Name: 使用自体血凝块建立肺栓塞的微创大鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 了解使用自体血凝块建立大鼠肺栓塞模型的微创方法，包括肺动脉树硅胶铸型可视化技术和梗死面积定量分析。该模型可提高实验可靠性，助力开发新型治疗策略。

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本研究由吴阶平医学基金会资助（项目编号：320.6750.19089-36）。

所有动物实验均经中国医学科学院动物护理和使用委员会批准 &amp; 中国医学科学院北京协和医学院（批准号：IRM/2-1ACUC-2311-015）。本研究采用6周龄、体重约250 g的雄性Sprague-Dawley大鼠。动物饲养于特定病原体阴性环境中，自由摄取均衡饲料和水。饲养条件为室温下12小时光照/12小时黑暗循环 22 °C ± 2 °C动物在进行任何手术操作前，先在环境中适应1周。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 仪器与材料
<ol>
	<li>麻醉设备：使用适用于小型动物的气体麻醉机和异氟烷。</li>
	<li>手术材料：准备棉签、聚维酮碘消毒液、体视显微镜、剃毛刀、医用胶带、带27 G针头的1 mL注射器、5 mL注射器、10 mL注射器、无菌生理盐水、纱布、8-0无菌尼龙缝线、带缝合针的6-0无菌尼龙缝线、微型止血钳、微型镊子和精细剪刀。</li>
	<li>其他材料：准备与医用注射器兼容的19 G和18 G分配针、内径为1.2 mm、长度为10 cm的硅胶管、内径为3.0 mm、长度为20 cm的输液管、1.5 mL离心管、移液器及移液器吸头。</li>
	<li>自制血栓发生器和血凝块注射装置（图1）：将硅胶管连接至固定在1 mL注射器上的19 G分配针，制成血栓发生器。将输液管一端连接至18 G分配针，另一端连接至5 mL注射器，制成血凝块注射装置。</li>
</ol>
2. 自体血凝块制备
<ol>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>将动物放入麻醉诱导室，以2 L/min的流速给予4%异氟烷与空气的混合气体，持续2-3分钟（遵循机构批准的方案）。</li>
		<li>将动物仰卧位固定于手术平台上，通过以0.4 L/min流速给予2.5%异氟烷维持麻醉状态。检测足底反射以确认麻醉深度足够。</li>
		<li>将双侧前肢水平向两侧展开，后肢向后伸展，充分暴露腹股沟区域，并使用医用胶带固定动物于该位置（图2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>经颅腔静脉（CVC）采血
	<ol>
		<li>使用剃毛器和脱毛膏去除胸骨柄周围毛发，用聚维酮碘溶液消毒皮肤3次。</li>
		<li>将连接1 mL注射器的27 G针头垂直刺入左侧或右侧CVC，深度为8 mm，如图2A所示。 
		注：CVC在体表的投影位于胸骨柄外侧5 mm处。两侧均可使用，选择不影响后续操作。</li>
		<li>手持注射器，轻柔回抽活塞，在针筒内形成负压。缓慢退针直至血液流入，随后保持该位置，直至采集到0.3 mL血液（图2B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血栓制备
	<ol>
		<li>将采集的血液推入1.5 mL离心管中，注意避免产生气泡。</li>
		<li>将血液吸入自制血栓发生器的硅胶管中，使血柱长度达到10 cm。 
		注：上述两步操作应迅速完成，因为血液在离心管中会开始凝固并持续发展，影响最终获取血栓的质量。</li>
		<li>静置30分钟，使血液完全形成血栓。在此期间，可同步为其他动物制备血柱。</li>
