Name: 利用恒定气压对针头开口进行湿式坡口 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 学习利用恒定气压湿式坡口技术制备硼硅酸盐微注射针，通过显微镜精确控制针尖开口尺寸，确保每次获得锋利一致的针头，为昆虫转基因研究提供可靠的显微注射工具。

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作者希望向以下人员致以谢意。马里兰大学昆虫转化设施的工作人员：Channa Aluvihare、Robert Alford 和 Daniel Gay。如果没有他们的辛勤工作，昆虫转化设施将无法存在。感谢 Vanessa Meldener-Harrell 对本手稿的校对。

注意：下述方案使用 Sutter BV-10 微量毛细管斜面仪。然而，本方案可修改后适用于任何型号的微量毛细管斜面仪。
1. 调节器、压力表和气源管路的组装
<ol>
	<li>剪取一段聚氨酯管，用于连接气源与调压阀（R）底部（第1部分，图1）。该段管子的长度取决于气源到调压阀的距离，调压阀将位于切边器旁边。</li>
	<li>将一个软管夹套入聚氨酯管中，然后将一个软管接头插入管端。通过将软管接头抵住硬质表面，确保其完全插入。在靠近软管接头处握住管子，用力将管子压入接头，直至软管接头完全插入。软管夹与软管接头共同构成连接件HC（图1）。</li>
	<li>将软管夹滑向插入了软管接头的管端。旋转软管夹，使其覆盖插入的带刺端部，从而形成气密连接。</li>
	<li>用手将软管接头拧入调压阀（R）底部，然后使用小扳手完成紧固。确保连接处气密，但不要过度拧紧。</li>
	<li>用手将T型接头（T）拧入调压阀的侧端口，然后使用小扳手完成紧固。</li>
	<li>剪取一小段聚氨酯管（图1，第2部分），长度约为3–5 cm。在该段管子上套入两个软管夹，然后在管子两端各插入一个软管接头，并按照步骤1.2–1.4所述方法完成两端的连接（HC）。</li>
	<li>将短管的一端拧入压力表底部，然后如步骤1.5所述，使用扳手完成紧固。</li>
	<li>将短管的另一端拧入T型接头（T）的一个端口中，该T型接头已在步骤1.5中连接至调压阀。</li>
	<li>剪取一段聚氨酯管（图1，第3部分），用于连接调压阀与针头夹持器（NH）。该段管子的长度取决于切边器到调压阀位置的距离。</li>
	<li>在该段管子上套入一个软管夹，然后按照步骤1.2–1.4所述方法插入软管接头。</li>
	<li>在该段管子的另一端，安装针头夹持器（NH）配套提供的雌性鲁尔接头（LC）。</li>
	<li>从操纵器上拆下固定夹和尼龙垫圈（图2，f）。固定夹和垫圈仅设计用于固定玻璃微毛细管，不能承受微毛细管夹持器、螺纹杆和气源管路的额外重量。</li>
	<li>剪取一块1.5 cm × 2 cm的矩形橡胶垫片，用于包裹自行车挡泥板夹中的螺纹杆。这有助于在自行车挡泥板夹中更牢固地固定螺纹杆和针头夹持器。使用两把尖嘴钳打开自行车挡泥板夹，将矩形橡胶垫片在距螺纹杆一端3.5 cm处折叠覆盖在螺纹杆上，使其在杆上形成U形。将覆盖橡胶垫片的螺纹杆插入打开的自行车挡泥板夹中，并用钳子将夹子闭合并夹紧螺纹杆和橡胶垫片。将自行车夹和螺纹杆组件安装到操纵器螺栓上，重新安装固定夹（不带尼龙垫圈），并拧紧固定夹，使其牢固固定螺纹杆组件。</li>
	<li>将针头夹持器旋入螺纹杆。确保鲁尔接头末端的位置在连接时不会使聚氨酯管受力或扭曲（图2，g）。</li>
	<li>将雌性鲁尔接头连接至针头夹持器（图2，d）的雄性鲁尔接头（图2，g）。</li>
	<li>将图1中第1部分管子的自由端连接至气源（具体连接方式取决于所用气源）。气源应为洁净、干燥且无油残留的空气。气源可来自实验室集中供气系统或气体钢瓶，气体可为压缩空气或氮气（Nitrogen）。</li>
</ol>
2. 硼硅酸盐玻璃针的斜面处理
<ol>
	<li>使用硼硅酸盐玻璃毛细管，在仪器上采用以下参数拉制显微注射针：加热温度：305，拉力：4，速度：70，延迟：235，气压：160，循环时间：12.24。</li>
