Name: 生长囊性纤维化相关的多微生物生物膜以探测群落表型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 53 s
Description: 了解囊性纤维化相关多物种生物膜培养方法，使用Pseudomonas aeruginosa等病原体在96孔板中模拟肺部环境。该模型揭示微生物相互作用机制，为研究气道感染治疗策略提供重要工具。

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我们希望感谢 George A. O'Toole 博士和 Thomas H. Hampton 博士在设计与开发过程中所发挥的重要作用 体外 多微生物群落模型。我们感谢索菲·罗比特艾尔博士（Dr. Sophie Robitaille）对本文手稿提出的宝贵意见。本研究由囊性纤维化基金会资助，项目编号JEAN21F0，授予F.J-P。 图1 手稿中的插图使用 BioRender 制作。

所有试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 准备人工痰液培养基
注意：在本实验方案中，人工痰液培养基（ASM）定义为根据 Turner 及其同事先前发表的 SCFM2 培养基改良而来的、适用于囊性纤维化（CF）研究的培养基17。以下是该培养基的制备步骤说明。有关储备液配制及储存条件，请参见材料表。本版本的 ASM 与 Turner 等人17所描述的原始配方有所不同，因为原始配方的缓冲能力不足以在长时间内维持稳定的 pH 值。具体而言，由链球菌属（Streptococcus spp.）和普雷沃菌属（Prevotella spp.）等厌氧菌进行的发酵活动会导致培养基酸化（未发表观察结果）。因此，已将 3-吗啉丙磺酸（MOPS）的浓度从 10 mM 调整至 100 mM。
注意：配制2倍浓度的ASM基础培养基（ASMb）储备液，有助于添加黏蛋白、琼脂、水等组分，而不会影响ASM中各分子的最终浓度10,18。2x ASMb可预先配制，置于避光处4 °C保存，最多可保存两周。若培养基变黄，则应弃用。
<ol>
	<li>配制2倍ASM基础储备液时，在一个洁净的烧杯中加入400 mL去离子水，2O，边搅拌边加入以下成分：
	<ol>
		<li>加入6.50 mL的0.2 M NaH2PO4.2O储备液；6.25 mL的0.2 M Na2HPO4 储备液；348 µL 的 1 M KNO3 储备液；0.25 M K 的 1.084 mL2SO4 储备液</li>
		<li>加入 4.0 g 缺乏色氨酸的酵母合成培养基（Yeast synthetic dropout without Tryptophan）；3.032 g NaCl；20.92 g MOPS；1.116 g KCl 和 0.124 g NH₄Cl4艰难梭菌（Clostridioides difficile）</li>
		<li>加入9.30 mL的1 M L-乳酸储备液；2.70 mL的1.1 M葡萄糖储备液；1.75 mL的1 M CaCl₂2.2H2O储备液；1.20 mL的0.25 M溶液 N乙酰葡萄糖胺储备液和1.00 mL 3.6 mM FeSO₄4.7H2O型血库存。</li>
		<li>加入660 µL的0.1 M色氨酸储备液；606 µL的1 M MgCl₂2.6H2O型血清；0.60 g鲱鱼精子脱氧核糖核酸；400 µL 250 mg/mL 1,2-二油酰基-sn二油酰基-甘油-3-磷胆碱（DOPC）储备液</li>
		<li>所有组分加入后，用5 M NaOH储备液调节pH至6.80，用去离子水定容至500 mL。2O. 使用0.22 µm滤器除菌，4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为制备10 mg/mL（2倍浓度）的黏蛋白储备液，使用一个洁净的玻璃瓶，加入250 mL去离子水2O 并在搅拌的同时：
	<ol>
		<li>加入5.0 g猪胃黏蛋白II型，混悬液搅拌10分钟，用去离子水定容至500 mL2O.</li>
		<li>121 °C 高压灭菌 15 分钟。使用前于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重悬ASM。 
	注意：此步骤需在实验当天进行。
	<ol>
		<li>将2倍浓缩的ASMb储存液与10 mg/mL黏蛋白储存液按1:1的体积比混合。</li>
		<li>使用前充分涡旋振荡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备多物种微生物群落选择性培养基
注意：以下是配制 1 L 培养基所需的各种成分用量。
<ol>
	<li>制备甘露醇盐琼脂（Mannitol Salt Agar, MSA）和假单胞菌分离琼脂（Pseudomonas Isolation Agar, PIA）时，请遵循制造商的说明。</li>
	<li>制备普雷沃氏菌选择性琼脂（Prevotella Selective Agar, PSA）时，在一个洁净的玻璃瓶中加入以下成分：
	<ol>
