Name: 使用超快多普勒超声对小鼠肝脉管系统进行成像和定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 了解超快多普勒超声成像技术在小鼠肝脏脉管系统评估中的应用。该方法无需造影剂即可实现高灵敏度血流检测，为肝脏微循环研究提供精确、可重复的定量分析工具。

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我们感谢莱顿大学医学中心的 M.S. Zuurmond 制作了本文的图形插图。本实验方案源自并改编自我们先前发表的原创研究 de Haan 等人，2022 年。16. 本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议编号813839的资助；荷兰健康研究与发展组织（ZonMw）PTO 446002501项目，与CVON-PHAEDRA Impact合作；健康荷兰（Health Holland）（莱顿大学医学中心生命科学顶尖部门2020年PPS-Match项目），项目编号NV-STAB；诺和诺德基金会干细胞医学中心，由诺和诺德基金会资助（NNF21CC0073729）；以及欧洲创新理事会EIC先锋计划项目MICROVASC的资助。&#176; 101070917；法国国家科研署 ANR-17-T171105J-RHUS-0009 项目 RHU Quid-Nash；法国国家科研署 ANR-22-CE19-0034-03，项目 Peri-fUS；以及法国国家健康与医学研究院（INSERM）生物医学超声技术研究加速器。

所有动物实验均在欧洲立法（指令 2010/63/EU）和荷兰政府指南的框架下进行，并经莱顿大学医学中心动物伦理委员会批准。
1. 小鼠UFUS成像前准备（耗时约10分钟）
<ol>
	<li>成像设备的准备
	<ol>
		<li>将超声耦合剂分装于50 mL离心管中，在100 × g 条件下离心3–5分钟，以防止气泡产生。</li>
		<li>打开加热垫并预热至35 °C。用去离子水注满3D打印的水箱。 
		注意：水中的气泡或微小颗粒可能干扰多普勒测量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物麻醉
	<ol>
		<li>称量动物体重。选用8–16周龄、体重19–32 g的雄性和雌性同窝小鼠。配制麻醉混合液，其中氯胺酮剂量为100 mg/kg，赛拉嗪剂量为10 mg/kg，溶于0.9% NaCl溶液中。每日新鲜无菌配制，因该混合液不稳定，可能随时间失去活性。 
		注意：推荐动物体重范围为23–30 g。</li>
		<li>使用纱布和70%乙醇对注射部位（即腹部右下或左下象限）进行消毒。使用27G针头配合1 mL一次性注射器或30G胰岛素注射器，按10 µL/g体重剂量行腹腔内&#160;(ip)注射。</li>
		<li>将动物放回笼中，置于加热垫上，但不要关闭笼盖。启动计时器。 
		注意：深度麻醉应持续约40分钟。若需更长的成像时间，可考虑使用可逆性麻醉方案，例如氯胺酮60 mg/kg与美托咪啶0.4 mg/kg溶于0.9% NaCl溶液中，随后皮下注射阿替美唑1 mg/kg进行逆转。由于成像装置的限制，优先选择注射麻醉而非吸入麻醉。</li>
		<li>检查麻醉效果。约5分钟后，轻捏后肢足掌以确认麻醉是否生效。若动物仍有反应，需再等待2–3分钟以达到完全麻醉状态。</li>
		<li>涂抹眼用软膏，防止动物深度睡眠期间角膜干燥及眼部损伤。再次检查反射情况，仅当动物对捏压无反应时方可开始实验操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像区域的准备（图1）
	<ol>
		<li>将动物置于加热垫上，使用兽用剃毛器轻柔修剪腹部毛发。操作过程中应极其轻柔，避免对胸腹部施加压迫。</li>
		<li>涂抹脱毛膏，作用时间不超过2分钟。 
		警告：切勿延长脱毛膏的孵育时间，以免引起皮肤炎症。这不仅会影响成像质量，还可能给动物带来不适。</li>
		<li>用纸巾擦除脱毛膏，并用温水轻轻清洁皮肤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>摆放动物及设置成像装置以进行多普勒测量（图2A）。
	<ol>
		<li>将动物背位放置于加热垫上，使用胶带轻柔固定四肢。用少量温水润湿皮肤。</li>
		<li>使用20 mL注射器将经离心处理的超声耦合剂直接涂抹于去毛皮肤表面。 
		注意：气泡可能影响多普勒成像并导致伪影。</li>
