Name: 一种诱导小鼠脑裂症以模拟大血管介导的脑血管功能障碍的视觉方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: 了解利用弹性蛋白酶在小脑延髓池单次注射诱导转基因小鼠脑血管持续扩张达三个月的方法，用于研究阿尔茨海默病与血管性痴呆的病理机制。该方法为测试改善脑血管功能障碍的治疗策略提供了可靠的动物模型。

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本研究得益于Stephanie Tam的宝贵贡献，她在协助手术方面提供了支持。我们对她提供的帮助表示诚挚的感谢。感谢美国国立卫生研究院（AG066162）对本研究的支持。

应用程序NL-F表达人生理水平淀粉样斑块的3月龄小鼠被用于本研究，尽管该系统也可用于任何啮齿类动物模型。所有动物实验均经成瘾与精神健康中心（CAMH）动物护理委员会批准（方案编号 #843），并符合加拿大动物护理委员会指南的伦理标准。小鼠在本机构内繁殖，饲养于12小时光照-黑暗循环环境中 随意摄取 自由摄取饲料和水。
1. 小脑延髓池（CM）注射操作步骤
<ol>
	<li>手术操作
	<ol>
		<li>将小鼠（APPNL-F，两性均有，3个月大）放入麻醉诱导舱中持续1分钟。 
		注意：用5%异氟烷与1%氧气混合气体冲洗麻醉舱至少1分钟。</li>
		<li>小鼠麻醉后，将其从麻醉舱中取出，放置于新的手术巾上，并通过鼻罩给予异氟烷（2.5%-3%）维持麻醉。 
		注意：通过夹捏脚趾检查麻醉深度，确保无反射反应。</li>
		<li>涂抹眼药膏以防止角膜干燥。随后，在切口部位皮下注射0.1 mL布比卡因（局部麻醉药；1-2 mg/kg，0.125%，稀释比例为1:2）和美达克（镇痛药；5 mg/kg，稀释比例为1:10）。在手术前皮下注射0.5 mL生理盐水以维持动物体液平衡，补偿术中可能发生的失血。</li>
		<li>为获得清晰的切口视野，剃除枕骨基底部的颈部毛发，用无菌PBS擦拭皮肤表面，并将动物俯卧位固定于立体定位仪上。 
		注意：确保通过立体定位仪的鼻罩持续维持麻醉。</li>
		<li>将立体定位仪的鼻杆置于小鼠鼻部上方以提供稳定性，并确保上排牙齿被牢固固定。</li>
		<li>将动物头部调整至与身体呈120°角，以抬高并拉伸颈背部，暴露目标手术区域。</li>
		<li>使用碘伏溶液擦拭手术区域3次，70%乙醇擦拭3次，再用碘伏溶液擦拭1次，每次均使用无菌2英寸×2英寸纱布进行。 
		注意：手术前操作者手套及器械应保持无菌，切口区域也应覆盖无菌手术巾。</li>
		<li>使用手术刀做一小切口（1 cm）。 
		注意：此切口应暴露颈部背侧中线。</li>
		<li>沿中线小心使用手术刀切开肌肉组织，然后用镊子轻柔地将肌肉向左右两侧分离。 
		注意：应暴露出位于颅底下方的延髓池（呈倒三角形）（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>弹性蛋白酶溶液的配制 
	注意：订购的弹性蛋白酶（粉末状）每瓶含250单位（U）。每只动物注射量为2.5 µL，其中所含弹性蛋白酶活性应为15毫单位（mU）。
	<ol>
		<li>首先计算需注射溶液的浓度。 
		浓度 = 质量 / 体积 
		=&#160;15 mU / 2.5 µL 
		=&#160;6 mU/µL 
		因此，所需浓度为6 mU/µL。</li>
		<li>弹性蛋白酶总量为250 U，而本研究使用毫单位（mU），需将单位换算为毫单位，即250000 mU。</li>
		<li>已知质量为250000 mU，目标浓度为6 mU/µL，计算需加入多少体积的PBS以稀释弹性蛋白酶并维持该浓度。</li>
		<li>使用上述公式，重新整理以求解体积： 
		体积 = 质量 / 浓度 
		= 250000&#160;mU / 6 mU/µL 
		&#8203;=&#160;41666.67 µL</li>
		<li>由于41666.67 µL难以移液操作，可将其除以1000换算为毫升，得41.66667 mL，即配制成1×溶液。
		<ol>
			<li>为提高溶液浓度，可配制成10倍或100倍浓缩液。</li>
			<li>建议配制10×溶液，因其更便于操作（见下文）。 
			&#8203;10×溶液 ---------- 4.166667 mL（浓缩液）</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将250 U弹性蛋白酶加入5 mL离心管中，再加入4.167 mL无菌PBS，配制成10×储存液。 
		注意：应在无菌生物安全柜内配制弹性蛋白酶溶液以保持无菌状态。</li>
		<li>用移液器取10 µL储存液，分装至100个离心管中，共消耗4.167 mL储存液，每管10 µL。将分装管储存于-20 °C冰箱中。</li>
		<li>将剩余的储存液按每管100 µL分装至离心管中，储存于-20 °C冰箱。 
		注意：该溶液在-20 °C下可稳定保存长达6个月，且活性无明显下降。此外，需注意反复冻融会降低弹性蛋白酶的稳定性。因此，为避免此问题，可在冷冻前将储存液分装，确保每次仅需解冻一份用于注射。</li>
		<li>解冻一支含10 µL 10×溶液的分装管后，加入90 µL无菌PBS，得到100 µL的1×工作液。</li>
		<li>若解冻的是含100 µL 10×溶液的分装管，则加入900 µL PBS，得到1000 µL的1×溶液。两种工作液均可在4 °C下保存1周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向延髓池注射
	 
