功，可通过将样本加载到血细胞计数板上进行计数和活力检测后，在显微镜下观察样本来判断15,21。若向样本中加入了足量的ACK缓冲液以清除红细胞，则沉淀中应无红细胞或可见的红色。若在样本中仍可见红细胞，应添加更多ACK缓冲液，并将样本在450 × g、4 ˚C条件下重新离心5分钟。操作完成后，应吸除上清液，细胞沉淀可用RPMI培养基重悬，以便观察和计数。
为确保 10x Genomics 实验的最佳效果，细胞浓度应控制在 700 至 1,200 个细胞/µL（7 × 105–1.2 × 106/mL）之间。过高的浓度会在液滴生成过程中增加双细胞率（即一个液滴中包含两个细胞）。若细胞浓度过高，可向样本中加入适量培养基稀释，并重新在血细胞计数板上计数。若浓度过低，可将样本在 450 × g、4 ˚C 条件下离心 5 分钟，吸除上清液后用较小体积的培养基重悬，再重新计数。当活细胞比例高于 80% 时，样本即可用于 10x Genomics 上机（图 3）。
如果样品的活率低于80%，则在进行10x Genomics上样前需要进行活死细胞分离操作16。如果一轮活死细胞去除后活率仍未达到80%以上，且总细胞数超过1 × 105，则应再进行一轮处理。较高的细胞活率可防止后续10x Genomics流程中发生堵塞，提高细胞回收率，并减少环境RNA（ambient RNA）的干扰。试剂盒1的方案已针对细胞数较少的小型组织样本进行了优化和微型化，通过减少试剂体积和缩短孵育时间，提高了细胞得率，并避免了多种细胞中出现应激反应基因表达特征（如FOS, JUN和JUNB）9,22。其他富集活细胞的方法包括染色与分选，但这些方法可能导致细胞得率降低、染色孵育时间延长（可能影响细胞状态，例如aCD3e抗体会激活T细胞），以及分选过程中仪器压力对细胞造成的应激9,22。图6所示示例展示了一个在完成10x Genomics基因表达（GEX）测序后生成的UMAP图，以及将获得的细胞条形码转换为FASTQ文件后进行拼接并使用CellRanger比对的结果。后续的测序结果与活死细胞去除前后的比较分析显示了样品中细胞群在处理前后的变化，以及测序质量的提升。图6中的肺组织样本显示读段占比存在问题，因其低于70%。该警告是由于裂解或死亡细胞群体中存在较高水平的环境RNA所致。然而，在去除死细胞后，该问题不再出现，并导致细胞内读段占比显著提高23。
单细胞RNA测序是一种成本高昂且操作复杂的流程，已极大地推动了肿瘤免疫学和癌症研究领域的发展。该技术能够进一步探究特定细胞类型中表达或受抑制的基因、细胞状态及分子程序，从而揭示更多关于肿瘤行为及其异质性的信息。组织样本质量欠佳或细胞活力较低时，更易产生低质量数据，进而导致出现偏离肿瘤生物学真实情况的人工假象，因此，规范的肿瘤组织解离和样本制备显得尤为关键。