		<li>将装满水的3D打印水箱置于动物上方。确保水箱高度适宜，距离动物体表约1 mm，不得压迫动物。</li>
		<li>检查超声耦合剂与水箱的聚甲基戊烯热塑性塑料（PMP）之间是否存在空气间隙。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 探头操作与平面选择（用时约 10 分钟）
<ol>
	<li>启动软件并在系统上创建实验会话。启动扫描软件。 
	注意：扫描软件已集成在系统中。</li>
	<li>通过单击来居中电机 是 在弹出窗口中。使用电机系统通过扫描软件远程控制探头。通过将电机归中，探头将自动沿三个方向移动，即垂直、横向和旋转方向。确保无任何物体阻碍探头运动轨迹，以免损坏设备。 
	注意：必须将电机居中；否则可能导致软件功能异常。</li>
	<li>通过选择创建一个新的实验会话 环节 从菜单中选择。在会话面板中填写所需信息，包括项目、受试者、会话、用户名、备注和标签。点击 验证. 
	注意：在采集或保存成像数据之前，必须先创建会话。实验过程中可以更改会话信息，但需注意这将同时改变数据的保存路径。</li>
	<li>将探头定位。通过一个由四轴电机模块组成的电动系统，将具有128个元件的线性15 MHz超声探头连接至系统，该模块包含三个平移方向和一个旋转方向的运动。
	<ol>
		<li>进入移动探头菜单，使用计算机控制的定位系统将探头移入3D打印水箱中的水中。利用探头位置中所示的控制按钮来移动电机，设定平移运动（X、Y 和 Z）的步长单位为毫米（mm），或旋转运动（R）的步长单位为度（°）。为防止Z方向发生意外，需在安全设置中定义Z轴限位。 
		注意：探头的元件必须与水接触，但切勿将探头完全浸入水中，以免损坏设备。如果电机无法到达指定位置，将显示“超出工作空间”警告。</li>
		<li>通过点击保存坐标作为参考位置 设为首页请勿同时修改平移和旋转，因为R相对于X、Y和Z而言。始终先单击 设为首页 在修饰 R. 之前</li>
		<li>定义成像和可视化参数。进入实时成像视图菜单并点击 播放 选择感兴趣的平面。 
		警告：仅当超声探头元件被声阻抗匹配的介质包围时，才可启动实时成像或数据采集，以确保设备使用寿命并防止过热。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在预设中选择成像参数。
	<ol>
		<li>加载一个10 ms的多普勒超敏感超声序列 加载序列 例如，使用 11 个合成的平面波（角度范围从 -10° 到 10°），成像电压为 25 V，多普勒帧率为 10 ms。 
		注意：在分析过程中，无需使用快速多普勒序列（例如 10 ms）来成像和滤除器官的呼吸运动。</li>
		<li>将成像深度定义在1 mm至50 mm之间，最大可成像深度为50 mm。默认设置为从1 mm到10 mm，深度为9 mm，推荐深度范围为2 mm至12 mm。 
		注意：根据动物大小和水箱尺寸，成像深度可针对特定需求进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择可视化参数。
	<ol>
		<li>选择 多普勒 用于成像血管系统。 
		注意：A.U. 中的像素强度代表血容量，仅在使用相同探头和序列时方可进行比较。</li>
		<li>选择 平均 用于应用时间平均法以优化信噪比。 
		注意：对图像进行时间平均处理可提高图像质量，但会降低帧率。应根据具体目标权衡选择合适的折中方案。</li>
		<li>选择图像压缩方式：对数压缩（高）、平方根压缩（中）或线性压缩（低）。或者，使用高对比度和低对比度滑块，自动或手动调整对比度范围。 
		注意：图像压缩方式的选择不会影响数据，仅影响实时成像的显示效果。</li>
		<li>选择 颜色图 通过检查从黑色到白色的色阶 灰色 选项或通过检查从红黑色变为黄色 热.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>平面选择（图2B)
	<ol>
		<li>根据解剖标志选择成像平面。在多普勒模式与B模式之间切换，以熟悉肝叶及血管的解剖结构。</li>
		<li>通过点击停止实时视图 停止 图标。</li>
		<li>进入“移动探头”菜单以移动探头，并通过点击选择一个平面 设置为主页 保存坐标作为参考位置。确保血管树结构清晰可见，并尽量减少平面外信号。</li>
		<li>返回菜单“Live view”并点击 停止 图标。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 多普勒扫描采集（用时约 20 分钟）