		<li>将凝固的血柱冲洗至含有无菌生理盐水的无菌培养皿中，并用生理盐水清洗血栓柱3次（图2C）。</li>
		<li>使用精细剪刀将血栓柱切成长度均为4 mm的均一血栓块（图2D）。将15–25个血栓块吸入已预装2 mL生理盐水的自制注射器中。 
		注：血栓块长度不应超过1 cm，否则可能滞留在右心室中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 静脉通路准备
<ol>
	<li>暴露浅表腹壁血管
	<ol>
		<li>对同一动物进行麻醉并按步骤 2.1 所述方法固定。</li>
		<li>剃除左侧腹股沟区域周围的毛发。在该区域涂抹脱毛膏，等待 1 分钟后用纱布擦去脱毛膏。用聚维酮碘对皮肤消毒 3 次。</li>
		<li>在腹股沟区浅表腹壁血管起始处上方做一长约 5 mm 的皮肤切口。通常可通过观察腹股沟区域微小的搏动来定位浅表腹壁血管的起始位置。</li>
		<li>在 10 倍放大体视显微镜下分离皮下薄层脂肪组织，以暴露浅表腹壁血管（图 3A）。缝合切口，停止异氟烷供气，并将动物放入保温箱中恢复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离浅表腹壁静脉
	<ol>
		<li>仔细将浅表腹壁静脉与伴行动脉、神经及脂肪组织分离。分离范围应包括近端至其汇入股静脉处，以及远端至第一静脉分支处。</li>
		<li>用 8-0 无菌缝线结扎远端，并用微型夹子夹住缝线；近端则用另一微型夹子固定 8-0 无菌缝线环进行控制（图 3B）。</li>
		<li>在分离段静脉的远端做一小的横向切口。控制近端以防止出血。用生理盐水冲洗静脉管腔内残留血液。待静脉冲洗干净后，使用显微镊扩大静脉切口。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 栓塞术
<ol>
	<li>静脉插管
	<ol>
		<li>将自制注射器的针头经静脉切口轻柔插入静脉。用第三把止血钳固定针头，防止其滑出静脉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>栓塞操作
	<ol>
		<li>缓慢推动推杆，注入少量生理盐水。若静脉充盈且无阻力，提示静脉通路通畅（图3D）。</li>
		<li>继续推动推杆，通过浅表腹壁静脉通路将血栓注入股静脉。控制栓塞速度为每分钟5个栓子。观察动物呼吸情况；出现并逐渐加重的呼吸困难提示栓塞成功。</li>
		<li>注入预定数量的血栓后，拔出针头，并结扎浅表腹壁静脉的近端。</li>
		<li>缝合切口，将动物置于保温箱中。待动物苏醒后转移至笼中，并持续监测其呼吸及行为状态。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 梗死面积的定量分析
<ol>
	<li>安乐死与心脏灌注
	<ol>
		<li>将 25,000 U 肝素钠加入 250 mL 生理盐水中，充分混匀。将瓶连接至输液装置，并倒挂在 80 cm 高度处，关闭输液装置的阀门。</li>
		<li>使用过量异氟烷对动物实施安乐死（遵循机构批准的方案）。</li>
		<li>用大剪刀剪开肋骨，打开胸腔，注意避免损伤肺组织和大血管。</li>
		<li>将输液装置的针头插入左心室，打开输液装置的阀门，使含肝素的生理盐水开始灌注。用剪刀剪开下腔静脉和左心耳以利于液体流出。控制灌注速度为 50 mL/min。 
		注：此过程中，正常肺组织会变为白色，而栓塞区域仍呈锈色。</li>
		<li>完成肝素化生理盐水灌注后，使用装有 4% 多聚甲醛溶液的 10 mL 注射器，经右心室穿刺肺动脉主干。通过肺动脉进行 4% 多聚甲醛灌注，总灌注体积为 30 mL，以固定肺组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>引入梗死比（Infarction Ratio）指标