	<li>根据制造商说明书组装研磨组件，该组件包括磨砂板和带磁铁的固定环12。 
	注意：可能需要用一层薄的透明薄膜包裹磨砂板，以防止润湿剂（如Photo-Flo）过早泄漏。如果润湿剂溶液提前渗入底座油中，导致研磨板停止旋转，则需要采取此措施。润湿剂可降低玻璃针在斜面研磨后出现干燥痕迹的风险。使用润湿剂对研磨过程并非至关重要，可用清水替代。</li>
	<li>在底座的光学平整表面上滴加10滴底座油，并将研磨组件放置其上。启动研磨组件。</li>
	<li>打开光源以照亮表面。确保光源位于斜面后方，并以45°角照射到磨砂板和针尖上。此照明角度可使针尖的阴影清晰可见。在90倍放大倍数下，原位旋转显微镜头部。短暂停止磨砂板旋转，并将显微镜聚焦于磨砂板表面。</li>
	<li>向灯芯中加入1%润湿剂，直至灯芯完全湿润。再向磨砂板表面添加1%润湿剂。确保润湿剂覆盖整个磨砂表面，但不泄漏至黑色固定环上。</li>
	<li>当磨砂板旋转时，将预先润湿的灯芯放置在其表面。确保灯芯位于磨砂板左侧（从上方俯视时），并从11点钟方向延伸至6点钟方向（将磨砂板视为钟面）。确保灯芯不接触固定环的黑色部分。</li>
	<li>将针插入针夹（图2，d）中，并拧紧固定环以固定针头。打开调节阀（图1，R），将压力调至24 psi。</li>
	<li>旋转粗调旋钮（图2，a）提升针夹。确保针头升至足够高，高于旋转磨砂板的表面，然后旋转整个操纵器，使针头摆动至旋转磨砂板上方。待研磨的针头应放置在旋转磨砂板上，方向应使磨砂板的旋转方向远离针尖（图3A）。</li>
	<li>从侧面观察，使用粗调旋钮（图2，a）将针头缓慢下移靠近磨砂板表面。当针头接近液体表面时停止下移。</li>
	<li>降低显微镜放大倍数，移动显微镜使针头位于视野中央。一旦针头居中，提高放大倍数，并调整操纵器位置，使针尖保持在视野中心。达到最大放大倍数后，停止研磨板旋转，将显微镜聚焦于磨砂板表面，然后立即重新启动研磨板旋转。此时针头可能不在视野中。</li>
	<li>使用操纵器的粗调旋钮将针头继续向磨砂板靠近。在视野中，可看到针头及其阴影。当针头与其阴影接近接触时，切换至操纵器的微调旋钮，继续缓慢下移针头，直至针头与其阴影看似接触。此时读取游标卡尺读数（图2，c）并记录。磨砂板表面位于该读数处或更低位置。 
	注意：由于难以准确判断针头是否接触旋转磨砂板表面，此时针头可能尚未实际接触磨砂板。</li>
	<li>保持针头在此游标读数位置5–10秒。</li>
	<li>使用操纵器微调旋钮将针头略微上提，确保其始终位于润湿剂液面以下。停止磨砂板旋转数秒，观察针尖是否有气泡逸出。若有气泡产生，则进入步骤2.15；若无气泡产生，则进入步骤2.14。</li>
	<li>使用操纵器微调旋钮将针头移回原游标读数位置，再略微下移并记录新的游标读数，然后重复步骤2.12–2.13。</li>
	<li>重新启动磨砂板旋转，观察旋转过程中是否出现气泡形成现象。若在旋转过程中可见气泡形成，则针尖开口可能过大，不适合对敏感胚胎（如蚊子胚胎）进行显微注射。若旋转过程中未见气泡形成，则针尖开口大小理想，适用于需要锐利且微小开口针头的操作。</li>
	<li>使用操纵器粗调旋钮将针头提升至高于磨砂板的位置，确保在旋转整个操纵器以将针头移离磨砂板和显微镜时，针头不会触碰任何部件。</li>
	<li>当针头处于可安全取出的位置时，将气压降至零，取下针头，并将其放入针头储存盒（如培养皿内附双面胶或橡皮泥以固定斜面针头）中，待后续使用。</li>
</ol>
3. 确定斜面针头的相对开口大小
注意：斜面针头相对开口大小的确定在步骤 2.13 中完成。以下步骤将进一步描述此过程。
<ol>
	<li>当步骤 2.13 中观察到气泡时，在研磨板不旋转的情况下，通过旋转调压阀调节旋钮（图 1，R）缓慢降低气压，直至针尖停止有气泡流出。记录气泡停止从针尖流出时的压力值。</li>
	<li>逐渐增加气压，直至针尖重新开始产生气泡。气压越高，针尖开口越小。</li>
	<li>继续移动针头至可安全移除的位置，执行步骤 2.16–2.17。</li>
</ol>