		<li>30.0 g 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、15.0 g 琼脂、5.00 g 酵母提取物、0.50 g 盐酸L-半胱氨酸。</li>
		<li>10.0 mL 浓度为 0.5 mg/mL 的血红素储备液、100 µL 浓度为 10 mg/mL 的甲萘醌储备液。</li>
		<li>加入 940 mL 去离子水（diH2O）并搅拌均匀。于 121 °C 高压灭菌 15 分钟。&#160;</li>
		<li>冷却至可徒手持瓶后，在搅拌条件下加入：50.0 mL 脱纤维羊血、2.00 mL 浓度为 50 mg/mL 的卡那霉素储备液、150 µL 浓度为 50 mg/mL 的万古霉素储备液、500 µL 浓度为 10 mg/mL 的多粘菌素B储备液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备链球菌选择性琼脂（Streptococcus Selective Agar, SSA）时，在一个洁净的玻璃瓶中加入以下成分：
	<ol>
		<li>30.0 g TSB、15.0 g 琼脂。</li>
		<li>加入 950 mL 去离子水（diH2O）并搅拌均匀。于 121 °C 高压灭菌 15 分钟。&#160;</li>
		<li>冷却至可徒手持瓶后，在搅拌条件下加入：50.0 mL 脱纤维羊血、1.00 mL 浓度为 10 mg/mL 的多粘菌素B储备液、1.00 mL 浓度为 10 mg/mL 的奥索利酸储备液。 
		注：将培养基倒入培养皿中，于 4 °C 保存，最长不超过 1 个月。使用前，应在接种前于室温下干燥最多 24 小时。PSA 已使用黑色普雷沃氏菌（P. melaninogenica）和中间普雷沃氏菌（Prevotella intermedia）进行过验证。SSA 已使用血链球菌（S. sanguinis）以及米勒链球菌群（Streptococcus milleri group, SMG），即星座链球菌（Streptococcus constellatus）、中间链球菌（Streptococcus intermedius）和咽峡炎链球菌（Streptococcus anginosus）进行过验证。若需测试新菌株，强烈建议对这些选择性培养基进行从头验证（de novo validation）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细菌液体培养基的制备与培养条件
<ol>
	<li>常规培养 P. aeruginosa 和 S. aureus 时，使用无菌的富营养培养基（例如，LB 培养基或 TSB 培养基）。
	<ol>
		<li>挑取先前在 LB/TSB 琼脂平板上于 37 °C 培养 20–24 小时后形成的单菌落，接种液体培养基过夜培养。</li>
		<li>将液体培养物于 37 °C、250 rpm 振荡条件下培养 16–18 小时过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养 Streptococcus spp. 时，使用添加了 0.5% 酵母提取物的无菌 Todd Hewitt 肉汤（THB-YE）。
	<ol>
		<li>挑取先前在添加 5% 脱纤维羊血的 TSB 琼脂平板（血琼脂平板）上于 37 °C、5% CO2 条件下培养 24 小时后形成的单菌落，接种液体培养基过夜培养。</li>
		<li>将 THB-YE 培养物在厌氧条件或 37 °C、5% CO2 条件下静置培养 18–22 小时过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养 Prevotella spp. 时，通过向一个洁净瓶中加入以下成分配制 1 L Prevotella 生长培养基（PGM）：
	<ol>
		<li>30.0 g TSB，5.00 g 酵母提取物，0.50 g 盐酸-L-半胱氨酸，10.0 mL 浓度为 0.5 mg/mL 的血红素储备液，以及 100 µL 浓度为 10 mg/mL 的甲萘醌储备液。</li>
		<li>加入 990 mL 去离子水（diH2O），于 121 °C 高压灭菌 15 分钟。用铝箔包裹瓶子以避光。</li>
		<li>将 Prevotella spp. 菌落在血琼脂平板上于 37 °C 厌氧条件下培养 48 小时以获得菌落。</li>
		<li>挑取单菌落接种至 PGM 中，于 37 °C 厌氧条件下静置培养 24 小时过夜。 
		注：PGM 可在室温下保存最多两周。强烈建议在使用前对每批培养基进行无菌检测。若未使用厌氧工作站，可能需要从菌苔区域而非单菌落开始 Prevotella spp. 的液体过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 共培养实验准备
注意：图1 展示了简化的实验流程。如果准备时间少于1小时，可在有氧条件下进行实验设置。若预计准备时间超过1小时，强烈建议在厌氧培养箱（混合气体组成为10% CO2、10% H2 和80% N2）中进行实验。厌氧罐也可用于实验样品的孵育。
<ol>