<ol>
	<li>以 10 ms 帧率启动多普勒采集。
	<ol>
		<li>进入 fUS 2D 菜单，在特定位置成像血流动力学随时间的变化（图 3）。为增强对比度，通过尾静脉静脉内（iv）注射 50 µL 浓度为 2 × 108 个微泡/mL 的微泡团注。</li>
		<li>在预设选项卡中，设置总记录时长（秒）（30 s）。通过将“图像间时间”设为 0 s，选择无图像间停顿的连续模式。</li>
		<li>按下 记录 按钮以开始 2D 采集。可通过按下 停止 按钮取消记录。若在采集完成前中断，可能导致数据丢失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可视化并调整已采集的记录。
	<ol>
		<li>如需调整，可在可视化选项卡中修改对比度和色图。如有需要，可通过时间功能中的滑块滚动帧来重播记录。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存数据。
	<ol>
		<li>为采集的记录命名，以 .scan 格式保存至会话文件夹中。每次记录结束后，系统将自动弹出保存数据的窗口。数据将自动保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击 预设 选项卡启动另一次采集，并从步骤 3.1.1 起重复后续操作。</li>
	<li>拆除成像装置并妥善处理实验动物。
	<ol>
		<li>进入移动探头菜单，将探头垂直上移至 3D 打印水箱外部。拆除装置和超声耦合剂，并解除动物固定。</li>
		<li>当实验设计达到终点时，实施动物安乐死；否则，请继续执行以下步骤。</li>
		<li>若计划进行纵向测量，需在动物剃毛区域涂抹适量保湿霜。</li>
		<li>将动物放回笼中，并置于加热灯下苏醒，以防低体温。在动物恢复期间需持续监测。</li>
		<li>当动物恢复正常行走后，将其放回独立通风笼架中。在分析数据集前，完成所有实验动物操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 定量分析（耗时约 1 小时）
<ol>
	<li>打开 补充文件1 中提供的分析脚本 gui_analysis.m。</li>
	<li>选择扫描图像，并在设置中设定定量参数：10 个感兴趣区域（ROI），体素大小为 2 × 2。每帧选择 40 ms 以进行多普勒积分。</li>
	<li>绘制器官的血管外围；10 个 ROI 将在清晰可见的动脉之间自动预定位，必要时可手动调整（图4A）。当对定位满意后，关闭浮动对话框。确保获得稳定的采集图像（图4B），以实现可靠的血容量计算，避免使用受明显运动伪影影响的图像（图4C）。</li>
	<li>通过自动估算 30 秒记录期间静息帧值的均值和标准差，量化 10 个 ROI 总体的平均肝血容量（单位：A.U.）（图4D）。 
	注：ROI 的强度数据表可直接复制/粘贴至电子表格文件中。</li>
	<li>在尾侧方向上，对至少另外两个层面（-0.3 mm 和 -0.6 mm）重复分析。在进行统计分析前，需完成所有采集数据的量化。</li>
	<li>检查整幅图像的强度标准差，并将整体均值（µ）加 2 倍标准差（2σ）作为截断阈值，以客观排除易受运动伪影影响的测量值（图4E）。 
	注：整幅图像估算的静息帧值的均值和标准差已在数据表的第一行提供。 
	注意：运动伪影会妨碍可靠量化，应基于对整个时间序列图像的分析进行客观识别。</li>
	<li>取每只动物在 3 个不同层面共 30 个 ROI 中所测得的平均肝血容量的平均值（步骤 4.3）（图4F）。在对每只动物的 30 个 ROI 进行平均前，使用统计分析软件中的 ROUT 检验（1%）识别异常值 ROI。为提高血容量估算的准确性，建议每只动物记录更多层面的数据。</li>
	<li>进行对照溶剂处理时，使用纱布和 70% 乙醇对注射部位（即腹部右下或左下象限）进行消毒。使用 27G 针头配合 1 mL 一次性注射器，或 30G 胰岛素注射器，腹腔注射 20 µL 生理盐水或 DMSO；或使用带圆头的可重复使用 30G 喂食针，经口灌胃给予 100 µL (羟丙基)甲基纤维素。绘制三组分别接受生理盐水或 DMSO 腹腔注射（ip）或纤维素口服（po）处理的数据（图4G）。分析过程应采用盲法，不揭示实验条件和/或所接受的处理。 
	注：对照溶剂的给予对血容量测量无影响。</li>
</ol>