尽管癌症研究领域的诸多进展已推动了靶向免疫细胞和肿瘤细胞上表达的抑制性受体（即检查点阻断抑制剂）的药物开发并获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，但治疗耐药性以及识别驱动患者应答的机制仍是当前面临的挑战1。由于肿瘤在分子多样性方面的异质性，以及肿瘤细胞与免疫微环境之间存在复杂的相互作用，要在单细胞分辨率下解析这一复杂生态系统，亟需新的研究方法。深入理解肿瘤内部及其微环境中的分子复杂性，对于推进治疗策略和揭示癌症进展背后的复杂生物学机制至关重要2。单细胞RNA测序（scRNA-seq）因其能够对复杂肿瘤样本中的单个细胞进行高分辨率分析，近年来应用日益广泛3,4。
肿瘤异质性包含遗传、表观遗传和表型多样性，这为揭示癌症生物学的复杂性带来了挑战5。传统的批量RNA测序方法往往会掩盖肿瘤内异质性细胞群体的独特表达谱和表型，因为这些方法对整个细胞群体的信号进行平均处理4。相比之下，单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够解析不同类型的单个细胞，揭示出以往被忽视的多样基因表达、抑制模式及细胞状态4,6。scRNA-seq的核心在于其解码单个细胞遗传和分子特征的能力，在发现新型癌症治疗策略方面具有巨大潜力7。
通过解析肿瘤细胞及其周围基质细胞和免疫细胞的基因表达谱，研究人员能够发现新的治疗靶点，并开发出针对个体患者的精准基因治疗策略6。此外，剖析肿瘤微环境中的免疫组库可为肿瘤细胞与免疫效应细胞之间的相互作用提供关键见解，从而为免疫治疗干预铺平道路3。尽管单细胞RNA测序（scRNAseq）在临床样本中的应用已取得进展，但在样本处理过程中仍存在若干挑战，可能损害细胞RNA的完整性、细胞活力以及所生成数据的质量。此外，处理细胞活力较低的组织可能会增加单个细胞包封过程中产生的液滴中的游离RNA水平，导致交叉污染和细胞类型错误注释；而在37 °C下进行长时间的组织解离操作则可能导致多种细胞类型中应激反应基因特征的上调8,9,10。
本方案中所述的逐步操作流程（图1A）首先对肿瘤组织进行快速的机械和酶解离解，随后进行过滤并根据每例肿瘤样本的细胞活力决定是否去除死细胞。目前，该流程已在黑色素瘤11、结直肠癌12、头颈部鳞状细胞癌13以及胰腺癌和肺癌（未发表数据）的肿瘤样本中得到验证。这些技术可确保获得高质量的活细胞悬液，对后续分析至关重要14。值得注意的是，由于红细胞不含合成的RNA，因此去除红细胞对于样本纯化至关重要15。随后进行的细胞计数评估及死细胞清除，是成功生成10x Genomics乳滴中凝胶珠（GEM）、实现有效条形码标记的前提，同时有助于提高转录本和测序细胞的回收率，且不会影响对敏感细胞群体（如中性粒细胞和上皮细胞）的保留16。这些步骤是实现肿瘤样本单细胞分辨率分析潜力的基础9,10，有助于揭示新的基因表达谱和免疫特征，推动创新性治疗策略的发展，并发现肿瘤新的脆弱环节。

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 刻度移液管</td><td>Corning</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L 低吸附移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>30389213</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L 低吸附宽口移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>30389218</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L 移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>30389212</td><td></td></tr><tr><td>10x 磁力分离器</td><td>10x Genomics</td><td>120250</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 吸液移液管</td><td>Corning</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;L 低吸附移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>30389226</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;L 移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>30389225</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 低吸附移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>30389240</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>30389239</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 聚丙烯圆锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm 组织培养皿</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液</td><td>Gibco</td><td>A10492-1</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 mL 注射器</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>3090659</td><td></td></tr><tr><td>亮线血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>551660</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2115-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger&amp;nbsp;</td><td>10x Genomics</td><td>N/A</td><td>https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest</td></tr><tr><td>TC20 细胞计数仪专用细胞计数载片</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics 30&amp;mu;m 无菌一次性滤膜</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics 50&amp;mu;m 无菌一次性滤膜</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>死细胞去除试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存；试剂盒 2</td></tr><tr><td>精细解剖镊</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 微量离心管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>EasySepTM 死细胞去除&lt;br/&gt;（Annexin V）试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17899</td><td>于 4 &amp;deg;C 保存；试剂盒 1</td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>5406000640</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机 5910R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000657</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Easypet 3 电子移液控制器</td><td>Eppendorf</td><td>EP4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer F1.5 型号 5384</td><td>Eppendorf</td><td>EP5384000012</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>于 4 &amp;deg;C 保存，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>德国不锈钢剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-12</td><td></td></tr><tr><td>Leica Dmi1 显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>454793</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS 多功能支架</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS 移液器 L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS 磁铁</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-051</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（1x）</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td>于 4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>TempAssure 0.2 mL PCR 8 管联排管</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>肿瘤解离试剂盒（人源）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存，按试剂盒说明配制酶液：&lt;br/&gt; 将冻干的酶 H 小瓶用 3 mL RPMI 1640 重悬&lt;br/&gt; 将冻干的酶 R 小瓶用 2.7 mL RPMI 1640 重悬&lt;br/&gt; 将冻干的酶 A 小瓶用试剂盒提供的 1 mL Buffer A 重悬</td></tr><tr><td>肿瘤解离试剂盒（小鼠源）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-730</td><td>于 -20 &amp;deg;C 保存，按试剂盒说明配制酶液：&lt;br/&gt; 将冻干的酶 D 小瓶用 3 mL RPMI 1640 重悬&lt;br/&gt; 将冻干的酶 R 小瓶用 2.7 mL RPMI 1640 重悬&lt;br/&gt; 将冻干的酶 A 小瓶用试剂盒提供的 1 mL Buffer A 重悬</td></tr><tr><td>UltraPure 去离子水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>于 4 &amp;deg;C 保存</td></tr></tbody></table>

人和小鼠肿瘤组织样本的解离用于单细胞rna测序

Dissociation of Human and Mouse Tumor Tissue Samples for Single-cell RNA Sequencing