	<li>单培养和共培养的制备 
	注意：所有离心步骤均在室温下以 10,000 × g 离心 2 分钟。对于共培养，在接种 96 孔板前立即混合细菌样品。通常，从过夜培养物中收集 1 mL 的 P. aeruginosa 和 S. aureus 菌株。对于 Streptococcus spp. 和 Prevotella spp.，过夜培养体积可能在 2–4 mL 之间。这些体积可根据待测试条件的数量进行调整。
	<ol>
		<li>使用过夜培养的细菌液体，执行以下步骤：
		<ol>
			<li>对于 P. aeruginosa 和 S. aureus 菌株，使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次。</li>
			<li>对于 Streptococcus spp. 和 Prevotella spp.，使用无菌 PBS 洗涤一次。 
			注意：使用移液器小心弃去上清液，因为沉淀物容易丢失。</li>
			<li>洗涤后，将每种沉淀物重悬于 1 mL 的 1× 水稀释 ASMb 中。</li>
			<li>将每种样品在无菌 PBS 中进行 1:10 稀释，并测定 OD600。</li>
			<li>将所有培养物的 OD600 调整为 0.2（在 ASM 中）。</li>
			<li>使用 OD600 = 0.2 的菌悬液，在 ASM 中将细菌样品稀释至最终 OD600 为 0.01（每种微生物），用于单培养和共培养。</li>
			<li>充分涡旋振荡 5 秒。 
			注意：例如，为制备总量为 1 mL、OD600 = 0.01 的 P. aeruginosa 单培养 ASM 悬液，可将 50 µL OD600 = 0.2 的 P. aeruginosa 菌液加入 950 µL ASM 中。对于共培养，取 OD600 = 0.2 的 P. aeruginosa、S. aureus、Streptococcus spp. 和 Prevotella spp. 菌悬液各 50 µL，加入 800 µL ASM 中。</li>
			<li>使用移液器将 100 µL 单培养和共培养菌悬液分别加入无菌平底 96 孔板的三个独立孔中。</li>
			<li>将 96 孔板在 37 °C、无氧条件下孵育 24 小时（不振荡）。 
			注意：此处也可使用其他氧张力条件（如微氧、常氧）。但该模型是在无氧条件下建立并验证的。强烈建议通过连续稀释单培养和共培养菌悬液，并接种于 PIA、MSA、SSA 和 PSA 培养基上，以确认初始接种量。各细菌物种的目标起始浓度分别为：1 × 107 CFU/mL（P. aeruginosa）、3.5 × 106 CFU/mL（S. aureus）、1.2 × 106 CFU/mL（Streptococcus spp.）和 4.6 × 106 CFU/mL（Prevotella spp.）。细菌接种量也可根据 Jean-Pierre 及其同事所述方法进行调整10。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物膜形成后更换培养基。
	<ol>
		<li>孵育 24 小时后，使用多通道移液器通过抽吸去除未附着的（浮游）细胞。</li>
		<li>向已形成的生物膜中补充 100 µL 新鲜 ASM 或所需处理液（如抗生素、代谢物等）。</li>
		<li>将 96 孔板在 37 °C、无氧条件下继续孵育 24 小时。 
		注意：若操作迅速（即少于 1 分钟），这些步骤可在有氧条件下进行。否则，请使用厌氧舱。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 样品的收集与接种
<ol>
	<li>额外培养24小时后，使用多通道移液器吸除未贴壁（浮游）的细胞。 
	注意：浮游菌部分可保留，进行系列稀释后接种于选择性培养基，也可弃去。</li>
	<li>用125 µL无菌PBS轻柔洗涤生物膜两次，并弃去洗涤液。</li>
	<li>加入50 µL无菌PBS，使用96针复制器轻柔刮取培养板上的细胞，使生物膜脱离。</li>
	<li>将重悬的生物膜细胞转移至新的无菌96孔板的A行。 
	注意：该96孔板的B至H行应含有无菌PBS。</li>
	<li>对浮游菌（如需要）和生物膜部分进行10倍系列稀释。</li>
	<li>将每种稀释样品3–5 µL分别接种于PIA、MSA、SSA和PSA培养基上。</li>
	<li>让接种点自然干燥。</li>
</ol>
6. 选择性平板的孵育及菌落形成单位（CFU）计数
<ol>
	<li>对于 P. aeruginosa 和 S. aureus，在 37 °C 下培养 18–20 小时。</li>
	<li>对于 Streptococcus spp，在 37 °C 的无氧条件下培养 24 小时。</li>
	<li>对于 Prevotella spp，在 37 °C 的无氧条件下培养 48 小时。</li>
	<li>培养后，计数菌落（每点约 10–35 个），并计算每毫升的菌落形成单位（CFU）。</li>
	<li>使用可视化工具绘制数据。</li>
</ol>