	注意：在装载弹性蛋白酶前，需先用移液器吸取蒸馏水5次、乙醇5次、再用蒸馏水5次，清洗Hamilton注射器。
	<ol>
		<li>用Hamilton注射器吸取2.5 µL弹性蛋白酶溶液（浓度为15 mU），确保无气泡存在。</li>
		<li>将注射针斜面朝上，缓慢插入延髓池中央。 
		注意：避免刺破穿过延髓池的血管。</li>
		<li>穿刺后撤回针尖斜面，有助于释放少量脑脊液（CSF）。使用无菌棉签吸除多余脑脊液。</li>
		<li>重新将针尖斜面插入穿刺点，缓慢在1分钟内将弹性蛋白酶或对照溶剂注入延髓池，并留针1分钟，防止液体外漏。</li>
		<li>拔出针头后，使用不可吸收缝线（#4-0，3/8"针）缝合切口，并关闭麻醉气体。</li>
		<li>将动物从立体定位仪上取下，置于设定为37 °C的加热垫上，直至其完全苏醒。 
		注意：建议术后再次给予一剂美达克，以缓解术后恢复期间的疼痛。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 硅橡胶化合物注射与组织采集
<ol>
	<li>用过量的戊巴比妥（1 mL，125–250 mg/kg）麻醉动物。 
	注意：通过夹捏脚趾确认反射消失。</li>
	<li>将动物置于尿垫上，用手术胶带固定所有四肢，使胸腔朝上。</li>
	<li>使用镊子和剪刀打开胸腔，暴露心脏。</li>
	<li>将23 G钝头针插入心脏左心室，使用微型灌注泵以含肝素（100 U/mL）的磷酸盐缓冲液（PBS）灌注4分钟，以清除血管中的血液。</li>
	<li>将缓冲液瓶更换为含有4%多聚甲醛（PFA）（溶于PBS中）的瓶子，继续灌注4分钟。</li>
	<li>在50 mL离心管中将5 mL硅橡胶化合物（黄色）与5 mL稀释剂混合，配制硅橡胶化合物溶液。使用前充分混匀。</li>
	<li>用10 mL注射器吸取10 mL硅橡胶化合物。将注射器连接至与23 G钝头针相连的软管，手动缓慢将溶液注入心脏。 
	注意：由于硅橡胶化合物黏度较高，应使用较大容量的注射器筒，否则推动活塞所需压力过大。</li>
	<li>注射后切除小鼠头部，于4 °C下过夜保存，使硅橡胶化合物在血管内充分固化。</li>
	<li>次日，小心去除小鼠颅骨（建议使用精细镊子），取出脑组织，并在4% PFA中室温（RT）孵育过夜。</li>
	<li>在PFA中孵育24小时后，用PBS洗涤脑组织3次，放入30%蔗糖溶液中，于4 °C保存。</li>
</ol>
3. 定量分析
<ol>
	<li>为获取整个大脑中威尔氏环的高质量图像（图3）：
	<ol>
		<li>将脑组织从蔗糖溶液中取出，用纸巾彻底吸干表面水分。</li>
		<li>将脑组织置于脑切片器中，并将脑切片器放置在配备相机的光学显微镜下。</li>
		<li>调节显微镜，使威尔氏环结构清晰，达到高分辨率成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用带有10 cm尺子参照的图像分析软件，测量约1 cm距离并记录对应的像素数。根据该测量结果设定1 cm比例尺，然后水平测量基底动脉的厚度以确定其直径。</li>
	<li>使用标准的像素密度分析软件对图像进行分析。利用图像分析软件在基底动脉上选取五个不同位置测量其直径（单位：厘米），取平均值以获得对基底动脉直径的准确评估。</li>
	<li>采用双因素方差分析（ANOVA）比较弹性蛋白酶组与对照组之间直径平均变化的差异。
	<ol>
		<li>使用以下公式计算直径的百分比变化21： 
		<img alt="公式1" src="/files/ftp_upload/66792/66792eq01.jpg" style="margin: auto;" /> 
		C = 相对变化量 
		X1 = 初始值（对照溶剂组） 
		X2 = 最终值（弹性蛋白酶处理组） 
		将P值小于0.05视为具有统计学显著性。所有统计分析均使用统计分析软件完成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用酒精脱水法去除硅橡胶化合物
注意：对脑组织进行脱水处理非常重要，有助于去除血管中过量的硅橡胶化合物，从而可能提高免疫染色的质量。
<ol>
	<li>用 PBS 清洗脑组织 3 次，以去除蔗糖。</li>
	<li>将脑组织依次置于 25%、50%、75%、95% 和纯乙醇中，每个浓度处理 24 小时，共需 5 天。</li>
	<li>组织脱水后，将其置于水杨酸甲酯（浓度 ≤100%）中 12–24 小时。乙醇和水杨酸甲酯有助于去除组织中多余的硅胶。</li>
	<li>用 PBS 清洗脑组织 3 次，以去除残留化学物质，随后在新鲜 PBS 中于 4&#160;°C 条件下摇床上孵育过夜。</li>
	<li>将脑组织置于蔗糖溶液中，并在 4&#160;°C 保存，以备后续切片和免疫染色使用。</li>
</ol>
5. 免疫组织化学染色
<ol>
	<li>脑组织切片
	<ol>
		<li>免疫切片前，让脑组织在装有蔗糖的离心管底部充分沉降。</li>
		<li>使用冰冻切片机（microtome）平台上的OCT包埋剂并辅以干冰冷冻脑组织，然后用切片刀将脑组织切成40 µm的切片。</li>
		<li>使用细头画笔将每个切片转移至含有冷冻保护剂的96孔板中，以防止冻结。</li>
		<li>用封口膜严密封闭96孔板，并将密封后的孔板储存在-20 °C冰箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光染色（以NeuN为例）
	<ol>
		<li>将切片放入24孔板中，用PBS洗涤3次，以去除冷冻保护剂。</li>
		<li>为防止非特异性结合，使用含2%山羊血清、0.1% Triton-X 100和1% BSA的封闭液在室温下孵育1小时。</li>
		<li>所有组分均用PBS配制。 
		注意：所用一抗为单克隆小鼠抗NeuN抗体，稀释比例为1:500；所用二抗为多克隆山羊抗小鼠568抗体，稀释比例为1:200。</li>
		<li>将单克隆小鼠抗NeuN抗体用上述封闭液进行稀释。</li>
		<li>将稀释后的一抗加入各孔中，4 °C避光孵育过夜。</li>
		<li>一抗孵育结束后，用PBS洗涤切片3次；将多克隆山羊抗小鼠568抗体用相同的封闭液稀释。</li>
		<li>将稀释后的二抗加入各孔中，在室温下避光孵育2小时。</li>
		<li>二抗孵育结束后，用PBS洗涤切片3次。</li>
		<li>使用细头画笔缓慢将切片转移至载玻片上，准备封片，待所有切片自然干燥。</li>
		<li>切片干燥后，每片加入125–150 µL抗荧光淬灭封片剂，轻轻盖上盖玻片。</li>
		<li>将载玻片置于室温、避光环境中干燥24小时，用指甲油密封盖玻片边缘，然后使用成像软件采集荧光图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Dolichoectasia: Vascular Dementia and Alzheimer&#39;s Disease Models

