建立一种使用自体血栓的微创大鼠肺栓塞模型

本研究的目的是提高模拟人类病理生理过程的肺栓塞啮齿类动物模型的可靠性和可重复性。我们旨在探讨如何利用微创技术建立肺栓塞（PE）模型，以期推动新型治疗策略的开发。我们的实验方案以标准化方式制备自体血凝块，并以最小侵入性手段建立手术型啮齿类肺栓塞模型，从而提升肺栓塞动物实验的可靠性和可重复性。研究发现，啮齿类动物体内血凝块的溶解速度较快，这解释了为何难以建立慢性血栓栓塞性肺动脉高压模型。本文所介绍的血凝块可视化技术将为建立可靠的CTEPH动物模型提供指导。本实验室由生物医学工程与临床心血管团队联合组建。依托该模型，本实验室将致力于基于先进生物材料解决方案，开发针对肺栓塞的新型血栓栓塞及并发症预防策略。

[旁白] 首先将麻醉后的动物仰卧位放置于手术平台上。将四肢水平伸展远离躯干，并拉伸后肢以充分暴露腹股沟区域。使用医用胶带将动物固定在此位置。用电剃刀剃除胸骨区及腹股沟周围的毛发，随后在残留毛发处涂抹脱毛膏，并用聚维酮碘对皮肤进行三次消毒。将连接1毫升注射器的27号针头垂直刺入8毫米深度，穿刺左侧或右侧前腔静脉。然后握住注射器，轻轻回拉活塞，在针筒内形成负压。逐渐向外撤针，直至血液流入针筒。保持该位置，直至收集到0.3毫升血液。用于血凝块制备时，将采集的血液推入1.5毫升离心管中。再用自制血栓发生器的硅胶管吸取血液，使血柱长度达到10厘米。静置30分钟，使血液充分凝固。随后用生理盐水将血栓血柱冲洗至含有生理盐水的培养皿中。之后使用精细剪刀将血栓柱切成每段长度为4毫米的均一血凝块。将15至25个血凝块吸入预先装有2毫升生理盐水的自制注射器中。对麻醉大鼠的手术区域消毒后，在腹股沟区浅表腹壁静脉起始处上方做一5毫米长的皮肤切口。在10倍放大体视显微镜下，分离皮下脂肪薄层，暴露浅表腹壁血管。仔细将浅表腹壁静脉与动脉、神经及脂肪组织分离。用8-0无菌缝线结扎远端，并以微型夹夹住缝线固定。 proximal端使用另一微型夹固定的8-0无菌缝线环控制。结扎远端缝线环，并用电灼器横断静脉。接着，在分离出的静脉远端做一小的横向切口，用生理盐水冲洗静脉管腔内残余血液。待静脉冲洗干净后，使用显微镊扩大静脉切口。进行栓塞时，将自制注射器的针头经静脉切口轻柔插入静脉内。用第三个夹子固定针头，防止其滑出静脉。然后缓慢推动活塞，注入少量生理盐水。继续推动活塞，通过浅表腹壁静脉通路将血凝块送入股静脉。用近端缝线结扎静脉。最后缝合皮肤切口。用过量异氟烷处死大鼠后，用大剪刀剪开肋骨并打开胸腔，注意避免损伤肺组织和大血管。将灌注装置的针头插入左心室。打开灌注装置的阀门，使肝素化生理盐水开始灌注。用剪刀剪开下腔静脉和左心耳，以利液体引流。控制灌注速度为50毫升/分钟。灌注完成后，使用装有4%多聚甲醛溶液的10毫升注射器，经右心室穿刺肺动脉主干。通过肺动脉进行4%多聚甲醛灌注固定，总灌注量为30毫升，以固定肺组织。为显示肺动脉树结构，向硅胶铸型化合物中加入等量稀释剂。混合均匀后，加入5%固化剂并再次充分混合。然后将1毫升混合液吸入1毫升注射器中。排尽空气后，经右心室插入针头至肺动脉主干。轻压活塞，使硅胶铸型混合物填充整个肺动脉树。将整块组织置于培养皿中，随后放入4°C冰箱内过夜，使铸型混合物充分固化结晶。将肺组织依次浸入25%、50%、75%、95%和100%的乙醇溶液中，每个浓度浸泡24小时。将脱水后的肺组织再浸入水杨酸甲酯中24小时。栓塞后立即取出的肺组织可见自体血凝块及肺梗死区域。栓子负荷越高，肺梗死面积越大。与栓塞后即刻取材的肺组织相比，栓塞后24小时取材的肺组织显示梗死区域显著缩小，表明大鼠体内具有较强的内在纤溶潜力。该图展示了正常肺组织及肺栓塞肺组织经铸型与组织透明处理后的肺动脉树结构。