In Vitro Polymicrobial Interactions in Cystic Fibrosis Lung Infections

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<li>Hendricks, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+enhances+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+growth+through+dysregulation+of+nutritional+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection enhances Pseudomonas aeruginosa biofilm growth through dysregulation of nutritional immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1642-1647 (2016).</li>
<li>Hogan, D. A., Vik, A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pseudomonas+aeruginosa+quorum-sensing+molecule+influences+Candida+albicans+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology.</a> Mol Microbiol. 54 (5), 1212-1223 (2004).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-assembling+living+material+as+an+in+vitro+lung+epithelial+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Matter%22%5BJournal%5D)">Co-assembling living material as an in vitro lung epithelial infection model.</a> Matter. 7 (1), 216-236 (2024).</li>
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作者声明无利益冲突。

这一临床指导下的方法的实用性 体外 共培养系统的优势在于其能够检测多微生物特异性的细菌功能。也就是说，通过利用该模型，我们已报道了从群落特异性生长等范围广泛的微生物表型 普雷沃菌属 种（spp.）图2) 对一线囊性纤维化抗生素敏感性变化的影响 P. aeruginosa, S. aureus 和 S. sanguinis (图3）。此外，尽管所展示的数据表明 图2 代表实验室菌株，使用每种微生物的不同物种/菌株（包括耐甲氧西林的）已获得类似结果 S. aureus （耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）菌株，SMG， P. intermedia 和临床分离株 P. aeruginosa10.
通过利用该共培养系统，我们先前报道...