Ultrafast Doppler Ultrasound for Hepatic Microvasculature Analysis in Mice

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<li>Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ultrasound+neuroimaging%3A+a+review+of+the+preclinical+and+clinical+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art.</a> Curr Opin Neurobiol. 50, 128-135 (2018).</li>
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<li>Macé, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ultrasound+imaging+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional ultrasound imaging of the brain.</a> Nat Methods. 8 (8), 662-664 (2011).</li>
<li>de Haan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Zeb2+preserves+the+hepatic+angioarchitecture+and+protects+against+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial Zeb2 preserves the hepatic angioarchitecture and protects against liver fibrosis.</a> Cardiovasc Res. 118 (5), 1262-1275 (2022).</li>
<li>Couture, O., Hingot, V., Heiles, B., Muleki-Seya, P., Tanter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+localization+microscopy+and+super-resolution%3A+A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Ultrason+Ferroelectr+Freq+Control%22%5BJournal%5D)">Ultrasound localization microscopy and super-resolution: A state of the art.</a> IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 65 (8), 1304-1320 (2018).</li>
</ol>

M. Tanter 和 T. Deffieux 是 Iconeus 的联合创始人及股东。其他所有作者均无利益冲突需要披露。

在本方案中，我们演示如何对小鼠肝脏血管系统进行非侵入性超声造影成像（UFUS）。我们详细描述了成像操作流程，包括动物处理、超声成像仪的操作以及用于计算血容量变化的数据分析方法 在体为便于超声数据的解读，我们提供了可通过超分辨率超声成像（UFUS）清晰显示的解剖结构的全面概述。此外，我们描述了一种标准化的定量分析流程，用于对血管参数进行可靠测量。在无需使用对比剂的情况下即可实现足够的分辨率，从而安全、简便地对微循环中的肝脏血容量进行定量评估。我们强调应采用标准化的解剖学术语，以避免混淆和误读，尤其是在评估微血管系统的定量测量结果时。
小鼠血管系统的超快超声（UFUS）成像此前已有报道，主要集中在神经科学领域7。与极易受呼吸运动影响的肝脏不同，脑部成像不会受到运动伪影的显著干扰。由于肝脏位于膈肌下方的解剖位置，在腹部区域脱毛时必须格外轻柔，以尽量减少对胸腹部施加的物理刺激，从而避免引起不规则呼吸。此外，确保适当的麻醉深度对于维持规律的周期性呼吸至关重要，而这一因素在后期处理步骤中相对容易校正。本研究通过应用奇异值分解（SVD）滤波器去除运动伪影6，并进一步剔除高运动帧，从而提高了UFUS的灵敏度。此处以10 ms的时间分辨率采集高帧率功率多普勒视频，使我们能够进一步可视化并测量因运动伪影导致信号峰值升高的帧中呼吸运动的影响。随后，可通过平均图像信号的快速傅里叶变换（FFT）中的峰值确定呼吸频率，并据此剔除对应于器官大幅运动的高运动帧。
在同一只动物随时间推移以及在不同体重动物之间实现可重复的超声多普勒成像，目前仍面临若干限制。首先，肝脏的位置可能受到胃部过度充盈及肠道蠕动等因素的影响。当选择左侧肝叶作为参考时，这种影响尤为显著。因此，我们建议仅在体型较大的动物中选择左侧外侧叶，而在体型较小的动物中则优先选用右侧或左侧内侧叶。其次，处于应激状态的动物可能出现剧烈的非周期性呼吸运动，导致产生难以校正的运动伪影，从而无法用于血容量计算。因此，选择合适的麻醉方式并根据体重精确调整麻醉剂量至关重要。最后，成像分辨率的限制影响了对肝脏微血管系统的可视化；即目前仅能观察到直径低至100 mm3的血管结构。
最近提出使用对比剂通过追踪微泡来获取小鼠&#160;血管系统的详细图像。该方法可实现高空间分辨率，并提供定量的血流速度测量值17。然而，在二维成像条件下，对移动的内脏器官进行微泡追踪仍然极具挑战性。
在此，我们证明了通过超快多普勒技术可获得稳定的肝脏血容量测量值，该测量值可在接受不同载体处理（通过腹腔注射或口服灌胃给药）的三组对照小鼠中成功获取。近期，此类血容量测量方法已成功应用于肝病小鼠模型。16具体而言，在电子显微镜水平上检测到血管扩张，并通过超快超声成像（UFUS）的定量测量加以证实。本研究强调了该方法的敏感性 体内 评估血管功能和定量水平的缺陷，即使在肝血管结构保持完整的情况下，该方法对临床诊断和监测也具有良好的应用前景。
综上所述，本方案可作为小鼠肝血管系统无创性定性和定量研究的指导。由于其操作无创且简便，也可用于长期的纵向随访观察。此外，该方法还有望提供对血管功能的评估。