Protocol for Wet Beveling of Microinjection Needles Under Constant Air Pressure

<ol><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+Element+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li>
<li>O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+systems+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation systems in insects.</a> Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+Transgenesis%3A+Methods+and+Applications%22">Insect Transgenesis: Methods and Applications</a>. , CRC Press. Boca Rato. (2000).</li>
<li>Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarrell%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).</li>
<li>Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable%2C+germ-line+transformation+of+Culex+Quinquefasciatus+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).</li>
<li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%2C+with+the+piggyBac+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).</li>
<li>Adelman, Z. N., Jasinskiene, N., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+transgenesis+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development and applications of transgenesis in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Mol Biochem Parasitol. 121 (1), 1-10 (2002).</li>
<li>Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transformation+of+the+South+American+malaria+vector%2C+Anopheles+albimanus%2C+with+a+piggyBac%2FEGFP+transposon+vector+is+routine+and+highly+efficient%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient.</a> Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).</li>
<li>Harrell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+embryo+microinjection+under+halocarbon+oil+or+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).</li>
<li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi%3A+The+immune+deficiency+pathway+impacts+vector+competence+for+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major.</a> mBio. 10 (4), e01941(2019).</li>
<li>Tamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+silkworm+Bombyx+mori+L.+using+a+piggyBac+transposon-derived+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector.</a> Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).</li>
<li>BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html">https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html</a> (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