旨在根除囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）气道中检出的致病微生物的策略常常失败，而囊性纤维化是一种累及多器官的遗传性疾病1也就是说，在富含黏液的囊性纤维化（CF）肺部环境中，能够形成具有抗性的、类似生物膜的微生物群落，可导致持续数十年的慢性感染2此外，尽管一线抗菌药物（Abx）和调节剂的使用已使囊性纤维化患者（pwCF）的治疗效果得到改善，但 &#34;一菌一病&#34; 临床通常针对典型囊性纤维化病原体所采用的方法，例如 铜绿假单胞菌 和 金黄色葡萄球菌 在这些个体肺部检测到的难治性感染中，该方法一直未能奏效3,4,5,6,7.
在过去二十年中，多项研究改变了我们对囊性纤维化（CF）慢性肺部疾病的认识8。研究表明，囊性纤维化患者（pwCF）气道中检测到的感染并非仅由单一病原体引起，而是具有多微生物共存的特性8。此外，尽管混合菌种CF肺部感染的发病机制仍不明确，但临床证据显示，气道中同时感染金黄色葡萄球菌（S. aureus）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的患者，其肺功能比仅被其中一种病原体定植的患者更差9。
人们推测，囊性纤维化致病菌之间的种间相互作用是导致多微生物生物膜感染难以通过囊性纤维化治疗手段根除的原因，最终影响患者的治疗效果3支持这一点， 体外 研究表明，微生物之间的相互作用，例如 P. aeruginosa, 金黄色葡萄球菌， 以及其他因素可能影响与临床相关的表型，例如对一线囊性纤维化药物（包括万古霉素和妥布霉素）的抗生素响应性6,10,11因此，针对混合菌种感染背景下根除囊性纤维化病原体的现有治疗策略，仍有待重新审视。
在管理基于微生物的囊性纤维化（CF）肺部感染方面，金标准高度依赖于使用抗菌药物敏感性试验（AST）来指导临床干预12。然而，AST 通常采用在营养丰富且充分混匀的培养条件下生长的细菌单一代培养物进行，这并不能反映在 CF 气道中检测到的微生物生长环境3,13。鉴于患者预后与治疗效果之间存在显著脱节，临床报告目前主张开发整合 CF 肺部关键特征的新型方法12,14。
很少有研究开发出与囊性纤维化相关的细菌多物种模型 体外 含有两种以上病原体的系统15,16然而，这些模型（1）未能完全反映囊性纤维化肺部的多微生物和生物膜样特性，以及（2）未采用接近囊性纤维化气道中实际检测到的营养和环境条件15,16通过挖掘大型囊性纤维化（CF）肺部来源的16S rRNA基因数据集并进行计算分析，Jean-Pierre 及其同事近期开发出一种 体外 整合上述特征的共培养模型10。该系统包括 P. aeruginosa, S. aureus, 链球菌 种（spp.）和 普雷沃氏菌属 在CF气道类似条件下培养的spp.可稳定生长长达14天。作者还报道了群落特异性的生长特征 普雷沃菌属 spp. 以及这些囊性纤维化病原体对抗生素反应性的多种变化，其机制仍有待阐明10。这一可操作的 体外 该系统还提供了深入探究与常见变异株抗生素耐受性相关的机制性问题的可能性 P. aeruginosa 在囊性纤维化患者气道中常被检出10因此，本实验方案的目的是为囊性纤维化研究领域提供一种标准化的实验流程，用于培养 体外 具有进一步拓展潜力的生物膜，可用于解决一系列与囊性纤维化（CF）相关的问题。

