Name: 模拟疾病进展和预测药物活性的非小细胞肺癌原位异种移植模型的构建 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: 学习构建非小细胞肺癌原位异种移植模型，利用多细胞球体和荧光A549-iRFP细胞进行动态活体监测，评估顺铂治疗反应，为肿瘤微环境研究和抗癌药物开发提供更贴近临床的研究平台。

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本研究得到了太平洋大学SAAG和SEED基金的资助。我们感谢William Chan博士提供Odyssey红外成像205系统，以及John Livesey博士提供SpectraMax iD3酶标仪的使用权限。我们感谢Melanie Felmlee博士在动物实验方案方面提供的技术建议。

动物实验经太平洋大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后进行（动物实验方案编号：19R10 和 22R10）。本研究使用了八只雄性裸鼠，年龄为5-6周，体重20-25 g，饲养于参照啮齿类动物饮食标准喂养，并在无特定病原体（SPF）条件下饲养。笼具、垫料和饮用水均经过高压灭菌并定期更换。图1展示了小鼠肿瘤接种的示意图。有关本实验方案中使用的所有材料和仪器的详细信息，请参见材料表。
1. A549-iRFP 细胞三维多细胞球体的建立
<ol>
	<li>将A549-iRFP细胞（人肺腺癌细胞）在37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育，并在完全培养基DMEM中培养，该培养基含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1 µg/mL嘌呤霉素。</li>
	<li>将A549-iRFP细胞以每孔4,000个细胞的接种密度接种至96孔超低吸附圆底球体微孔板中，每孔加入100 µL含0.3%胶原蛋白的完全培养基。</li>
	<li>将微孔板在4 °C下以300 × g离心7分钟，以促进多细胞球体（MCS）的形成。离心后在显微镜下观察MCS形态，确保细胞发生聚集。</li>
	<li>48小时后，向每孔加入100 µL完全培养基，使每孔培养基总体积达到200 µL。</li>
	<li>每隔一天将每孔中的100 µL培养基更换为新鲜的完全培养基。</li>
</ol>
2. A549-iRFP 多克隆细胞系的表征
<ol>
	<li>使用显微镜观察并成像多细胞球体（MCS）的形态，并基于相差显微镜图像，利用MATLAB提供的参考软件通过模拟估算MCS体积。
	<ol>
		<li>在 ImageJ 软件中打开一个 MCS 图像。</li>
		<li>使用 徒手选择 选择MCS的边缘并将其添加到 ROI 管理器.</li>
		<li>点击 编辑 | 选择 | 创建遮罩.</li>
		<li>点击 编辑 | 反转.</li>
		<li>点击 文件 | 另存为 | Tiff.</li>
		<li>打开 ReViSP 软件。</li>
		<li>单击打开已保存的 TIFF 图像 浏览.</li>
		<li>点击 开始 完成MCS模拟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用红外成像系统在700 nm通道下检测iRFP荧光信号，并利用软件（例如Image Studio）对荧光信号进行定量分析。
	<ol>
		<li>打开图像工作室软件。</li>
		<li>在 通道 标签，选择 700 和 强度 = 5.</li>
		<li>在 扫描控制 标签，选择 84 µm, 培养基，0.0 毫米，以及 翻转图像保持其余所有设置为默认值。</li>
		<li>点击 开始 开始扫描。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据供应商方案，使用3D细胞活力检测法评估并量化细胞活力。</li>
	<li>根据试剂盒说明书，使用BCA法测定并定量细胞蛋白。</li>
</ol>
3. 肿瘤接种用 MCS 的选择
注意：在将MCS接种到球体微孔板中，并通过定期更换完全培养基培养2-3周后，应选择具有以下合适特征的MCS用于肿瘤接种。
<ol>
	<li>在显微镜下观察多细胞球体（MCS）的形态，选择呈圆形、整体边缘光滑但具有5-10个粗糙出芽（如图2F中的箭头所示）且直径在700-800 µm范围内的MCS。</li>
	<li>检测iRFP荧光信号（参见步骤2.2），选择荧光信号强度在平均值一个标准差范围内的MCS。</li>
</ol>
4. 肺内MCS接种
注意：在接触动物前，使用70%异丙醇喷雾清洁手术台和器械。手术过程中，术者应全程佩戴无菌手套。
<ol>
	<li>通过腹腔注射每只小鼠 80 mg/kg 的氯胺酮和 12 mg/kg 的赛拉嗪进行麻醉；用镊子轻夹小鼠足部以确认其完全麻醉。</li>
	<li>皮下注射 0.05 mg/kg 的盐酸布托啡诺以减轻疼痛。</li>
	<li>在眼睛上涂抹眼用软膏以防止干燥。</li>
	<li>将小鼠以仰卧位置于红外加热垫上，并用胶带固定四肢使其处于伸展状态。 
	注意：在整个手术过程中需持续为麻醉状态的小鼠提供保温支持。</li>
	<li>使用棉签交替擦拭碘液和酒精对背部皮肤进行消毒，每种溶液至少擦拭三次。</li>
	<li>使用手术剪在左侧背部做一道 0.5–1 cm 的切口（图 1B）。用镊子小心分离肌肉和脂肪组织，直至可见胸壁及肺部运动。</li>