蚊子的基因改造依赖于将改造材料（质粒、引导RNA或蛋白质）精确地显微注射到囊胚前胚胎中3,4,5,6,7,8。该过程的关键在于使用尖锐的注射针，以便在注射过程中轻松刺入胚胎2,4。一根锋利的注射针能够顺利穿过胚胎膜，递送改造材料，并在显微注射后从胚胎中抽出，而不会导致注射部位出现胚胎质泄漏（个人观察）。
拉制完成的显微注射针头最初是封闭的，在注射前需要将其打开2。传统上，显微注射针头通常通过轻轻触碰盖玻片边缘、承载胚胎的载玻片边缘、胚胎本身或其他材料来打开2。然而，通过触碰物体来打开针头的方法结果不一致（个人观察）。有时针头会断裂成尖锐的形状，而其他时候则变得非常钝，正如之前所述，这可能会损伤待注射的胚胎，导致胚胎无法被成功修饰，严重时甚至导致胚胎死亡。另一种方法是将针头插入胚胎内以打开针尖，此过程可使针头破裂并具备注射条件。但这种方法同样产生随机结果，偶尔能形成非常尖锐的针头，但更常见的是在针头投入使用前被胚胎组织堵塞。尽管斜面打磨针头需要额外的时间和精力，但该方法能更稳定地制备出尖锐的针头。
对蚊子进行基因改造是一个依赖时间的过程，需要在胚胎发育至细胞化阶段之前对其进行显微注射4,5,6,7,8。当通过将针头在物体表面轻刷或插入胚胎来开针时，开针并找到锋利针头所需的时间，恰好是胚胎已准备就绪并持续发育的阶段。在理想情况下，开针并获得合适针头仅需一到两分钟；但在其他情况下，该过程可能耗时较长，导致当合适的针头准备好时，已准备用于注射的卵已因过时而不再适合注射。斜面打磨法的优势在于其可预先完成，针头可提前准备好，一旦胚胎进入注射准备状态，即可立即使用，从而确保胚胎处于最适合注射的发育阶段。
尽管上述方案是为Sutter BV-10斜面仪开发并使用该设备，但该方案可修改后适用于任何斜面仪。主要因素是斜面加工表面必须能够容纳少量液体，针头在该液体下完成斜面加工。
在对显微注射针进行斜面打磨时，通过气源向针的尾部提供压缩空气具有两个优点。首先，气压有助于制备出一致性良好的针尖。当每次开始打磨时所施加的气压保持一致，并且在首次观察到气泡出现时立即停止打磨，即可获得锋利程度一致的针尖。关键在于，为了观察气泡的初始形成，必须暂时停止磨砂板的转动，以免其旋转运动掩盖气泡初现的迹象。如果仅在磨砂板转动时才能观察到气泡存在的证据，则针尖开口可能已过大。因此，必须确保每次开始打磨时供气压力相同，在气泡刚开始逸出时（即当磨砂板静止时可观察到）立即停止打磨，并且在磨砂板转动时无法看到气泡逸出。第二个优点是，一旦针尖开口形成，可通过逐步降低供气压力直至气泡停止从针尖逸出，来相对地评估开口大小。记录气泡停止从针尖流出时的压力值，即可推断出相对的开口尺寸：气泡停止流动时的压力越低，表明针尖开口越大；反之，压力越高，则针尖开口越小。了解针尖的相对开口大小，对于使用黏度较高、因而更容易堵塞注射针的注射混合液时尤为有用。利用这种相对开口大小的测量方法，可以制备出适用于高黏度注射液的注射针。当然，使用开口较大的针尖也会带来一些权衡。具体而言，注射后的胚胎更可能出现泄漏现象，且注射胚胎的存活率可能较低。

昆虫基因改造是一种最初由Rubin和Spradling在果蝇中开发的技术，多年来该技术已被改进并应用于其他物种的基因改造1。该技术依赖于在胚胎发育的特定时间窗口和空间位置，将基因改造组分精确地显微注射到胚胎中2,3,4。锋利的显微注射针是某些昆虫（如蚊子4,5,6,7,8,9和白蛉10）基因改造过程中的关键工具，而在其他昆虫（如家蚕11）中则不那么重要。在尝试创建转基因昆虫时，注射针的锋利程度往往是决定成败的关键因素之一2,4。通常，显微毛细玻璃针通过加热玻璃至其变得具有弹性，然后将其拉制成尖端闭合的锥形细针。在使用前，需要以特定方式打开针尖，使其形成适合注射的锋利开口。传统方法是将针尖轻轻刷过某个物体表面（如载玻片或盖玻片边缘，或胚胎本身等），使针尖少量碎裂，随机形成一个锋利的开口2,3。另一种随机性稍低的方法是干斜面打磨法（dry beveling），即将针头快速接触一个光学平整、高速旋转的研磨盘表面，短暂研磨后使针尖少量玻璃被磨除，从而形成锋利的斜面开口。干斜面打磨法比直接刷针尖的方式更具可控性。下述方案在斜面打磨的基础上进一步改进：在液层下进行打磨，同时向针内通入压缩空气，一旦针尖被打开，即可观察到气泡产生。本方案详细描述了一种可稳定制备锋利显微注射针的方法。在液层下进行斜面打磨优于上述随机断裂针尖的方法以及干斜面打磨法，因为操作者可在打磨过程中获得实时反馈，从而判断针尖是否已打开以及开口的大致尺寸。了解针尖开口的相对大小，可使操作者根据需要制备不同开口尺寸的针头。不同开口尺寸的针头具有各自的优势；例如，较大开口的针头可适应高黏度的注射液，而较小开口的针头则对被注射胚胎造成的损伤更小。
使用调节器和基于改进型气压调节注射系统的聚氨酯管路向针头供气2。在以恒定压力向针头供气的同时，将针头在液层下方进行斜面打磨。该打磨过程包含重复执行的五个步骤：1）将针头下降至研磨表面；2）使针头在研磨表面短时间打磨形成斜面；3）在保持针头仍处于液面以下的前提下，将针头从研磨板上抬起；4）停止研磨板的旋转，观察是否有气泡出现。若无气泡产生，则重复步骤1至4，直至观察到气泡；5）一旦出现气泡，即可调节气压以确定针头开口的相对大小。停止气泡形成所需的气压越低，表明针尖开口越大。