临床前小鼠模型被广泛用于研究肝微血管疾病的发病机制及进展过程1,2。纵向随访具有优势，因为毛细血管的改变发生在炎症和纤维化出现之前的疾病早期阶段，而这些改变可能随时间推移导致肝硬化1。为了研究疾病进展，强大的成像工具对于在活体中可视化和测量血管功能至关重要。in vivo。超快多普勒超声（UFUS）是一种合适的成像方式，因其成本低、便携性强、操作简便且具备实时成像能力，同时也因其具有非侵入性和节省时间的优点3。与传统多普勒超声相比，尽管后者可能达到相似的空间分辨率，但仅限于检测较大的血流；而UFUS能够检测到血流速度低至2 mm/s（传统方法为1 cm/s），从而可探测更小血管的贡献4。UFUS通过单次声照射中采用平面波发射并实现大视野成像，提高了帧率，从而增加了可用超声图像的数量，显著提升了灵敏度5。大量时间采样有助于更好地消除来自组织的信号干扰，增强对血液散射体反射回波的检测能力，从而在无需使用对比剂的情况下提高灵敏度6。通过功率多普勒估计算法对血液散射体回波能量进行估算，可以获得一个与每个像素中血容量成正比的参数，即使血管过小而无法在图像中被分辨出来7。
超声融合超声（UFUS）具有良好的空间和时间分辨率组合，使其成为定性评估肝脏血管结构的合适工具。尽管操作超声扫描仪相对简单，但要准确导航小鼠不同肝叶的肝内血管系统，需要对肝脏解剖结构有全面的理解。近期研究已集中于利用三维显微计算机断层扫描（µ-CT）来描述小鼠肝脏解剖结构及肝血管树8,9。尽管人与小鼠肝脏之间的一些形态学差异已有明确记录10，但在啮齿类动物中开展的研究常采用适用于人类的解剖学术语，导致在四足动物背景下产生一定的混淆。即使是公认的标准化命名体系，如《兽医解剖学名词》（Nomina Anatomica Veterinaria，NVA），也缺乏关于啮齿类动物肝血管结构统一术语的充分信息11。除了啮齿类动物解剖结构记录不充分所带来的挑战外，在解读超声读数时会遇到更大的困难，尤其是在需要实现可重复操作的情况下。
在多种空间尺度上获取活体器官的无创功能性信息，对体内成像而言仍存在挑战3。高端肝脏成像技术，如计算机断层扫描（CT）、磁共振成像和血管造影（MRI/MRA）或使用聚焦波的传统多普勒成像，对于评估疾病进展至关重要，但除光声成像外，这些方法均难以捕捉大多数血流动力学信息12,13,14。超快超声（UFUS）具有高灵敏度，能够检测小血管中的缓慢血流，且不受血流速度需大于每秒一厘米的限制4,15。近期，我们基于解剖学考虑，开发了一种基于UFUS的定制化成像方法，可在血管扩张的小鼠模型中可靠地测量肝脏血容量16。
在本实验方案中，我们介绍了使用一种 commercially available 超声平台对肝脏进行非侵入性 UFUS 成像的步骤，该平台最初是为功能性脑成像而开发的。为了简化操作流程并提高信息获取效率，我们提供了带有解剖学命名的小鼠肝脏整体示意图以及完整的分析方法。此外，我们还详细展示了所获得的成像读数作为参考，标示出常见的解剖结构和解剖标志，以辅助操作者依赖的切面选择。同时，我们还包含了对肝脏血管系统的定性与定量分析的相关图示。

<table><tbody><tr><td>羟丙基甲基纤维素 HPMC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7509</td><td>0.5% HPMC</td></tr><tr><td>离心机 ZentriMix 380 R</td><td>Hettich</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管</td><td>CELLSTAR tubes</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Meditip Clean</td><td>G80215</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>本单位自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>附近药店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650-5X5ML</td><td>无菌</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>FRESENIUS KABI</td><td>010-0622-1</td><td></td></tr><tr><td>可重复使用喂食针头</td><td>FST Fine Science Tools</td><td>18064-20</td><td></td></tr><tr><td>精细尖头镊子 Dumont #5 镊子</td><td>FST Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>5 x 5 cm 纱布垫</td><td>Klinipress</td><td>175 004</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>第 9 版</td><td></td></tr><tr><td>GUI 分析脚本</td><td>Inserm</td><td>gui_analysis.m</td><td>需要 10 ms 多普勒扫描</td></tr><tr><td>加热垫 17 x 17 cm，6 W</td><td>ThermoLux Acculux</td><td>461265</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器 30G 0.30 x 8 mm，0.3 mL 和 0.5 mL</td><td>BD Microfine + Demi</td><td>25636</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮 Anesketin</td><td>Dechra</td><td>REG NL 111764</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Kimwipes KIMTECH 低尘擦拭纸</td><td>ULINE</td><td>S-8115</td><td></td></tr><tr><td>实验室封口膜 19 mm x 50 m x 0.125 mm</td><td>Stokvis</td><td>M451</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 软件</td><td>MathWorks</td><td>第 R2022b 版</td><td></td></tr><tr><td>保湿霜</td><td>附近药店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>黄色针头 30G 0.3 x 13 mm</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>眼用软膏 Oculentum Simplex</td><td>Added Pharma</td><td>220201</td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td>本单位自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>永久性实验室标记笔</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水溶液 (NaCl 0.9%)</td><td>FRESENIUS KABI</td><td>B102986</td><td>无菌</td></tr><tr><td>锐器一次性收集容器 Medical Dispo 2.5 L</td><td>APmedical</td><td>UN3291</td><td></td></tr><tr><td>无菌安全锁 1.5 mL 管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 鲁尔锁注射器</td><td>BD Plastipak</td><td>300629</td><td></td></tr><tr><td>计时器</td><td>West Bend</td><td>40053</td><td></td></tr><tr><td>修剪器</td><td>Exacta Aesculap</td><td>GT416</td><td></td></tr><tr><td>超快超声平台</td><td>Iconeus &amp;amp;&amp;nbsp; INSERM '生物医学超声' ART</td><td>Iconeus One 原型机</td><td>配备 10 ms 序列</td></tr><tr><td>超声传导凝胶 Aquasonic 100</td><td>Parker Laboratories INC.</td><td>BT-025-0037N</td><td></td></tr><tr><td>3D 打印水箱 10 x 10 x 1.5 cm 聚甲基戊烯 (PMP) 0.125 mm</td><td>GoodFellow Cambridge limited</td><td>ME311100/2</td><td>CAD 文件可应要求提供</td></tr><tr><td>赛拉嗪 Sedamun</td><td>Dechra</td><td>REG NL 10084</td><td>20 mg/mL</td></tr></tbody></table>