	<li>使用移液器将一个选定的 MCS 从微孔板转移至含有冰冷 PBS 的玻璃培养皿中。</li>
	<li>将一根 20 G 针头连接至 100 µL 玻璃注射器上，预先在冰上冷却，并吸取 20 µL 预冷的 PBS 与 Matrigel 混合液（体积比 1:1）。</li>
	<li>用该注射器迅速从培养皿中吸取一个 MCS，尽量减少 PBS-Matrigel 混合液体积，并使 MCS 保留在针头的金属部分。 
	注意：紧握注射器和推杆，防止 MCS 从针头滑出。</li>
	<li>将针头垂直插入两根肋骨之间约 3 mm 深度，缓慢注入含有 MCS 的全部 20 µL PBS 和 Matrigel 混合液。 
	注意：插入时避免用力过猛，以防损伤肺、血管或心脏。</li>
	<li>小心拔出针头，并在伤口处涂抹三重抗生素软膏。</li>
	<li>使用手术夹闭合切口，夹子将在术后 2 周移除。 
	注意：不要缝合切口，因为缝线可能干扰荧光成像。裸鼠术后可自然愈合。</li>
	<li>将动物置于红外加热垫上，并用实验室擦拭纸覆盖以维持体温。监测动物至少 30–60 分钟，直至其苏醒并能正常活动。</li>
	<li>术后前 48 小时内，每 8 小时皮下注射一次 0.05 mg/kg 的盐酸布托啡诺以减轻疼痛。</li>
</ol>
5. 术后监测
<ol>
	<li>每3-4天测量一次体重。</li>
	<li>每3-4天使用小动物成像系统在700 nm通道下检测肿瘤异种移植体的iRFP荧光信号，小鼠通过吸入含1.5%异氟烷的氧气（流速：1.5–2 L/min）麻醉2–3分钟，依次采集左侧、右侧、背侧和腹侧四种体位的图像。 
	注意：将动物放入成像工作站前，应使用70%异丙醇喷雾清洁小动物成像系统。手术过程中，操作者应全程佩戴无菌手套。</li>
	<li>定量分析异种移植癌的净荧光强度 体内 使用软件（例如 Image Studio）。
	<ol>
		<li>使用一个固定的矩形（A1，200 × 125 像素作为小鼠胸部区域的采样窗口。</li>
		<li>使用 徒手功能 在矩形内描绘小鼠的轮廓（A1）并测量荧光强度（F1面积） A1.</li>
		<li>使用另一个较小的矩形（A2, 25 x 40 像素）以测量背景荧光（F2小鼠大腿区域的)</li>
		<li>使用公式（1) 以计算每只小鼠异种移植瘤的净荧光强度： 
		<img alt="净荧光强度计算公式 F1-F2×A1/A2；荧光分析公式。" src="/files/ftp_upload/66787/66787eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">     (1)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Intrapulmonary Inoculation of Multicellular Spheroids to Model Orthotopic NSCLC

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).</li>
<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+Globocan+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pathologic+classification+of+lung+cancer%3A+Relevance+for+clinical+practice+and+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials.</a> J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).</li>
<li>Ducote, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+artificial+intelligence+to+identify+tumor+microenvironment+heterogeneity+in+non-small+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers.</a> Lab Invest. 103 (8), 100176(2023).</li>
<li>Lim, Z. F., Ma, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+insights+of+tumor+heterogeneity+and+drug+resistance+mechanisms+in+lung+cancer+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 134(2019).</li>
<li>Wang, D. C., Wang, W., Zhu, B., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+heterogeneity+and+new+strategies+for+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 58, 531-546 (2018).</li>