<table><tbody><tr><td>1.0 mm 外径微毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>斜面研磨台用油</td><td>Sutter Instruments</td><td>008</td><td></td></tr><tr><td>自行车挡泥板夹</td><td>VeloOrange</td><td>R-clip 4-pack</td><td>https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack</td></tr><tr><td>臂式支架显微镜</td><td>AmScope</td><td></td><td>AMScope 3.5X-90X 三目 LED 臂式支架体视显微镜或同等产品</td></tr><tr><td>BV-10 斜面研磨仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>金刚石研磨板&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>104F</td><td>金刚石研磨板 — 超细规格（尖端尺寸 0.2 &amp;micro; 至 1.0 &amp;micro;）</td></tr><tr><td>丁腈橡胶垫圈</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>11761-2-pkg</td><td>用于密封 T&amp;nbsp; 或 L 型接头的连接处（若接头本身未附带）</td></tr><tr><td>软管夹</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>5000-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>软管接头</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>CT4-pkg</td><td>需准备 5 个软管接头</td></tr><tr><td>显微注射针持针器</td><td>World Precision Instruments</td><td>MPH3-10</td><td>适用于外径为 1 mm 的微毛细管的持针器</td></tr><tr><td>P-2000</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>任意型号的拉针仪</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 溶液</td><td>B&amp;H Photo, Video and Audio</td><td>BH #KOPF200P&amp;nbsp; MFR #1464510</td><td>润湿剂</td></tr><tr><td>压力表</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>PG-100</td><td>量程 0–100 psi 的压力表</td></tr><tr><td>参比棉芯</td><td>Sutter Instruments</td><td>X050300</td><td></td></tr><tr><td>参比棉芯支架</td><td>Sutter Instruments</td><td>M100019</td><td></td></tr><tr><td>调压阀</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>01-Mar</td><td>连接端口需为 #10-32 规格</td></tr><tr><td>橡胶垫片（6 英寸 × 6 英寸）</td><td>Danco</td><td>Model # 59849</td><td></td></tr><tr><td>T 型接头</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>15002-2-pkg</td><td></td></tr><tr><td>螺纹杆</td><td></td><td></td><td>可使用全螺纹杆或一端带螺纹的杆，螺纹规格必须为 10-32</td></tr><tr><td>聚氨酯管</td><td>Clippard Instrument Laboratory, Inc.</td><td>URH1-0804-BLT-050</td><td></td></tr></tbody></table>

利用恒定气压反馈控制微注射针尖开口的湿法倒角技术

Wet Beveling of Microinjection Needles Utilizing Constant Air Pressure for Feedback on Needle Opening

显微注射针是将基因组修饰试剂、CRISPR 组分（引导 RNA、Cas9 蛋白和供体模板）以及转座子系统组分（质粒和转座酶 mRNA）递送至发育中昆虫胚胎的关键工具。在递送这些修饰因子时，尖锐的显微注射针尤为重要，因为它们有助于最大限度地减少对被注射胚胎的损伤，从而提高胚胎存活率，相较于使用非斜面针头进行注射具有明显优势。此外，经过斜面处理的针头在针头间的一致性优于通过随机折断针尖（如将针尖轻触盖玻片边缘或待注射胚胎表面等物体）来开孔的针头。采用持续气压向针内通气并结合湿法斜面处理显微注射针，可使操作者明确判断针头是否已打开（通过观察是否有气泡产生），并相对评估针头开口的大小。通过调节输送至针头的气压，直至达到平衡状态且针尖不再有气泡流出，即可确定针头的相对开口尺寸。达到平衡所需的气压越低，表明针头开口越大；反之，所需气压越高，则针头开口越小。