	<ol>
		<li>固定完成后，将肺、心脏、气管、食管、胸腺及大血管作为一个整体，从脊柱和膈肌上完整切除11。</li>
		<li>仔细去除初始组织块中的食管、胸腺和脂肪组织，仅保留心脏、肺和大血管。</li>
		<li>将剩余组织浸入足量的 4% 多聚甲醛溶液中，固定至少 48 小时。</li>
		<li>使用分析天平称量整个肺组织的重量。用精细剪刀分离肺的梗死部分，并用同一台天平称量梗死组织的重量。使用以下公式计算梗死比： 
		<img alt="强度公式 I=i/w，用于物理光学计算的示意图。" src="/files/ftp_upload/66776/66776eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
		i 为梗死组织的重量，w 为整个肺组织的重量，I 表示梗死比。</li>
		<li>在定量评估梗死区域后，修整经多聚甲醛固定的肺组织，用于石蜡包埋11。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 肺动脉树的可视化
<ol>
	<li>肺动脉灌注造影
	<ol>
		<li>处死动物，并按照步骤 5.1 所述进行心脏灌注。</li>
		<li>按等量（重量比）将稀释剂加入硅胶造影剂中，混合均匀，然后加入 5%（重量或体积比）的固化剂，再次充分混合。</li>
		<li>用 1 mL 注射器吸取 1 mL 混合液，排尽空气，将针头经右心室插入肺动脉主干，固定针头以防止滑脱和反流。</li>
		<li>轻压注射器推杆，使硅胶造影混合液充填肺动脉树。正常肺组织区域将被造影剂染色，而梗死区域则保持锈红色。 
		注意：肺动脉灌注造影仅适用于完整的肺组织。通常 0.6–0.8 mL 造影混合液足以充填肺动脉树。过量注射可能导致肺静脉也被灌注，从而影响肺动脉树的观察效果。加入固化剂后，造影混合液应在 20 分钟内使用完毕，否则将发生固化结晶。</li>
		<li>灌注完成后拔出注射器，结扎肺动脉主干，并按照步骤 5.2 所述取下肺脏、心脏及大血管。将整块组织放入培养皿中，置于 4 °C 冰箱内过夜，以使造影混合液充分固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透明化与观察
	<ol>
		<li>用剪刀将心脏和大血管从肺组织上分离，清除肺表面残留的固化物碎片。</li>
		<li>将肺组织依次浸入 25%、50%、75%、95% 和 100% 的乙醇溶液中，每种浓度处理 24 小时，以彻底脱水。</li>
		<li>将脱水后的肺组织浸入水杨酸甲酯中 24 小时。经此透明化处理后，肺动脉树清晰可见，栓子亦可被观察到，因为水杨酸甲酯不会清除血红蛋白（图 4B、D）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究成功建立了一种采用自体血凝块的微创大鼠肺栓塞模型。熟练掌握后，该建模过程可在30分钟内完成。病理学检查证实，该模型能有效模拟临床肺栓塞的关键特征。因此，该模型为阐明肺栓塞后血流动力学变化及并发症的发病机制、开发新的诊断生物标志物和治疗靶点，以及测试新型抗血栓疗法提供了有价值的工具。