<li>Peterson, J. K., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+pharmacology+and+in+vivo+cancer+models+in+preclinical+and+clinical+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrating pharmacology and in vivo cancer models in preclinical and clinical drug development.</a> Eur J Cancer. 40 (6), 837-844 (2004).</li>
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<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapulmonary+inoculation+of+multicellular+spheroids+to+construct+an+orthotopic+lung+cancer+xenograft+model+that+mimics+four+clinical+stages+of+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids to construct an orthotopic lung cancer xenograft model that mimics four clinical stages of non-small cell lung cancer.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. , 10.1016/j.vascn.2020.106885 106885(2020).</li>
<li>Lemjabbar-Alaoui, H., Hassan, O. U., Yang, Y. W., Buchanan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer%3A+Biology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lung cancer: Biology and treatment options.</a> Biochim Biophys Acta. 1856 (2), 189-210 (2015).</li>
<li>Detterbeck, F. C., Boffa, D. J., Kim, A. W., Tanoue, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eighth+edition+lung+cancer+stage+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The eighth edition lung cancer stage classification.</a> Chest. 151 (1), 193-203 (2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

A549-iRFP 多细胞球体（MCS）的构建是一种简单且高度可重复的实验操作，可推广应用于多种细胞系的多细胞球体形成。借助离心和胶原蛋白辅助，所生成的多细胞球体在 3–4 天内即可形成更为完整、类似实体瘤的结构。该方法可确保形成结构稳定的球状体，并在较长时间内维持其完整性，通常可持续 2–3 周甚至更久，直至出现微小的出芽现象。通过采用离心和胶原蛋白，我们实现了多细胞球体形成的标准化，从而保证了实验模型中球体的一致性和可靠性。该策略提高了实验结果的可重复性，并减少了肿瘤生长动力学的变异性，为研究肿瘤生物学特性及治疗干预提供了更为可靠的实验平台。
与传统的二维单层细胞培养相比，三维多细胞球（MCS）可生长更长时间，在本研究中至少可达6周。为了监测癌症的生长和进展，动态、长期的定量测量具有重要价值。现有的许多三维MCS检测方法在测量过程中具有破坏性，因而限制了其在长期评估中的应用。通过测量iRFP荧光信号的非破坏性方式，可实现对三维MCS中癌细胞生长的持续且长期的监测。这一特性在评估抗癌药物长期暴露效应以及捕捉癌细胞随时间动态演变过程方面尤为宝贵。A549-iRFP三维MCS发出的iRFP荧光信号与传统的类球体生长定量测量指标（包括类球体体积、细胞活力和细胞蛋白水平）表现出高度相关性。这表明荧光信号作为评估MCS中癌细胞生长的替代指标具有可靠性。iRFP荧光信号的长波长特性使其能够在小型动物体内定量检测癌症的生长与进展，这对于抗癌药物的临床前研发至关重要。
为确保该原位非小细胞肺癌模型的一致性，需谨慎选择用于肺内接种的多细胞球体（MCS）。MCS的大小和荧光强度应尽可能相似，以减少实验变异；接种较大的MCS往往会导致肿瘤进展的变异性增加。此外，控制MCS表面的粗糙程度在降低变异方面起着关键作用。某些MCS在体积增大时仍保持边缘光滑，而另一些则随着生长出现更粗糙的边缘。在我们的实验中，细胞培养2-3周后形成的完整、呈实体瘤样、边缘有5-10个出芽结构的MCS在小鼠体内能产生更均一的肿瘤生长；而那些边缘光滑、结构松散或出芽数量过多的MCS接种后则表现出更为多样的肿瘤生长模式。