上述步骤可稳定制备出尖锐的显微注射针。尖锐的注射针能够轻松插入具有柔软卵壳的昆虫胚胎（例如蚊子胚胎）中，几乎不会受到胚胎膜的阻力。在对蚊子胚胎进行遗传修饰的显微注射过程中，胚胎膜具有较强的弹性。使用钝针接触胚胎膜时，会导致膜发生凹陷（图4B）；当针头回撤后，膜可恢复原有形状。若施加足够压力，钝针最终会撕裂膜结构，导致胚质外泄。针头越尖锐，当其接触胚胎膜时产生的凹陷就越小（图4E）。与撕裂膜不同，尖锐的针头可顺利滑入膜内，对胚胎造成的损伤极小甚至无损伤。理想的注射针在刺入胚胎时，几乎不会引起胚胎膜的形变。
马里兰大学昆虫转化中心（UM-ITF）是一家为学术界和工业界客户提供转基因昆虫创制服务的技术平台。该中心使用斜面针头对蚊子胚胎进行显微注射。在2023年1月至2023年12月期间，UM-ITF在56个客户项目中累计注射了12,795枚埃及伊蚊胚胎（表1）。使用斜面针头使UM-ITF在各项目中的平均注射后孵化率达到31%（表2）。此外，根据项目结束后的客户回访结果，UM-ITF的注射成功率维持在96%（表2）。注射成功率是指注射材料（如CRISPR引导RNA、Cas9蛋白、转座子载体质粒等）是否成功递送至胚胎中，并能够有效引发遗传修饰，即是否存在CRISPR插入缺失（Indel）形成的证据、客户提供的基于转座子的载体插入，或注射质量控制载体（含有启动子和标记基因的转座子末端）的插入。换句话说，若注射组分功能正常，注射操作本身是否足够优质以支持遗传修饰的发生。影响遗传修饰项目成功的因素众多，而使用锋利针头进行高质量的显微注射是成功的关键因素之一。采用上述方案中描述的方法对针头进行斜面处理，使UM-ITF能够持续稳定地制备高质量的锋利显微注射针头，从而保障注射结果的一致性与成功率。
<img alt="气相色谱系统示意图、压力表、毛细管针、气源连接。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：气路系统组件及与微毛细管连接的示意图。 气源（可为室内气路或气瓶）通过聚氨酯管路将气体输送至毛细管针。聚氨酯管通过软管连接件（HC）与调压阀（R）和压力表相连，软管连接件由软管接头和软管夹组成。软管连接件旋入调压阀（R）和压力表底部的10-32内螺纹接口。在调压阀（R）上连接一个三通接头（T），用于将气流分配至压力表和针夹持器（NH）。聚氨酯管通过针夹持器（NH）配套的鲁尔接头（LC）与针夹持器相连。气源的连接方式将根据所使用的气源类型而有所不同。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微注射系统示意图，展示生物技术中细胞注射的微米级调节装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：显微操作器部件及气路设置。 显微操作器部件：a. 粗调旋钮，b. 微调旋钮，c. 卡尺，d. WPI 针持器，e. 角度计，f. 固定夹具及自行车挡泥板夹，g. 鲁尔接头与鲁尔软管连接器，h. 聚氨酯软管。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡示意图；旋转运动；带标签的针头；力的平衡概念。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：针头位置与磨削盘旋转方向的关系。（A）倒角过程中的正确针头放置方式。待倒角的针头应放置在旋转的磨削盘上，其方向应介于垂直于旋转方向与沿旋转方向之间，且旋转方向应远离针尖。（B）不正确的针头放置方式。在此取向下，磨削盘的旋转会使磨削面直接推向针尖，而非从针尖下方经过。在此取向下，倒角过程可能无法顺利进行。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微结构破裂的连续显微图像，比例尺0.1 mm，箭头指示裂纹。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66767/66767fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：钝针与锐利针穿刺过程的比较。（A-C）为钝针，（D-F）为锐利针。（A）和（D）为针头接触胚胎前的图像；（B）和（E）为针头即将刺穿胚胎膜时的图像；（C）和（F）为针头刚刺穿后的图像。（B）中的白色箭头表示胚胎膜发生凹陷，这是因为使用钝针需要施加更大的压力才能刺穿膜结构。（E）中的黑色箭头显示由于使用锐利针可轻松刺穿，因此未出现明显凹陷。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/66767fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
表1：2023年1月至2023年12月UM-ITF埃及伊蚊项目。 列出UM-ITF埃及伊蚊显微注射项目的各项内容，包括每个项目注射的胚胎数量、由这些注射后的胚胎孵化出的幼虫数量，以及每项项目中孵化幼虫数占注射胚胎总数的百分比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：UM-ITF埃及伊蚊项目结果。 UM-ITF 是一个服务设施，提供用于昆虫遗传改造的显微注射服务。该表格列出了ITF在2023年1月至2023年12月期间完成的埃及伊蚊项目的注射数量。其中包括对项目后续调查请求作出回应的客户数量，其回应表明了注射项目的成功或失败。成功项目指在胚胎发育的适当时间和位置将注射材料进行显微注射，且注射具备产生遗传修饰能力的项目；未成功项目指因未实现遗传修饰而被视为失败的项目。表格还列出了2023年1月至2023年12月期间埃及伊蚊显微注射项目的平均孵化率、项目成功率以及客户回应率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66767/table%202_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本方案描述了气动系统的组装过程，该系统可在针头开刃过程中向针头输送加压空气。本方案进一步介绍了制备锋利显微注射针头的开刃步骤，以及如何评估针头相对开口尺寸的方法。