几十年来，人们在建立肺栓塞（PE）动物模型方面做出了大量努力，但至今尚未有一种方法被公认为模拟PE的最佳方案12。本文介绍的改良PE模型具有以下几个显著特点：（1）通过中心静脉导管（CVC）采血：在啮齿类动物中，CVC连接锁骨下静脉与颈内静脉的汇合处，并向尾侧延伸进入胸腔13。左侧和右侧CVC几乎呈对称分布。CVC管腔较颈静脉更大，位置靠近胸骨柄，位于胸大肌下方。这些解剖学特征使得静脉穿刺更为精确，可采集较大体积的血液样本，且止血迅速，从而获得较高的成功率。此外，通过CVC采血相比其他采血途径更不易受到污染，血肿、血栓形成和气胸等并发症的发生率也较低。止血通常可自动完成或通过按压快速实现。（2）通过浅表腹壁静脉注射：通常采用颈外静脉注射血凝块以诱导PE6,8,9，暴露该静脉所需的皮肤切口可做到最小化。然而，颈外静脉插管常导致静脉闭塞，可能对后续实验产生不利影响，因为颈外静脉是大鼠出生后主要的颅部静脉回流通道14，而另一侧颈外静脉常需用于右心室压力测定6,8,10。在本改良模型中，牺牲浅表腹壁静脉对机体影响极小。此外，该注射途径更接近临床PE情况，因为大多数栓子来源于下肢静脉。准确识别浅表腹壁动脉的位置对于实施小切口至关重要。浅表腹壁动脉的搏动通常可在腹股沟区皮肤表面触及，有助于血管定位。（3）可定制的栓子负荷：栓子负荷由血柱的直径和总长度决定。本研究所用的血栓生成装置可实现标准化及个性化栓子负荷的制备。研究人员可根据具体研究需求调整这些参数。在此模型中，所设定的栓子负荷可引发明显的症状和体征，但致死可能性较低。一般而言，若注入的血凝块长度少于10 cm，则操作相对安全。若出现呼吸暂停，应立即停止注射，实验人员应将手指置于动物胸壁的侧面和前侧，用手掌进行节律性胸部按压，动物呼吸功能可能因此恢复。（4）肺灌注及梗死区域的定量分析：本研究引入了详细的肺灌注技术，以更清晰地显示PE诱导后的肺梗死情况。在此基础上，建立了用于量化梗死面积的指标——梗死比（infarction ratio）。当前结果表明，该指标可能对栓子负荷及内在纤溶活性具有响应性，提示其在评估新型抗血栓疗法的研究中，可用于不同组别间的比较分析。
与肺栓塞（PE）建模相比，对肺栓塞的一种严重长期并发症——慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）进行建模更具挑战性，这主要是由于啮齿类动物体内具有较高的纤溶活性。潜在的解决方案包括重复栓塞以及给予氨甲环酸（TXA）——一种纤溶抑制剂7,10,12,15。然而，静脉通路损伤以及TXA在血浆中的快速清除，仍使得CTEPH建模困难重重。本文所介绍的模型及配套的可视化方案，可能为建立一种可靠的CTEPH模型提供参考。
本研究的局限性也应予以说明。首先，该模型缺乏血流动力学测量数据，例如右心室压力和超声心动图检测。然而，这并不影响模型的有效性，因为该模型已通过病理学方法验证。研究人员可参考其他文献以获取有关血流动力学测量的详细方法16。其次，本肺栓塞模型未设置治疗组以评估药物反应，例如给予华法林或尿激酶，而这些实验可进一步证明该模型的应用价值。
综上所述，一种以微创方法为特征的改良型啮齿类动物肺栓塞模型已成功建立。本文还提供了用于量化梗死区域和可视化肺动脉树的方法。该模型有望用于解决有关肺栓塞并发症预防与治疗的关键科学问题。

肺栓塞（PE）是院内死亡的主要原因，也是心血管死亡的第三大常见原因。尽管其发病率较高，预防和及时诊断仍然具有挑战性1,2。抗凝和溶栓治疗在肺栓塞的治疗中至关重要，但要改善疾病管理，仍需进一步深入理解疾病进展机制，并开发新的治疗策略3。
在现代生物医学研究中，动物模型在阐明人类疾病机制和开发新疗法方面发挥着关键作用4,5。由于伦理考量和成本效益较高，小鼠、大鼠、仓鼠和兔子常被用于肺栓塞（PE）建模6,7,8,9,10。PE建模方法通常分为三类：体内血栓形成、体外血块注射以及非血栓性颗粒的给予。动物种类和建模技术的选择取决于具体的研究目标，因为尚无单一模型适用于所有研究目的。例如，专注于探索新型溶栓疗法的研究通常采用自体血块模型，而非非血栓性颗粒模型。
目前用于建立啮齿类动物肺栓塞模型的方法由于缺乏详细且标准化的操作流程而面临挑战。这影响了血液采样、血凝块形成以及随后的栓塞等关键步骤，而这些步骤对于确保不同研究之间结果的可重复性至关重要。此外，在量化栓塞区域以及准确绘制栓塞后栓子分布方面，目前仍存在显著的技术空白。解决这些不足对于提升啮齿类动物模型在肺栓塞研究中的可靠性与应用价值至关重要。