在MCS转移过程中，必须非常小心地操作20 G针头。MCS应始终保持在针头斜面或金属部分内，以尽量减少可能的损伤。针头尺寸的选择是经过慎重考虑的，旨在平衡接种过程中MCS的存活率与对小鼠肺组织潜在损伤的最小化。较大的针头尺寸可能会对小鼠组织造成损伤。如果MCS卡在针头内部，或在接种后的早期观察到多个荧光点，则可能表明接种的MCS在接种过程中受到了损伤。出现这些特征的小鼠将被排除在后续研究之外，并被归类为接种失败。
基于解剖学考虑，多细胞球体（MCS）被接种至左肺而非右肺。左肺具有上下堆叠的两个肺叶，相较于具有三个并列肺叶的右肺，可提供更稳定且易于接近的靶向区域。因此，在左肺的特定区域——左上肺叶进行接种具有高度可靠性，有助于减少肿瘤发生和进展过程中的变异。
除了胸部iRFP荧光信号外，荷瘤小鼠的体重也是评估肿瘤负荷的重要佐证指标。在MCS接种后异种移植瘤进展过程中，小鼠最初表现出正常行为，包括进食、饮水以及清醒时的活动，直至约第40天，由于肿瘤负荷加重（表现为强烈的胸部iRFP荧光信号），小鼠体重明显下降，并丧失正常行为。根据人道终点指南，当小鼠体重减轻达到15–20%时实施安乐死。尽管不同批次小鼠体重下降的时间存在差异，但其与正常动物行为的丧失相一致，因此也可作为评估动物健康状况的可靠指标。
通过左侧和腹侧荧光成像，对非小细胞肺癌原位模型中的癌症进展进行主要监测，结果显示在多细胞球体（MCS）接种后，肿瘤生长一致且稳定。腹侧荧光信号的增加速度较左侧缓慢，可能原因包括：（1）注射深度；（2）在癌症晚期阶段同时存在原位肿瘤和皮下肿瘤。具体而言，MCS通过肋骨接种至胸腔内，沉积于左肺背侧表面，因此需要一定滞后时间，待MCS生长至左肺腹侧表面后方可被成像检测到。随着肿瘤的生长，其有时会延伸至胸壁内表面，使其更接近荧光扫描仪，从而在左侧成像中产生更强的信号。因此，腹侧荧光成像更能准确反映肺部肿瘤的真实情况，但通常需要更长时间才能检测到肿瘤。在完成活体（in vivo）荧光成像后，动物被处死并进行开胸解剖及离体（ex vivo）成像，这不仅证实了由MCS接种成功建立了原位肿瘤，还展示了多种解剖学特征，重现了人类非小细胞肺癌的四个临床分期。
在初步疗效研究中，两者之间存在强相关性 离体 肺部成像及 体内 荷瘤小鼠成像证实了动态成像的可靠性 体内 荧光成像方法。非小细胞肺癌的原位模型对抗癌治疗表现出可靠的响应，主要表现为肿瘤生长减缓（作为治疗有效性的关键指标）以及体重下降（作为药物毒性的关键指标）。这些反应表明该模型是评估和开发抗癌候选药物的有价值的临床前工具。该模型真实再现了肺癌的标志性特征——转移，并且更重要的是，抗癌药物顺铂能够可靠地抑制转移。在此项初步研究中，仅通过两次顺铂注射即观察到肿瘤生长减缓，提示若采用更具临床相关性的给药方案（每周一次，共四次），顺铂的抗肿瘤效果可能更为显著。 
本报告所述的非小细胞肺癌原位模型相较于多种常见的肺癌动物模型具有若干重要优势。与肺癌皮下移植模型相比，该模型为肿瘤提供了更接近真实的组织微环境；与基因工程小鼠模型相比，该模型具有更简便的实验操作流程以及更可重复的肿瘤进展过程和动物生存曲线。本模型与其他肺癌模型之间的全面比较已在我们先前的出版物中有所阐述18。与其他异种移植动物模型类似，该模型的一个局限性在于缺乏完整的免疫系统，而免疫系统是人类癌症的重要组成部分。此外，本模型中接种的多细胞球体（MCS）偶尔会在胸壁内表面形成原发性异种移植肿瘤。因此，未来的研究应纳入可轻松检测并尽量减少此类肿瘤形成的技术操作，以进一步优化该模型。此外，还将开展包含两性动物的研究，以更全面地理解非小细胞肺癌的肿瘤生物学特性及治疗反应。总之，本报告建立的小鼠原位肺癌异种移植模型是一种先进且可靠的工具，可用于模拟肺癌的进展过程并评估抗癌治疗效果。该模型在深化对非小细胞肺癌病理机制的理解以及推动相应治疗策略的开发方面具有巨大潜力。

在所有肿瘤类疾病中，肺癌不仅导致的生命损失最大，而且每年在美国新发患者数量也位居第二1。这种严重的恶性肿瘤是现代医疗面临的主要障碍之一，迫切需要更深入地理解其复杂的生物学机制，并开发更有效的治疗手段2。非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例的85%，通常会发展为实体瘤3。肺癌面临的主要挑战之一是其动态且异质性的肿瘤微环境，该微环境深刻影响着肿瘤的进展以及对治疗干预的反应4,5,6。为了更深入理解非小细胞肺癌不同发展阶段中癌细胞与其微环境之间的相互作用，亟需建立能够准确模拟NSCLC进展过程中组织学特征的精细化病理模型。
在这方面，原位动物模型为非小细胞肺癌（NSCLC）研究提供了一条颇具前景的途径。与常用的皮下异种移植模型7不同，原位模型是将癌细胞直接接种至其起源器官中。对于肺癌而言，这意味着将癌细胞直接植入肺组织8,9。因此，肺癌的原位模型能够更好地模拟原生肿瘤微环境，包括邻近组织、血管和免疫组分，从而显著提高其生理相关性和临床相关性。
三维多细胞球体（MCS）是模拟肿瘤微环境特征的另一种有前景的方法。大多数癌症的特征在于其复杂的肿瘤微环境，包括多种细胞间相互作用、细胞外基质以及氧气和营养物质的梯度分布10,11。传统的二维细胞培养缺乏足够的空间和结构复杂性，无法重现这些肿瘤特异性特征12。相比之下，适当大小的MCS具有异质性结构，包含缺氧和坏死的核心区域，不仅能够模拟肿瘤内部的微环境，还能再现阻碍药物渗透的生理屏障，而这一屏障正是抗癌治疗中产生药物耐药性的主要机制之一13,14,15。
通过结合原位动物模型和多细胞球体（MCS）培养技术，已将MCS接种至免疫缺陷小鼠，成功构建了乳腺癌和前列腺癌的原位模型16,17。本文中，我们报道了构建和表征小鼠肺癌原位异种移植模型的详细方法。该方法采用将来源于荧光标记的人肺癌细胞（A549-iRFP）的三维MCS经肺内接种18。该模型为在活体（in vivo）条件下观察肺癌进展提供了极佳的机会，其发展过程与非小细胞肺癌（NSCLC）的四个临床分期高度相似。此外，该模型中的异种移植肿瘤对临床上已确立的抗肺癌药物顺铂具有响应性。