显微注射针是递送基因组编辑试剂、CRISPR组分（引导RNA、Cas9蛋白和供体……）的关键工具

昆虫转基因技术平台。我们是大学下属的服务机构，致力于协助客户培育转基因昆虫。研究范围涵盖神经科学领域，例如对蚊子嗅觉机制的研究；公共卫生研究领域，例如开发抗疟疾疫苗；以及在黑水虻中表达新型蛋白质的研究。传统上，拉制针头后需通过将其与某物体摩擦来打开针尖，从而形成可用于显微注射的开口，但这种方法得到的针头可能非常理想，也可能完全无法使用。而本方法能够以精确可控的方式制备针头，每次均可获得尖锐且性能稳定的针尖。本方案可提供关于针尖开口大小的反馈信息。一旦该针头打开，即可逐步降低输送至针尖的压力，气泡停止流出时对应的压力越高，表明该针头的开口尺寸越小。按照制造商的指南准备研磨组件，包括安装研磨板并固定带有磁铁的卡环。然后在基座的光学平面表面滴加10滴基座油。将研磨组件放置在底座上，并启动研磨操作。打开光源以照亮工作区域，确保光源位于斜面边缘后方，以45度角照射到磨料板和针头上。在90倍放大倍率下原位旋转显微镜镜筒。短暂停止研磨盘的旋转，以便将显微镜对准研磨盘表面。向棉芯中加入1%润湿剂，直至棉芯完全湿润。然后将1%润湿剂滴加到研磨盘表面，确保润湿剂覆盖整个表面，且不泄漏至黑色固定环上。将预湿的毛细管放置在旋转的研磨板表面，从顶部俯视时，确保毛细管位于研磨板的左侧，并从“时钟”的11点位置延伸至6点位置。注意毛细管不得接触固定环的黑色部分。在完成研磨组件的准备后，开始对硼硅酸盐玻璃针头进行倒角处理：将针头插入针头夹持器中，并拧紧固定环以固定针头。打开调节器并将压力增加至24磅每平方英寸。旋转粗调旋钮，使针持升高，直至针尖高于旋转研磨板的表面。旋转整个操纵器，使针摆动至旋转板上方的指定位置。将针头置于磨砂板上，使板的旋转方向远离针尖。从侧面观察，使用粗调旋钮将针头向下移动，接近磨砂板表面，当针头即将接触液面时停止。调整针头位置，使其位于视野中心。到达中心位置后，缓慢增加放大倍数，同时进行微调以保持针尖位于视野中央。在最大放大倍数下，停止研磨盘转动，并将显微镜对焦于砂磨板表面。一旦表面清晰对焦，立即重新启动研磨盘旋转。使用操纵器的粗调旋钮，将针头向下移动至砂纸上。在视野中观察针头及其阴影。当两者接近接触时，切换至微调旋钮。继续降低针头，直到其接触到自身的投影。此时读取卡尺数值并记录读数。该读数表明磨料板表面位于此卡尺测量值处或低于该值。使针头在此卡尺读数下保持 5 到 10 秒。使用操纵器微调旋钮缓慢提升针头，同时确保针头始终位于润湿剂液面以下。短暂停止研磨板的旋转，观察是否有气泡从针尖逸出。若未观察到气泡，则将针头移回上一个卡尺读数位置，稍微降低针头，重新进行卡尺读数，并重复之前演示的步骤。若观察到气泡，重新启动研磨板，观察在研磨板旋转过程中是否产生气泡。一旦在研磨板停止旋转时观察到气泡，通过旋转调压阀调节旋钮缓慢降低气压。当针尖不再有气泡流出时，记录压力，然后逐渐增加气压，直至针尖重新开始有气泡流出。斜面打磨完成后，将针抬高至磨削板上方，确保其高度足够，以便在整体操作臂移离磨削板和显微镜时不会触碰到任何物体。当针处于可安全取出的位置时，将气压降至零。取下针头并将其放入培养皿等针头储存盒中，直至使用。