<table><tbody><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DOPC）</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0387928</td><td>在瓶中用氯仿配制250 mg/mL的储备液。于-20&amp;deg;C保存。在2x ASM基础培养基中的终浓度为200 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>3-吗啉丙磺酸（MOPS）</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>在2x ASM基础培养基中的终浓度为200 mM。</td></tr><tr><td>96针复制器</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-9</td><td>也可使用一次性复制器。货号 #NC1567338。</td></tr><tr><td>带盖的96孔无菌标准板</td><td>Fisher Scientific</td><td>62406-081</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>2.5 L矩形厌氧罐（AnaeroPack）</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-246-385</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;*2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>用水配制1 M储备液，并用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为3.5 mM。</td></tr><tr><td>脱纤维绵羊血</td><td></td><td></td><td>用于制备链球菌和普雷沃菌的生长平板。</td></tr><tr><td>鲱鱼精子脱氧核糖核酸</td><td>Sigma</td><td>D7290</td><td>在2x ASM基础培养基中的终浓度为1.2 mg/mL。</td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA1449830</td><td>用水配制1 mg/mL（3.6 mM）储备液，并用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌。避光铝箔包裹保存。在2x ASM基础培养基中的终浓度为0.0072 mM。</td></tr><tr><td>GasPaks</td><td>Fisher Scientific</td><td>B260678</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>用水配制20%储备液（1.1 M），高压灭菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为6 mM。</td></tr><tr><td>血红素</td><td>Sigma</td><td>51280</td><td>将100 mg血红素溶于2 mL 1 M NaOH中，再加水定容至200 mL。储存于棕色瓶中或用铝箔包裹的普通瓶中，4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P304-500</td><td>用水配制0.25 M储备液，并用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为0.54 mM。</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td></td><td></td><td>用水配制50 mg/mL储备液。用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌，4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>在2x ASM基础培养基中的终浓度为30.0 mM。</td></tr><tr><td>KNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P263-500</td><td>用水配制1 M储备液，并用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为0.70 mM。</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸盐酸盐</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1038922</td><td></td></tr><tr><td>L-乳酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L1750</td><td>用水配制1 M储备液，并用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌。调节pH至7.0。在2x ASM基础培养基中的终浓度为18.6 mM。</td></tr><tr><td>L-色氨酸</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td>用0.2 M NaOH配制0.1 M储备液，并用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌。4 &amp;deg;C冷藏，铝箔包裹避光保存。在2x ASM基础培养基中的终浓度为0.132 mM。</td></tr><tr><td>甘露醇盐琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11407</td><td>按生产商推荐方法配制。</td></tr><tr><td>甲萘醌</td><td>Sigma</td><td>M5625</td><td>用96-100%乙醇配制10 mg/mL储备液。4 &amp;deg;C避光铝箔包裹保存。使用前涡旋混匀。</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;*6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA12288A9</td><td>用水配制1 M储备液，并用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为1.21 mM。</td></tr><tr><td>猪胃黏蛋白 - II型&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M2378</td><td>用水配制10 mg/mL（2x）储备液；高压灭菌前充分混匀。4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S375-500</td><td>用水配制0.2 M储备液，并用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为2.5 mM。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-乙酰葡糖胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A8625</td><td>用水配制0.25 M储备液，并用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌。储备液4 &amp;deg;C冷藏保存。在2x ASM基础培养基中的终浓度为0.6 mM。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>在2x ASM基础培养基中的终浓度为103.7 mM。</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>用水配制0.2 M储备液，并用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌。在2x ASM基础培养基中的终浓度为2.6 mM。</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>配制5 M储备液。用于调节2x ASM基础培养基储备液的pH。</td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td>在2x ASM基础培养基中的终浓度为4.6 mM。</td></tr><tr><td>氧氟酸</td><td></td><td></td><td>用0.5 M NaOH配制10 mg/mL储备液。用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌，4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>多粘菌素B</td><td></td><td></td><td>用水配制10 mg/mL储备液。用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌，4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;假单胞菌&lt;/em&gt;分离琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0927-17-1</td><td>按生产商推荐方法配制。</td></tr><tr><td>托德-休伊特肉汤</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0492-17-6</td><td>按生产商推荐方法配制。</td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-17-3</td><td>按生产商推荐方法配制。</td></tr><tr><td>万古霉素</td><td></td><td></td><td>用水配制50 mg/mL储备液。用0.22 &amp;mu;m滤膜过滤除菌，4 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11929</td><td></td></tr><tr><td>不含色氨酸的酵母合成缺陷培养基&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y1876</td><td>在2x ASM基础培养基中的终浓度为8.0 mg/mL。</td></tr></tbody></table>