<table><tbody><tr><td>100 &amp;micro;L 玻璃注射器</td><td>Hamilton</td><td>部件/货号 #80601</td><td></td></tr><tr><td>20 G 针头</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>14 826D</td><td></td></tr><tr><td>96孔超低吸附球体微孔板&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>15-100-173</td><td></td></tr><tr><td>A549-iRFP</td><td>Imanis Life Sciences&amp;nbsp;</td><td>CL082-STAN</td><td></td></tr><tr><td>AIN-93M 成年啮齿类动物饲料&amp;nbsp;</td><td>Research Diets, Inc.</td><td>D10012M</td><td></td></tr><tr><td>裸鼠（无胸腺裸鼠）</td><td>Charles River Laboratories, Inc.</td><td>品系编号：490；纯合子</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量试剂</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 编号：42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白</td><td>Gibco</td><td>A1064401&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Corning</td><td>MT10013CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>开源工具（https://imagej.net/ij/）</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio&amp;nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>版本号：5.2</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 编号：17033-0091-25</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 编号：50989-0161-06</td><td></td></tr><tr><td>显微镜&amp;nbsp;</td><td>Keyence</td><td>型号：BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基质胶</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey 红外成像系统 205&amp;nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>型号：9140</td><td></td></tr><tr><td>PBS 缓冲液</td><td>Corning</td><td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Pearl Trilogy 小动物活体成像系统&amp;nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>型号：9430</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素双抗溶液&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>AAJ67236XF</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 中的 ReViSP 软件&amp;nbsp;</td><td>Sourceforge 上的开源工具（https://sourceforge.net/projects/revisp/）</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>手术夹——AutoClip 系统</td><td>Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 编号：61133-6017-01</td><td></td></tr></tbody></table>

构建模拟疾病进展并预测药物活性的非小细胞肺癌原位异种移植模型

Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-Small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities

非小细胞肺癌（NSCLC）是一种致死率极高的疾病，其肿瘤微环境复杂且具有高度异质性。目前常用的动物模型通过皮下接种癌细胞悬液建立，但无法真实模拟非小细胞肺癌的肿瘤微环境。本文介绍一种小鼠原位肺癌异种移植模型，该模型通过将三维多细胞球体（MCS）经肺内接种实现。具体而言，将荧光标记的人源非小细胞肺癌细胞（A549-iRFP）在含胶原的低吸附96孔微孔板中培养3周，形成多细胞球体（MCS），随后通过肋间穿刺将球体接种至无胸腺裸鼠的左肺，从而建立原位肺癌模型。
与原始的 A549 细胞系相比，A549-iRFP 细胞系的多细胞球体（MCS）对抗癌药物的反应相似。A549-iRFP 细胞的长波长荧光信号与癌细胞生长的常见标志物（包括球形体体积、细胞活力和细胞蛋白水平）呈显著相关性，因而可实现对癌细胞生长的动态监测 体内 通过荧光成像观察。将A549-iRFP MCS异种移植瘤接种至小鼠后，该模型可靠地经历了与非小细胞肺癌（NSCLC）临床分期高度相似的疾病进展阶段，包括原发肿瘤的扩张、邻近继发性肿瘤的出现，以及癌细胞向对侧右肺和远端器官的转移。此外，该模型对标准抗肺癌药物顺铂表现出预期的毒性和减缓的肿瘤进展反应。因此，这一NSCLC小鼠原位异种移植模型可作为模拟疾病进展过程的平台，并有助于潜在抗癌药物的研发。

A549-iRFP 多细胞球体的表征 
在胶原蛋白和离心的辅助下，成功地在球形微孔板中培养了 A549-iRFP 多细胞球体（MCS）。经过约 1 周培养，当 MCS 直径达到约 500 µm 时，将 A549 和 A549-iRFP 多细胞球体暴露于多种抗癌药物和制剂中处理 3 天，随后在不含药物的生长培养基中继续培养 4 天。A549-iRFP 多细胞球体的反应模式与亲本 A549 细胞高度相似。A549 和 A549-iRFP 多细胞球体对顺铂（一种肺癌一线治疗药物）表现出相似的剂量-反应曲线和 IC50 值 (图 2A)。其他抗癌药物或制剂对 A549 和 A549-iRFP 多细胞球体的活力抑制程度也相似 (图 2B)。
通过iRFP荧光、细胞活力和细胞蛋白水平，对A549-iRFP多细胞球体（MCS）进行了长达6周的监测。MCS的体积通过基于相差显微镜图像的软件模拟进行估算，模拟形态与显微镜成像及荧光信号所观察到的形状相似(图2C)。采用三维细胞活力检测法对A549-iRFP MCS的细胞活力进行定量，并使用直径范围为350至950 µm的不同尺寸MCS对该检测方法进行了验证。在含有MCS的培养基与检测试剂的不同体积比之间，以及5分钟与10分钟不同振荡时间之间，均未观察到显著差异(补充图S1)。四种生物标志物均随时间增加而上升，在后期时间点表现出更大的变异幅度(图2D)。iRFP荧光信号与其他三种更为传统的MCS定量测量指标均表现出强相关性：与体积（Pearson r = 0.9307，p &lt; 0.0001）、细胞活力（Pearson r = 0.7666，p &lt; 0.0001）以及细胞蛋白含量（Pearson r = 0.7317，p &lt; 0.0001）均高度相关(图2E)。
小鼠肿瘤进展 
A549-iRFP 多细胞球体（MCS）在培养 2-3 周后，选取具有适当特征的样本用于肿瘤接种，这些特征包括形态、MCS 直径、边缘适当粗糙以及荧光信号（具体参数详见方案第 3 节）。肿瘤接种手术后，每 3 天测量一次荷瘤小鼠的体重，并以手术当天（第 0 天）体重为基准计算体重变化比率。手术后小鼠体重略有下降，但在 1 周内迅速恢复。在未接受治疗的情况下，小鼠体重逐渐增加，直至约第 40 天，随后一周内体重急剧下降（约 15%），根据 IACUC 指南对小鼠实施安乐死（三倍麻醉剂量：通过腹腔注射给予 80 mg/kg 氯胺酮和 12 mg/kg 赛拉嗪）(图 3A)。荷瘤小鼠每 3 天在四种体位下进行成像：左侧、背侧、右侧和腹侧。其中，左侧（肿瘤接种侧）和腹侧（可同时观察双侧肺部）被选为关键体位，用于根据公式（1）定量净荧光强度 (图 3B,C)。两个体位的净荧光强度均显示出相似的肿瘤进展趋势，其中腹侧荧光增长速度略慢于左侧。
在此原位模型中，MCS异种移植瘤的进展经历了不同阶段，与非小细胞肺癌（NSCLC）的四个临床分期相对应（图3D）18,19,20。在MCS接种后约第8天，左肺出现集中的荧光信号，表明已形成局限性肿瘤，符合临床NSCLC I期特征。至约第11天，左肺多个部位的荧光信号明显增强和/或扩散，提示存在类似NSCLC II期的肿瘤。随后，在约第18天，从腹侧观察到增强的荧光信号，提示异种移植瘤进展至类似III期的阶段。此外，解剖学检查和离体成像显示心脏表面有肿瘤生长，这是NSCLC III期的重要标志。至MCS接种后约第27天，双侧肺部均出现灌注性荧光信号，开胸解剖发现心脏、气管及主要血管中存在灌注性肿瘤生长，提示癌症已发生转移，类似于NSCLC IV期的表现。
荷瘤小鼠对顺铂的反应 
一项初步疗效研究在该原位肺癌小鼠模型上开展。肿瘤接种10天后，通过尾静脉向荷瘤小鼠注射5 mg/kg顺铂或等量生理盐水，每周一次，共注射两次。荷瘤小鼠腹侧成像结果如图所示 图4A每3-4天监测一次小鼠的体重和肿瘤荧光。与生理盐水组相比，顺铂组小鼠在每次注射顺铂后均出现显著的体重下降，但在顺铂治疗结束后的数周内逐渐恢复。 (图4B)顺铂组的净荧光强度增长趋势较生理盐水组更为缓慢 (图4C)。在末尾处 体内 荧光检测，处死动物后解剖其肺组织并进行荧光成像。经总组织蛋白量标准化后，顺铂组小鼠肺组织的荧光强度低于生理盐水对照组。 (图4E)在腹侧荧光成像中 (图 4A)，红色矩形框中的图像显示了肿瘤荧光首次在左肺和右肺均被观察到的时间点，这是Ⅳ期非小细胞肺癌肿瘤转移的关键指标。顺铂作为一线肺癌治疗药物之一，可延缓肿瘤从左肺向右肺的转移 (图 4D).