本研究详细描述了使用自体血凝块建立肺栓塞大鼠模型的实验方案。该模型具有微创采血技术、标准化血栓制备流程以及微创静脉通路等特点。此外，还提供了肺组织梗死区域的定量分析方法及肺动脉树的可视化技术，这些方法可能有助于推动后续的科研发现。

<table><tbody><tr><td>分析天平</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>MA55/A</td><td>无</td></tr><tr><td>分配针头</td><td>Jinrong electronics</td><td>无</td><td>19 G 和 18 G</td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Stronger</td><td>XGJ1300</td><td>无</td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Solarbio</td><td>01-08-9041</td><td>140U/mg</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>RWD</td><td>R510-22-10</td><td>无</td></tr><tr><td>水杨酸甲酯</td><td>Macklin</td><td>M813577</td><td>分析纯，99%</td></tr><tr><td>微型夹钳</td><td>JZ&amp;nbsp;</td><td>W40160</td><td>无</td></tr><tr><td>微型镊子</td><td>Stronger</td><td>XGN1310</td><td>无</td></tr><tr><td>硅胶浇铸化合物</td><td>Flow Tech</td><td>MV-130</td><td>无</td></tr><tr><td>Sprague-Dawley 大鼠</td><td>Vital River</td><td>SD-IGS</td><td>无</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Murzider</td><td>MSD204</td><td>无</td></tr></tbody></table>

建立一种使用自体血栓的微创大鼠肺栓塞模型

Establishment of a Minimally Invasive Rat Model of Pulmonary Embolism Using Autologous Blood Clots

肺栓塞（PE）是导致心血管死亡的主要原因之一，给社会经济带来重大负担。尽管目前的治疗主要集中在抗凝和溶栓，但仍迫切需要更深入地理解其病理生理机制，并开发新的治疗策略。动物模型在理解肺栓塞和研发新疗法方面发挥着关键作用，其中啮齿类动物因伦理和成本因素被广泛使用。然而，现有的啮齿类肺栓塞模型受限于缺乏标准化操作流程，影响了实验的可重复性和不同研究之间的比较。本研究旨在建立一种使用自体血栓的微创大鼠肺栓塞模型。该模型包括微创采血技术、标准化血栓制备流程以及微创静脉通路。此外，还提供了用于量化梗死区域和可视化肺动脉树的技术方案。这些方法旨在提高啮齿类动物模型在研究肺栓塞进展中的可靠性，并促进新型治疗方法的开发。

PE模型的症状与病理学 
栓塞过程中，大鼠出现呼吸急促，胸廓波动范围增大。当注入血栓长度少于10 cm时，几乎所有动物均成功度过肺栓塞发作期（建模动物中15只中有14只存活）。返回笼中后，动物蜷缩于角落，对食物和水的兴趣降低。然而，这些症状迅速缓解，数小时内动物行为恢复正常。栓塞前与栓塞后24小时的体重无显著差异（341.8 ± 10.4 与. 343.3 ± 8.5, p = 0.25).