培养与囊性纤维化相关的多微生物生物膜以研究群落表型

Growing a Cystic Fibrosis-Relevant Polymicrobial Biofilm to Probe Community Phenotypes

大多数 体外 模型无法充分探究在真实生活环境的复杂相互作用中出现的细菌表型。这一点在囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）患者气道中检测到的难治性、慢性、多微生物生物膜感染背景下尤为突出，CF 是一种累及多器官的遗传性疾病。尽管多项微生物组研究已明确了囊性纤维化患者（pwCF）气道中的微生物组成，但尚无 体外 迄今为止，尚无模型能够完全整合与囊性纤维化相关的关键肺部特征。因此，在研究多种微生物共同感染的囊性纤维化肺部疾病发病机制方面，仍存在显著的知识空白。本文中，我们介绍一种近期开发的四物种微生物群落模型，该模型包含 铜绿假单胞菌, 金黄色葡萄球菌, Streptococcus sanguinis，以及 Prevotella melaninogenica 在类似囊性纤维化（CF）条件下培养。通过利用该系统，可观察到具有临床相关性的表型，例如抗菌药物敏感性&#160;在分子水平上观察并探究了多种病原体的顽固性。该方法的实用性 体外 该模型的优势在于其标准化的工作流程，有助于在慢性囊性纤维化肺部感染的背景下研究物种间的相互作用。

如图2所示，已报道多种表型现象，包括：(1) 与单一种培养相比，P. aeruginosa 和 S. aureus 在混合浮游菌群中共培养时，其活菌数量减少；(2) S. sanguinis 细胞的多菌种生长增加；以及 (3) P. melaninogenica 的混合菌群生长，该现象此前已由 Jean-Pierre 及同事报道过10。
此外，如图所示 图1 的 体外 该系统还可用于在生物膜群落建立后，检测感兴趣的分子（如 Abx、代谢物等）。也就是说，共培养生长的微生物已显示出：（1）敏感性增加P. aeruginosa-图3A)，(2) 敏感性降低（S. aureus 和 S. sanguinis-<strong...

本方案描述了一种与囊性纤维化（CF）肺部相关的四物种多微生物生物膜模型，可用于探究细菌种间相互作用的影响。

大多数体外模型无法充分探究在真实环境复杂相互作用中产生的细菌表型。这一……

我们正致力于研究微生物在模拟真实生活条件下的生长行为，旨在确定多物种群落与单一种群培养相比发生表型变化的驱动机制。通过利用这种体外系统，我们已表征了一条驱动铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）顽固性特征的分子通路；铜绿假单胞菌是囊性纤维化呼吸道感染中的著名病原体。由于该系统采用96孔板格式，且培养条件反映了囊性纤维化肺部的实际情况，因此能够便捷地探究多种微生物组相互作用。我们在完整的微生物组背景下深入了解了微生物对抗微生物药物敏感性变化的机制。我们的模型在囊性纤维化研究中架起了临床观察与个体实验室工作之间的桥梁，为研究各种微生物组相互作用提供了有价值的工具。首先，准备好所有所需的试剂和培养基。进行共培养实验时，离心过夜培养的细菌，用无菌 PBS 洗涤细胞。离心后，小心弃去上清液，将每份菌体沉淀重悬于 1 毫升 1X 水稀释的人工痰液培养基（ASM 基础）中。使用分光光度计或酶标仪，在 600 纳米处测定 1 至 10 倍稀释样品的光密度。将每种细菌样品稀释至600纳米处的终末光密度为0.01，并充分涡旋震荡5秒。取100 µL单菌培养和共培养悬浮液，分别加入无菌塑料平底96孔板中的三个独立孔内，在37°C厌氧条件下孵育24小时。随后使用多通道移液器移除未贴壁的浮游细胞，并向已形成的生物膜中补充100 µL新鲜ASM或所需处理试剂。吸除浮游细胞后，用125微升无菌PBS轻柔地清洗生物膜两次，并弃去洗涤液。加入50微升无菌PBS。使用96针复制器，轻轻将细胞从培养板上刮下。将重悬的生物膜细胞转移至新的无菌96孔板的A排，并进行10倍系列稀释。取每种稀释样品3至5 µL点种于琼脂平板上。待接种液滴干燥后，将平板置于适宜条件下培养。观察到多种表型，包括当铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在混合浮游群落中生长时，其可存活细胞数量较单一种群培养时减少。同时观察到血链球菌（Streptococcus sanguinis）的多菌种生长以及黑色素普雷沃菌（Prevotella melaninogenica）混合群落生长的增加。