人类肿瘤样本蕴含了大量关于其微环境和免疫组库的信息。将人类组织样本有效解离为具有活性的单细胞悬液，是进行单细胞RNA测序（scRNAseq）流程所必需的前期步骤。与传统的批量RNA测序方法不同，scRNAseq能够使我们在单细胞水平上推断肿瘤样本中的转录异质性。近年来，该技术的应用已带来诸多发现，例如识别出与免疫治疗及其他类型治疗临床应答相关的免疫细胞和肿瘤细胞状态及分子程序。此外，应用于解离组织的单细胞技术还可结合DNA条形码标记的抗体（CITEseq），用于鉴定可及的染色质区域、T细胞和B细胞受体组库，以及蛋白质的表达情况。
在使用这些技术时，解离后样本的活力和质量是关键变量，因为这些因素会显著影响单细胞与环境RNA之间的交叉污染、数据质量及结果解读。此外，过长的解离流程可能导致敏感细胞群体的丢失以及应激反应基因特征的上调。为克服这些局限性，我们设计了一种快速通用的解离方案，并已在多种人类及小鼠肿瘤样本中得到验证。该流程首先进行机械和酶解解离，随后依次进行过滤、红细胞裂解和活死细胞富集，适用于细胞起始量较低的样本（如穿刺针芯活检组织）。本方案可确保获得洁净且具有活性的单细胞悬液，这对于成功生成凝胶珠-油包水乳滴（GEMs）、条形码标记及后续测序至关重要。

获取一份悬浮于RPMI中的黑色素瘤活检组织，并立即置于冰上。将样本转移至含有420 µL RPMI和消化酶的1.5 mL微量离心管中，用剪刀剪成小块，随后在37 °C垂直放置的恒温混匀仪中进行15分钟的酶消化（图1）。消化完成后，样本经50 µm无菌一次性滤器过滤，并用新鲜RPMI冲洗滤器以提高细胞得率（图1）。洗涤后残留的组织部分被弃去，因为这些为不需要的生物材料（例如脂肪组织）。
根据细胞沉淀的颜色，需要使用15 mL的ACK裂解缓冲液以去除红细胞（图2）。重悬于 3 mL RPMI 培养基后，总细胞数为 1 × 106/mL，且存活率 &lt;80% (图 3A）。这表明在进行10x Genomics上样前，需使用试剂盒1（第6节方案）对活细胞进行一轮富集。图4）。如果该样本细胞数超过100万个且存活率低于10%，则应使用死细胞去除试剂盒2（Dead Cell Removal - Kit 2）图5）。用分离培养基洗涤样本，并 10 µL 加入Annexin V和生物素筛选混合液，随后 20 µL 磁珠的 60 µL 分离培养基的制备，如第6个实验步骤中所述（图4）。经过此步骤后，将样品重新悬浮于 500 µL 培养基并重新计数。活细胞数量为 4.9 × 105/mL，且细胞活力高于90%（图3B），样品立即按照制造商说明书进行GEM生成。
<img alt="细胞分离过程示意图；机械解离、过滤、离心；实验室设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66766/66766fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：肿瘤样本处理流程概览。（A）组织解离方案的逐步操作示意图。（B）使用垂直定位的温控混匀仪进行样本消化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66766/66766fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示可见沉淀物的实验离心管，展示分离技术的结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66766/66766fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：轻度色素性黑色素瘤样本在ACK处理前与ACK处理后的对比。（A）图像显示一个黑色素瘤样本，在消化步骤后经过滤和离心沉淀，尚未使用ACK缓冲液进行红细胞（RBC）裂解。（B）图像显示同一黑色素瘤样本在使用ACK缓冲液去除红细胞后的状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66766/66766fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞活力分析；处理前后细胞计数；显微镜图像；科学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66766/66766fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：台盼蓝染色后在血细胞计数板中于200倍放大倍率下观察细胞。（A）活细胞富集前的图像，显示被染成蓝色的细胞（代表死细胞），细胞活力低于80%。（B）使用试剂盒1方案（方案步骤6）进行活细胞富集后的样本图像，显示细胞活力提高至90%以上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66766/66766fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="死细胞分离示意图；磁珠孵育、细胞提取过程、实验室设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66766/66766fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：使用试剂盒1进行活细胞-死细胞样本分离的流程示意图。当细胞计数后（方案步骤5）检测到细胞数量少于一百万或超过一百万，且存活率&gt;10%时，执行此步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66766/66766fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="死细胞去除过程，磁性细胞分选仪示意图，展示结合缓冲液洗涤步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66766/66766fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5使用试剂盒2中的死细胞去除磁珠进行活死细胞分离的概述 当细胞数量超过一百万且存活率达到 &lt;10%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66766/66766fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>
<img alt="活/死细胞活力分析；UMAP图、样本参数表格；T细胞富集研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66766/66766fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：使用试剂盒1的改进方案进行一轮活细胞富集后，对未处理样本的单细胞分析验证。 上部分显示了UMAP分析结果，表明在活细胞富集前后细胞群和细胞类型的组成具有一致性。下部分总结了由Cell Ranger生成的测序数据输出。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66766/66766fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案概述了快速解离人和小鼠肿瘤样本以进行单细胞RNA测序的实验步骤。