利用超快多普勒超声成像及定量小鼠肝脏血管系统

Imaging and Quantification of the Hepatic Vasculature of Mice Using Ultrafast Doppler Ultrasound

非侵入性 体内 血管成像是一种研究啮齿类动物疾病机制的有力工具。为了利用多普勒超声方法实现对微血管系统的高灵敏度成像，优先采用基于超快成像概念的成像模式。通过将超声成像系统的帧率提高至每秒数千帧，可将血流检测灵敏度提升至低至2 mm/s，相较于传统多普勒模式下约1 cm/s的灵敏度，显著提高了对微循环功能信息的获取能力。尽管超快多普勒超声（UFUS）成像已在神经科学领域得到应用——可通过神经血管耦合捕捉脑部活动——但在对腹部器官血管进行成像时，由于呼吸引起的较大运动，其应用面临更大挑战。肝脏在解剖位置上位于膈肌下方，尤其容易受到平面外移动和周期性呼吸运动的影响。这些伪影不仅对多普勒成像产生不利影响，还使血管结构的解剖学分析及血管参数的计算变得复杂。本文介绍了利用UFUS对小鼠肝脏血管系统进行的定性与定量成像分析。我们识别了主要的解剖学血管结构，并提供了肝脏宏观解剖的图示，将其与基于多普勒信号的深入肝脏血管解剖评估进行比较。此外，我们建立了一套可靠的定量分析流程，用于随时间动态测量肝脏微血管系统的血容量。为进一步研究提供参考，本文的定性血管分析提供了全面的概述，并为从事小鼠肝病模型研究的研究人员建议了一套标准化术语。同时，该方法也为将超声作为一种无创性辅助手段用于检测肝脏血管缺陷提供了可能。 体内 并在使用微米尺度水平解析血管异常之前，测量器官深层的功能性微血管变化 离体 组织切片染色。