<img alt="细胞聚集和多细胞球体（MCS）研究示意图；球体微孔板、离心、药物处理阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：研究流程图。（A）将A549-iRFP细胞接种至球体微孔板中，在胶原蛋白和离心作用辅助下形成多细胞球体（MCS）。（B）将具有适当特性的A549-iRFP多细胞球体经肺内接种至小鼠左肺，构建原位肺癌异种移植模型，模拟临床环境中肺癌的四个阶段。白色注射器内含一个MCS，表示肿瘤接种；两个红色注射器表示通过尾静脉给予药物治疗。缩写：MCS = multicellular spheroid。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="3D 多细胞球体活力检测结果；浓度曲线、柱状图、时间曲线、iRFP 荧光相关性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：A549-iRFP 多细胞球体的表征。（A）A549-iRFP 多细胞球体与 A549 多细胞球体经顺铂处理 3 天后，在无药条件下生长 4 天的剂量-反应曲线（均值 ± 标准差，N = 3–4）。（B）A549-iRFP 多细胞球体经 3 天抗癌治疗（顺铂、紫杉醇或两种自主研发的药物制剂）后，在无药条件下生长 4 天的细胞活力（均值 ± 标准差，N = 3–4）。（C）通过相差显微镜（C1，比例尺 = 500 µm）、荧光共聚焦显微镜（C2）和软件模拟（C3）对代表性 A549-iRFP 多细胞球体进行 1–6 周培养后的形态学研究。（D）A549-iRFP 多细胞球体在 1–6 周内 iRFP 荧光信号、体积、细胞活力和细胞总蛋白的动态变化（iRFP 荧光和体积的 N = 10；细胞活力和细胞总蛋白的 N = 5）。（E）A549-iRFP 多细胞球体的 iRFP 荧光信号与其余三种传统生长指标（体积、细胞活力和细胞总蛋白）在 1–6 周内的相关性分析（N = 60）。（F）适用于肿瘤接种的 A549-iRFP 多细胞球体示例（比例尺 = 500 µm）。缩写：MCS = 多细胞球体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="癌症进展研究；体重变化图、荧光成像、解剖学观察结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3非小细胞肺癌原位小鼠模型中的肿瘤进展 (A) 小鼠接种肿瘤后体重变化（均值 ± 标准误，N = 5）。(B) 基于左侧成像的荷瘤小鼠净荧光强度动态变化（N = 5）。C) 基于腹侧成像的荷瘤小鼠净荧光强度动态变化（N = 5）。(D) 模拟非小细胞肺癌（NSCLC）四个临床阶段的癌症进展。左侧成像、腹侧成像、解剖学观察（黄色箭头指示肺部及心脏表面的肿瘤），以及 离体 代表性荷瘤小鼠在四个阶段的成像。该图源自 Huang 等人。18缩写：NSCLC = 非小细胞肺癌。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肿瘤生长研究；荧光、体重、肿瘤数据；图表，生理盐水组与顺铂组比较结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4荷瘤小鼠对顺铂的反应 (A) 经生理盐水或顺铂治疗后，对荷瘤小鼠进行腹侧成像（红色矩形框内的图像显示左右肺中首次可观察到肿瘤荧光的时间点）。B)生理盐水或顺铂处理后荷瘤小鼠的体重变化（均值 ± 标准误，N = 3-4）。C) 基于腹侧成像的荷瘤小鼠在生理盐水或顺铂处理后净荧光强度的动态变化（均值 ± 标准误，N = 3–4）。(D) 左右肺均显示肿瘤荧光的小鼠百分比。