人和小鼠肿瘤组织样本的解离用于单细胞RNA测序

人类肿瘤样本蕴含着关于其微环境和免疫组库的大量信息。将人类组织样本有效解离为……

我们的研究范围是探讨对标准护理免疫疗法产生应答或耐药的机制。本实验室致力于揭示驱动抗肿瘤有效免疫应答的关键因素，并试图识别这些治疗反应的预测指标，以发现能够克服耐药性的潜在靶点。近年来最重要的进展是单细胞RNA测序技术的发展与整合应用。它们使我们能够实时、系统地以无偏倚的方式研究单个细胞的分子特征，这有助于解析这些复杂且不断演变的肿瘤生态系统。尽管目前已有多种临床前模型被用于研究免疫治疗的响应机制，但我们仍不清楚在人类免疫中起重要作用的免疫学决定因素。实时处理和分析患者样本对于研究特定肿瘤内所有细胞组分至关重要。通过采用无偏倚的基因组学和转录组学技术，我们实验室发现抗原呈递机制的缺陷与黑色素瘤对免疫治疗的耐药性相关。最近，利用单细胞技术，我们分别发现了与黑色素瘤和头颈部癌症患者预后相关的独特T细胞状态和髓系细胞极化特征。本实验方案最大的优势在于其简洁性。这是一种通用型方案，经调整后可在短时间内解离多种癌症类型的大小肿瘤组织样本，最终获得高活性的单细胞悬液。开始肿瘤消化时，将样本倒入置于冰上的60毫米组织培养皿中。用移液器将420 µL培养基从培养皿转移至1.5 mL微量离心管中。使用镊子将样本组织转移至含有培养基的离心管中。用干净的剪刀将组织剪切成直径为2至3毫米的小块。向样本中加入适量的消化酶和培养基。将试管涡旋振荡5秒，然后置于垂直侧放的恒温混匀仪中孵育。在新的15毫升锥形管上方放置一个50微米的细胞滤器，并用1毫升新鲜RPMI培养基预湿滤器。使用1,000微升低吸附白色移液吸头，将样品加载至滤器中，并加入培养基。然后用注射器活塞的末端，以旋转动作研磨并推动滤膜上的样品。用5 mL培养基以及含有样品的培养皿中剩余的培养基冲洗滤膜。首先，获取经过过滤和消化的肿瘤样品。在4 °C条件下，以450 ×g离心样品5分钟。吸除上清液，注意不要扰动沉淀，然后将沉淀重悬于ACK裂解缓冲液中以去除红细胞，并记录所用体积。重复离心和裂解步骤，直至离心后的样品沉淀不再呈现可见的红色。然后将样品沉淀重悬于新鲜培养基中。在1.5毫升离心管中，分别加入10微升台盼蓝和解离的细胞，混匀。取10微升混合液分别加入血细胞计数板两侧，进行细胞计数。记录细胞浓度、活细胞总数、存活率百分比及计数后的最终培养基体积。首先，获取消化后的肿瘤组织样本并裂解红细胞。在4 °C条件下，以450 ×g离心样品5分钟。吸除培养基后，将沉淀重悬于1毫升分离培养基中。再次离心后，将沉淀重悬于100微升分离培养基中。取100微升样品转移至0.2毫升PCR八联管的一个反应孔中。在生物安全柜中，向样品中各加入 10 微升 Annexin V 混合液和生物素筛选混合液。用移液器混匀溶液，在室温下孵育 4 分钟。接着，将葡聚糖包被的磁性颗粒涡旋振荡 30 秒。将20微升磁珠和60微升分离液与样本混合。室温孵育3分钟后，将条形管置于10x Genomics磁力架的高设置位置，静置5分钟。随后将液体从条形管中转移至新的1.5毫升低吸附微量离心管中，注意勿扰动磁珠。按照之前的方法离心试管，并根据沉淀物的大小，用适当体积的RPMI培养基重悬沉淀。最后，使用血细胞计数板对细胞进行计数。去除死细胞后，活细胞浓度为每毫升4.9 × 10⁵，细胞活力高于90%。

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科研

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Cancer Research

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