根据该方案，基于解剖结构及其相应术语的标准化，可实现对肝脏血管系统的成像（图1）。为了为使用临床前肝脏模型的研究人员提出一套标准化的命名体系，我们示意图展示了小鼠腹腔内肝脏的常见位置（图1A），提供了不同肝叶的结构排列（图1B），并明确了动脉血管网络（图1C）。在具备解剖学专业知识的基础上，通过使用3D打印的水箱以减少运动伪影，进行活体超快超声（in vivo UFUS）成像（图2A）。通过将探头浸入水中，并在动物剃毛后的皮肤上直接涂抹超声耦合凝胶，以校正声阻抗。采用此设置后，由于探头不与动物运动的胸腹部直接接触，因而减少了呼吸及其他运动伪影。借此，我们成功可视化了右叶和左叶的血管结构，因其位置表浅，易于通过UFUS成像获取（图2B）。其他肝叶，如尾状叶和方叶，位于体内更深层，因此通过UFUS准确识别其肝内血管结构更具挑战性。
在阐明了血管结构解剖学指征与解释的标准化及普遍认可的重要性之后，我们对小鼠进行了多平面多普勒超声扫描，以全面概述通过对比增强超快超声成像（contrast-enhanced UFUS）所显示的肝脏血管系统图3）。我们描绘了各个肝叶的肝动脉网络，即左外侧叶（LL）、左内侧叶（LM）、右外侧叶（RL）和右内侧叶（RM）。此外，主要动脉也进行了标注，包括腹主动脉（AA）、肝动脉（HA）、左外侧肝动脉（LLHA）和右内侧肝动脉（RMHA）。需要注意的是，肝叶的相对位置可能因小肠（SM）的摆放位置和蠕动运动，以及胃（S）的充盈状态而略有差异。该增强对比的全鼠肝脏血管系统概览图，为肝脏血管结构提供了全面的图谱参考。 体内 采用超快超声（UFUS）进行肝脏成像。
准确选择解剖平面对于从一个肝叶获得定量读数至关重要。通过每张平面图手动选择10个感兴趣区域（ROI），可实现可靠的血容量测量（图4A）。为了对微循环进行可靠的血容量定量，需要稳定的图像采集，且图像平均强度的变化应尽可能小。这一点通过随时间变化的整幅图像的平均图像值（MIV）来评估（图4B），相比之下，存在显著运动伪影的记录则不符合要求（图4C）。为处理运动伪影，采用自动选择低MIV的方法，以实现对肝脏血容量测量的可靠量化（图4D），其依据是绘制整幅图像所有时间点低MIV的标准差（图4E）。对每只动物多个平面进行多普勒扫描的结果显示，在对每只动物30个ROI使用ROUT检验（1%）剔除异常值后，来自3个不同队列的小鼠内部及小鼠之间的变异均在可接受范围内（图4F）。为提高每只动物血容量估算的准确性，建议增加记录的平面数量或提高每张平面图中选择的ROI数量。此外，血容量读数可用于监测针对微血管系统的药物治疗效果。通过两种不同的给药途径给予溶媒后，我们证实其对肝脏血容量测量无影响（图4G）。这些结果表明，基因敲除或治疗干预的效果不受溶媒给药的影响，从而保证了实验设计的稳健性。总体而言，本研究提供了一种客观且可重复的定量方案，可供未来研究用于探索多种小鼠模型中的肝脏血管缺陷。
<img alt="啮齿类动物肝脏解剖图；标注了肝叶、动脉和静脉；用于教学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66789/66789fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：小鼠肝脏的解剖结构。（A）小鼠膈肌下方腹腔内肝脏位置的示意图。（B）小鼠肝脏的示意图，显示四个肝叶，即左叶、方叶、尾状叶和右叶，以及由门静脉、肝动脉和胆管组成的门管三联体。（C）肝血管系统动脉网络的示意图。图中标识了肝动脉（HA）及其分支（ramus），并提供了相应的拉丁文命名。缩写：HA = 肝动脉。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/66789fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于啮齿类动物肝脏分析及UFUS结果的便携式超声成像系统设置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66789/66789fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2小鼠肝脏血管的超快多普勒超声成像 (A非侵入性实验装置示意图 在体 成像。B) 超快超声成像（UFUS）所获取的小鼠肝脏右内侧叶、左内侧叶及左外侧叶的成像方向示意图及代表性图像。缩写：AA = 腹主动脉，LLL = 左外侧叶，LML = 左内侧叶，RML = 右内侧叶。比例尺 = 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/66789fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="器官分割 MRI，横断面，示意图；空间方位头尾向、左右向。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66789/66789fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：小鼠肝脏血管系统的代表性对比增强超快多普勒超声（UFUS）图像。 成年小鼠整个肝脏血管系统的概览，分别在右侧外侧、中位和左侧外侧三个位置，以及从头侧向尾侧的四个平面上进行成像。参考平面位于膈肌正下方的中位及左右两侧1 cm处，并包含向尾侧延伸的相同平面。缩写：AA = 腹主动脉（Aorta abdominals），HA = 肝动脉（Hepatic artery），LLL = 左外侧叶（Left lateral lobe），LLHA = 左外侧肝动脉（Left lateral hepatic artery），LML = 左内侧叶（Left medial lobe），RLL = 右外侧叶（Right lateral lobe），RMHA = 右内侧肝动脉（Right medial hepatic artery），RML = 右内侧叶（Right medial lobe），SI = 小肠（Small intestine），S = 胃（Stomach）。比例尺：1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/66789fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="生物组织中的静态平衡；包含示意图、图表和统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66789/66789fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4超快多普勒超声（UFUS）定量测量肝脏血容量 (A成年C57BL/6野生型对照小鼠膈肌下方内侧叶（ML）在平面1（对应0 mm）、平面2（-0.3 mm）和平面3（-0.6 mm）的代表性图像，每个平面选取10个感兴趣区域（ROIs）。比例尺：1 mm。30秒Power Doppler成像示意图，包含（B）稳定采集（灰色）和（C）基于整幅图像的平均像素值（任意单位，A.U.）对组织运动（红色）进行定量评估。D) 基于自动识别低强度信号（A.U.）实现随时间变化的血容量定量测量。E低强度的标准差（St. Deviation）绘图用于识别由运动伪影引起的不稳定采集（红色），以总体均值的截断值作为指示µ) 来自3个队列的动物数量（N），在生理条件下对成年C57BL/6野生型对照小鼠低强度（A.U.）的标准差（SD）进行2倍标准差（2σ）评估（灰色）。F) 定量分析 体内 随时间测量的血容量变化，通过对每个动物3个平面（即共30个ROI）进行平均，以像素强度（A.U.）表示。采用ROUT法进行离群值检测，显著性水平为1%。G给药载体类型与给药途径之间无差异。第1组（n=6）接受生理盐水腹腔注射（ip），第2组（n=3）接受DMSO腹腔注射（ip），第3组（n=6）接受纤维素口服给药（po）。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett多重比较检验，ns P &gt; 0.05。缩写：A.U. = 任意单位，DMSO = 二甲基亚砜，ip = 腹腔注射，po = 口服给药，ROI = 感兴趣区域，St. Deviation = 标准差，UFUS = 超快多普勒超声 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/66789fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件 1：超快多普勒超声（UFUS）肝脏血容量测量的定量脚本。 脚本 gui_analysis.m 提供了一个图形界面，用于自动定位血容量测量的兴趣区域（ROI）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66789/gui_analysis.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