growing-cystic-fibrosis-relevant-polymicrobial-biofilm-to-probe

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

生长囊性纤维化相关的多微生物生物膜以探测群落表型

该实验流程可用于对囊性纤维化患者肺部细菌生物膜的既定 体外模型进行抗生素敏感性检测。使用该模型可提高MBEC（最小生物膜清除浓度）检测的临床有效性。...

囊性纤维化肺部中Pseudomonas aeruginosa和Staphylococcus aureus生物膜的离体模型抗生素疗效检测

该方法可用于建立囊性纤维化中的多微生物生物膜模型，以供科研和临床实验室进行抗菌敏感性测试。该模型在多种检测指标下均能提供准确且可靠的结果。...

开发一种多微生物菌落生物膜模型以测试囊性纤维化中的抗菌药物

本研究概述了一种构建多微生物聚集性生物膜模型的框架，并优化了RNA提取方案，以评估反映囊性纤维化肺部环境的铜绿假单胞菌（Pseudomonas...

用于研究感染相关基因表达的囊性纤维化聚集生物膜模型

探究白蚁后肠中的微生物群落——访谈

Jared Leadbetter 带我们进行了一次自然观察之旅，探索白蚁后肠中栖息的生命多样性——这个微环境包含了地球上其他任何地方都找不到的 250 种不同物种。Jared...

共生的层次——可视化白蚁后肠微生物群落

在本视频中，我们介绍微流控探针1（MFP）。我们将详细说明如何组装MFP，将其安装在倒置显微镜上，并相对于基底表面进行对准，最后展示如何利用它在缓冲溶液中处理基底表面。...

微流体探针：操作及其在局部表面处理中的应用

Ice-Cap 方法可实现植物在96孔板中生长，并能对每株幼苗的根组织进行非破坏性采样。从这些根组织中提取的 DNA 可用于基因分型反应。我们发现，Ice-Cap 方法在拟南芥（Arabidopsis...

Ice-Cap：一种用于植物生长的高通量毛细管采样方法 拟南芥 在96孔板中培养番茄植株以实现高通量基因分型

我们描述了一种增敏方法，利用基于RNAi的基因组筛选和整合的转基因，该转基因表达一种带有荧光标签的功能性蛋白质，以鉴定秀丽隐杆线虫（C.

RNAi 筛选以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的胚后表型

我们提供一种简单、半定量的方法，用于在体外研究生物膜的形成。in vitro 利用蔡司Stemi...

利用皱褶菌落形成评估生物膜产生的半定量方法

已开发出一种用于量化非洲爪蟾（Xenopus...

Xenopus 口面部表型的定量分析

了解囊性纤维化相关多物种生物膜培养方法，使用Pseudomonas aeruginosa等病原体在96孔板中模拟肺部环境。该模型揭示微生物相互作用机制，为研究气道感染治疗策略提供重要工具。

培养与囊性纤维化相关的多微生物生物膜以研究群落表型

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