E小鼠处死后解剖获得的肺组织的归一化荧光强度 在体 荧光成像（均值 ± 标准误，N = 3-4） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充图 S1：不同直径的 A549-iRFP 多细胞球体的三维细胞活力检测。 (A) ~350 µm；(B) ~550 µm；(C) ~750 µm；(D) ~950 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787_Supplementary%20Figure%20S1.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本研究介绍了一种基于荧光标记A549-iRFP细胞多细胞球体肺内接种的原位非小细胞肺癌（NSCLC）模型。该模型可重现临床NSCLC分期，并对顺铂具有响应性，依据动态监测结果 体内 长波长荧光的监测

非小细胞肺癌（NSCLC）是一种致死率极高的疾病，其肿瘤微环境复杂且具有高度异质性。目前，常用的动物模型……

我们的研究致力于开发抗癌药物的纳米制剂。为了评估抗癌活性，我们通过接种多细胞球状体建立了非小细胞肺癌的模拟模型。我们旨在验证该模型复制临床分期、利用荧光成像监测药物对肿瘤进展的影响以及对治疗干预产生应答的能力。我们的目标是建立一种更具临床相关性的非小细胞肺癌模型。传统的皮下接种二维细胞悬液模型在模拟肿瘤微环境和疾病进展方面存在不足。通过采用多细胞球体和自体接种技术，我们弥补了这一差距，更真实地模拟了非小细胞肺癌的复杂性及其对治疗的反应。利用这种自养型动物模型，我们开辟了研究非小细胞肺癌肿瘤微环境以及筛选正常分子抗肿瘤活性的新途径。我们的发现为深入阐释肿瘤生物学机制以及抗肿瘤疗法的开发奠定了基础。首先，从人肺腺癌细胞或 A549-iRFP 细胞中建立三维多细胞球体（MCS）。使用含0.3%胶原蛋白的100 µL完全生长培养基，将细胞接种于96孔超低吸附圆底球状体微孔板中。在4 °C下以300 ×g离心微孔板7分钟，以促进多细胞球状体（MCS）的形成。离心后，在显微镜下观察球状体形态，以确认细胞聚集情况。每隔一天，将每孔中的 100 L 生长培养基更换为新鲜的完全生长培养基。在显微镜下观察，选择呈圆形、整体边缘光滑，但具有 5 至 10 个粗糙突起且直径适宜的类球体。检测 IRFP 荧光，选择荧光信号在平均值一个标准差范围内的多细胞球体（MCS）。在已适当麻醉的小鼠身上开始手术操作，皮下注射盐酸布托啡诺以减轻疼痛。在眼睛上涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。将小鼠置于仰卧位，并用胶带将其四肢固定于伸展位置。使用碘伏和酒精棉签交替消毒背部皮肤，每种至少擦拭三次。接着，用手术剪在动物左侧背部做一道0.5至1厘米的切口。小心使用镊子分离肌肉和脂肪组织，直至可见胸壁和肺部运动。使用移液器将一个选定的多细胞球体（MCS）从微孔板转移至含有冰冷 PBS 的玻璃培养皿中。将一根 20 号针头连接到 100 µL 玻璃注射器上，并将其置于冰上预冷。然后吸取 20 µL 预冷的 PBS 与 Matrigel 混合物。使用注射器迅速从培养皿中吸取一个微肿瘤球（MCS），尽量减少PBS/Matrigel混合液的体积，并使微肿瘤球保留在针头的金属部分。将针头轻轻垂直插入两根肋骨之间，深度约3 mm，缓慢注入含有吸取的微肿瘤球的全部20 µL混合液。然后小心拔出针头。在伤口处涂抹三联抗生素软膏。使用手术夹闭合切口，并于两周后拆除。将动物置于红外加热垫上，并用实验室擦拭巾覆盖以维持其体温。至少监测动物30至60分钟，直至其苏醒并能正常活动。使用小动物成像系统在700 nm通道下，每三至四天测量一次麻醉小鼠肿瘤异种移植灶的IRFP荧光信号。在四种体位下测量荧光：左侧卧位、右侧卧位、仰卧位和俯卧位。来自左侧和腹侧的净荧光强度均显示出相似的肿瘤进展趋势，其中腹侧荧光强度的增长略慢于左侧。

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