大体病理学显示，栓塞（梗死）区域呈楔形，主要位于肺的下部，边界清晰。在梗死区域的顶端可见栓子，阻塞了肺动脉的一级和二级分支。采用苏木精-伊红染色的显微病理学检查证实了肺动脉分支的栓塞（图4F）。
血栓负荷与梗死面积 
在初步研究血栓负荷对肺梗死影响的实验中，我们测试了低血栓负荷（6 cm 血栓柱，15 块血块）和高血栓负荷（10 cm 血栓柱，25 块血块）两种情况。结果如预期所示，较高的栓子负荷导致更大范围的肺梗死（图 5A-C）。
24 小时内的内在纤溶作用 
与栓塞后立即采集的肺组织样本相比，栓塞后 24 小时采集的肺组织样本显示梗死区域明显减少，表明大鼠具有较强的内在纤溶潜力（图 5D）。
<img alt="基于注射器的过滤装置；用于液体转移和过滤的管路与注射器配置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：血栓发生器和血凝块注射装置的构建。（A）通过将硅胶管连接至18 G分配针头（外径12 mm）和预先装有0.5 mL生理盐水的1 mL注射器，组装成血栓发生器。（B）通过将19 G分配针头（内径0.84 mm，外径1.08 mm）连接至输液管（血凝块容器）和预先装有2 mL生理盐水的5 mL注射器，构建血凝块注射装置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="研究中大鼠手术操作流程及结果；示意图与实验结果；组织样本。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：采血与血栓制备。（A）大鼠经麻醉后固定于仰卧位。带虚线的白色圆圈指示胸骨柄，作为体表标志。白色圆圈旁的红点表示穿刺部位，用于进入双侧前腔静脉（CVC）。图的下半部分显示了胸骨柄、CVC 及穿刺部位相对位置的解剖示意图。（B）通过右侧 CVC 成功采血。（C）血栓化的血柱从自制血栓发生器中被冲洗出。（D）由血栓化血柱获得的血凝块。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示缝合和引流管放置的伤口愈合过程示意图，用于组织修复研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：静脉通路与栓塞。（A）通过5 mm皮肤切口暴露浅表腹壁上血管，其中蓝色箭头指示浅表腹壁上静脉，红色箭头指示浅表腹壁上动脉。（B）将浅表腹壁上静脉从周围组织中分离，并用尼龙缝线控制静脉。（C）自制注射器，内含血凝块。（D）使用自制注射器的给药针头插入静脉，并通过静脉通路注入血凝块。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="生物组织分析、解剖分离、标注图像 A-F、组织学、病理学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：肺栓塞的病理学表现。（A）经心脏生理盐水灌注及4%多聚甲醛固定的正常肺组织。（B）通过硅胶铸型混合物与水杨酸甲酯透明化处理后观察到的正常肺组织，显示通畅的肺动脉树及微血管结构。（C）自体血凝块栓塞后即刻的肺组织，标记区域表示因栓塞导致的肺梗死。（D）通过硅胶混合物铸型及水杨酸甲酯透明化处理后观察到的病变肺组织，黑色箭头指示阻塞肺动脉分支的栓子，白色虚线圆圈指示其受累区域，表现为梗死。（E）左肺叶解剖图像，显示肺动脉分支内的栓子（红色箭头）。（F）采用苏木精-伊红染色观察肺动脉分支内血栓栓塞的显微图像。比例尺：200 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示不同梗死比例的组织梗死研究；心脏实验结果比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66776/66776fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：肺梗死比的定量分析。（A）栓塞后立即从大鼠获取的肺组织，栓子为10 cm长的血凝块（总长度）。（B）栓塞后立即从大鼠获取的肺组织，栓子为6 cm长的血栓。（C）栓塞后立即从大鼠获取的肺组织，栓子为8 cm长的血凝块。（D）栓塞后24小时从大鼠获取的肺组织，栓子为8 cm长的血凝块。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66776/66776fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文详细描述了一种使用自体血凝块建立微创大鼠肺栓塞模型的方法学。同时还提供了用于量化梗死面积和可视化肺动脉树的其他方法。