wet-beveling-microinjection-needles-utilizing-constant-air-pressure

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

利用恒定气压对针头开口进行湿式坡口

来源：Poland, R. et al. 利用啮齿类动物脑部微量注射研究动机行为的分子基础。 J. Vis. Exp.

清醒啮齿类动物脑内基于显微注射的治疗剂递送

来源：Vanegas, M. I., et al. 用于联合药物输注与电生理记录的微注射电极系统. J. Vis. Exp.

基于微流控的微注射电极系统用于药物输注与电生理联合检测

来源：Paolone, G., 等．用于啮齿类动物脑部微量注射的个性化针头．J. Vis.

使用石英微针进行啮齿类动物脑部微注射

啮齿类动物是研究行为和复杂精神疾病分子基础的合适模型。通过在清醒啮齿类动物中进行脑部微量注射，可用于阐明疾病的神经生物学基础。本文介绍了一种高效且可定制的脑部微量注射方法，以及用于量化动机的工具性条件行为范式。...

啮齿类动物脑部微量注射研究动机行为的分子基础

本文介绍了一种使用石英针在啮齿类动物脑内进行显微注射的实验方案。这些石英针不会产生可检测到的组织损伤，并能确保即使在深层脑区也能实现可靠的递送。此外，石英针可根据研究需求进行个性化设计，并可重复使用。...

用于啮齿类动物脑部显微注射的个性化针头

我们介绍了如何利用微操作和光操控技术（如荧光漂白恢复技术FRAP和光激活技术），来测定迁移细胞内蛋白质的运动参数及其时空动态。实验读出结果包括运动调控因子或其下方肌动蛋白细胞骨架的亚细胞动态行为与更新速率。...

允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

斑马鱼是一种具有多种重要特性的模式生物，包括光学通透性高、体外发育迅速，以及对听觉和平衡研究尤为重要的体表感觉毛细胞。本文概述了如何利用转基因斑马鱼整体性地检测毛细胞的机械感觉功能和突触前功能。...

斑马鱼幼鱼侧线毛细胞的活体钙成像

我们介绍了一种微注射电极系统，该系统专为电生理记录及辅助递送实验探针（如纳米传感器、微电极）而设计，并可选择性地进行药物灌注。该系统将广泛可得的微流控组件与容纳探针的套管相连接。文中包含微注射电极构建的逐步操作方案，并展示了在猕猴皮层中灌注蝇蕈醇（muscimol）时的实验结果。...

用于药物输注与电生理联合记录的微注射电极系统

CRISPR/Cas9 越来越多地被用于在非模式生物中鉴定基因功能。本实验方案描述了如何从制备显微注射混合物、获取并注射蚊子胚胎，到饲养、杂交和筛选注射后的蚊子及其后代以获得目标突变，从而建立致倦库蚊（Culex...

使用 CRISPR/Cas9 技术制备并注射 Culex 蚊胚胎以产生无效突变

本文演示了将核输入底物进行细胞质显微注射至Xenopus...

非洲爪蟾卵母细胞的显微注射

学习利用恒定气压湿式坡口技术制备硼硅酸盐微注射针，通过显微镜精确控制针尖开口尺寸，确保每次获得锋利一致的针头，为昆虫转基因研究提供可靠的显微注射工具。

利用恒定气压反馈控制微注射针尖开口的湿法倒角技术

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