具有高空间分辨率（100 μm）和高灵敏度的超快多普勒超声（UFUS）是一种合适的无创成像方法，可用于全面定性评估肝脏血管系统。UFUS还可实现对微血管系统的定量测量，旨在加深我们对血管疾病机制的理解。

非侵入性活体血管成像技术是研究啮齿类动物疾病机制的有力工具。为实现高灵敏度的成像……

我们的研究聚焦于利用商用超声平台对肝脏进行无创超快超声成像。该研究旨在简化成像与分析流程，提供解剖学参考，并提升对肝脏血管系统的定性与定量评估能力。本领域近期的重要进展包括超快超声技术，该技术能够检测小血管中的微小血流，通过对比剂增强灵敏度，并提高空间分辨率。这是通过平面波发射、提高帧率以及提供每个像素的详细血容量估计来实现的。目前我们领域研究中采用的先进技术包括超快超声成像和三维显微CT。这些技术结合对肝脏解剖结构的深入理解，显著提高了在小鼠模型中进行超声成像的准确性和可重复性。我们建立了一种用于小鼠肝脏血管的无创超快超声成像方案，能够在无需造影剂的情况下实现精确的血容量测量。我们的研究成果包括标准化的数据分析流程、稳健的血管参数化方法以及解剖结构的清晰可视化，确保微循环评估的准确性与可重复性。本方案无需使用造影剂即可实现无创、高灵敏度的肝脏成像，能够捕捉缓慢的血流和微小血管。通过消除运动伪影、实现标准化定量以及提供清晰的解剖结构概览，从而提高准确性，并展示精确且可重复的测量结果。首先，将已准备好的麻醉小鼠放置在加热垫上。使用兽用修剪器轻轻修剪动物腹部的毛发，注意不要对胸部或腹部施加压迫。然后。涂抹脱毛膏时间不超过两分钟。用温水轻轻擦除脱毛膏并清洁皮肤。接着，将动物背侧朝上放置于加热垫上，并用胶带轻轻固定四肢。用少量温水润湿皮肤。使用20毫升注射器，将离心后的超声传导凝胶直接涂抹于剃毛后的皮肤上。然后，将3D打印的水箱置于动物上方。检查超声传导凝胶与水箱的聚甲基戊烯热塑性塑料之间是否存在气泡，然后向水箱中加水。在完成小鼠的超快多普勒超声准备后，启动软件，在系统中创建实验会话，并启动扫描软件。在弹出窗口中点击“是”以使电机居中。要创建新的实验会话，请从菜单中选择会话。在会话面板中填写必要信息，包括项目、受试者、会话、用户名、注释和标签。点击验证。接下来，使用“加载序列”按钮加载一个持续时间为10毫秒的多普勒超敏感超声序列。将成像深度设置在1至50毫米之间，最大可成像深度为50毫米。为选择可视化参数，请选择多普勒模式以成像血管结构。选择图像压缩方法：对数、平方根或线性。或者，使用高对比度和低对比度滑块自动或手动调整对比度范围。若要选择从黑色到白色的灰度颜色映射，勾选“gray”选项；若要选择从红黑色到黄色的颜色映射，勾选“hot”选项。根据解剖标志选择成像平面。在多普勒模式和B模式之间切换，以熟悉肝脏各叶及其血管结构的解剖。点击停止图标以终止实时显示。现在，进入移动探头菜单以调整探头并选择成像平面。首先，准备动物以进行成像，并将探头置于水箱中。执行探头操作并选择成像平面，然后以 10 毫秒的帧率启动多普勒采集。进入fUS 2D菜单，以在特定位置对随时间变化的血流动力学变化进行成像。在预设选项卡中，将图像间时间设置为0秒，以选择连续模式，使图像之间无暂停，然后设定总记录时长（单位为秒）。随后，按下记录按钮以开始2D数据采集。录制结束后，按下停止按钮。为获取的录制文件命名，以便将文件以扫描格式保存到会话文件夹中。每次录制结束时，将弹出一个窗口，用于自动保存数据。打开分析脚本 gui_analysis.m。选择扫描图像，并设置 10 个感兴趣区域，体素大小为 2×2。选择每帧 40 毫秒以进行多普勒积分。然后，绘制器官的血管外围，使10个感兴趣区域（ROI）自动预置于清晰可见的动脉之间，并可根据需要手动调整。为了以任意单位量化全部10个感兴趣区域的平均肝血容量，自动估算30秒记录期间静息帧数值的均值和标准差。

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