肺栓塞（PE）是导致心血管死亡的主要原因之一，造成了重大的社会经济负担。尽管现有的治疗方法……

本研究的目的是提高模拟人类病理生理过程的肺栓塞啮齿类动物模型的可靠性和可重复性。我们旨在探讨如何利用微创技术建立肺栓塞（PE）模型，以期推动新型治疗策略的开发。我们的实验方案以标准化方式制备自体血凝块，并以最小侵入性手段建立手术型啮齿类肺栓塞模型，从而提升肺栓塞动物实验的可靠性和可重复性。研究发现，啮齿类动物体内血凝块的溶解速度较快，这解释了为何难以建立慢性血栓栓塞性肺动脉高压模型。本文所介绍的血凝块可视化技术将为建立可靠的CTEPH动物模型提供指导。本实验室由生物医学工程与临床心血管团队联合组建。依托该模型，本实验室将致力于基于先进生物材料解决方案，开发针对肺栓塞的新型血栓栓塞及并发症预防策略。[旁白] 首先将麻醉后的动物仰卧位放置于手术平台上。将四肢水平伸展远离躯干，并拉伸后肢以充分暴露腹股沟区域。使用医用胶带将动物固定在此位置。用电剃刀剃除胸骨区及腹股沟周围的毛发，随后在残留毛发处涂抹脱毛膏，并用聚维酮碘对皮肤进行三次消毒。将连接1毫升注射器的27号针头垂直刺入8毫米深度，穿刺左侧或右侧前腔静脉。然后握住注射器，轻轻回拉活塞，在针筒内形成负压。逐渐向外撤针，直至血液流入针筒。保持该位置，直至收集到0.3毫升血液。用于血凝块制备时，将采集的血液推入1.5毫升离心管中。再用自制血栓发生器的硅胶管吸取血液，使血柱长度达到10厘米。静置30分钟，使血液充分凝固。随后用生理盐水将血栓血柱冲洗至含有生理盐水的培养皿中。之后使用精细剪刀将血栓柱切成每段长度为4毫米的均一血凝块。将15至25个血凝块吸入预先装有2毫升生理盐水的自制注射器中。对麻醉大鼠的手术区域消毒后，在腹股沟区浅表腹壁静脉起始处上方做一5毫米长的皮肤切口。在10倍放大体视显微镜下，分离皮下脂肪薄层，暴露浅表腹壁血管。仔细将浅表腹壁静脉与动脉、神经及脂肪组织分离。用8-0无菌缝线结扎远端，并以微型夹夹住缝线固定。 proximal端使用另一微型夹固定的8-0无菌缝线环控制。结扎远端缝线环，并用电灼器横断静脉。接着，在分离出的静脉远端做一小的横向切口，用生理盐水冲洗静脉管腔内残余血液。待静脉冲洗干净后，使用显微镊扩大静脉切口。进行栓塞时，将自制注射器的针头经静脉切口轻柔插入静脉内。用第三个夹子固定针头，防止其滑出静脉。然后缓慢推动活塞，注入少量生理盐水。继续推动活塞，通过浅表腹壁静脉通路将血凝块送入股静脉。用近端缝线结扎静脉。最后缝合皮肤切口。用过量异氟烷处死大鼠后，用大剪刀剪开肋骨并打开胸腔，注意避免损伤肺组织和大血管。将灌注装置的针头插入左心室。打开灌注装置的阀门，使肝素化生理盐水开始灌注。用剪刀剪开下腔静脉和左心耳，以利液体引流。控制灌注速度为50毫升/分钟。灌注完成后，使用装有4%多聚甲醛溶液的10毫升注射器，经右心室穿刺肺动脉主干。通过肺动脉进行4%多聚甲醛灌注固定，总灌注量为30毫升，以固定肺组织。为显示肺动脉树结构，向硅胶铸型化合物中加入等量稀释剂。混合均匀后，加入5%固化剂并再次充分混合。然后将1毫升混合液吸入1毫升注射器中。排尽空气后，经右心室插入针头至肺动脉主干。轻压活塞，使硅胶铸型混合物填充整个肺动脉树。将整块组织置于培养皿中，随后放入4°C冰箱内过夜，使铸型混合物充分固化结晶。将肺组织依次浸入25%、50%、75%、95%和100%的乙醇溶液中，每个浓度浸泡24小时。将脱水后的肺组织再浸入水杨酸甲酯中24小时。栓塞后立即取出的肺组织可见自体血凝块及肺梗死区域。栓子负荷越高，肺梗死面积越大。与栓塞后即刻取材的肺组织相比，栓塞后24小时取材的肺组织显示梗死区域显著缩小，表明大鼠体内具有较强的内在纤溶潜力。该图展示了正常肺组织及肺栓塞肺组织经铸型与组织透明处理后的肺动脉树结构。

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