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</ol>

不存在利益冲突。

本文展示了一种改进的脑血管扩张方案，提供了一种精确且简便的小鼠小脑延髓池内弹性蛋白酶注射方法。该解剖位点是脑脊液的直接通路，为研究多种神经系统疾病提供了有价值的途径。这种改良技术的主要优势之一在于，仅需向小鼠小脑延髓池注射单次剂量的弹性蛋白酶，即可引起大血管的扩张并维持至少3个月，无需重复注射或植入导管。将弹性蛋白酶应用于阿尔茨海默病（AD）小鼠模型是另一项显著优势，尤其有助于加速脑内淀粉样斑块的沉积。通常情况下，AD模型如AppNL-F小鼠（本研究中所用）在6月龄时才出现斑块形成28。本研究选择该模型，是因为这些小鼠在正常衰老条件下可自然表现出类似人类的淀粉样蛋白沉积。在3月龄时向小脑延髓池注射弹性蛋白酶，可通过减少脑血流量16以及增加血脑屏障破坏12,13，从而加重AD病理变化。
需要注意的是，向小脑延髓池内注射物质可能会受到脑脊液压力的阻碍。为解决这一局限性，我们建立了一种旨在尽量减少其影响的方法，同时认识到我们无法完全消除脑脊液（CSF）对弹性蛋白酶向脑组织递送过程的潜在干扰。弹性蛋白酶能够降解弹性蛋白，从而降低动脉僵硬度，导致动脉壁减弱，并使血管延长且变得迂曲29,30,&#160;因此适合作为诱导细长扩张症的干预手段。
通常，每只小鼠的脑池注射手术需要约20分钟完成。操作过程中，使用1.5%-2%异氟烷作为全身麻醉剂对小鼠进行麻醉。建议使用带有门齿固定杆和耳杆的立体定位仪，以确保手术期间小鼠头部的稳定与牢固，这是操作中精细且关键的一步。若在立体定位仪上位置放置不当，可能导致头部倾斜、给药不准确，甚至可能刺中血管。用手术刀在枕骨基底部下方轻轻切开皮肤，暴露颈部背侧正中线。随后沿正中线切开，形成整齐的切口，并使用精细镊子分离肌肉组织。该操作总体上可最大限度减少出血，有助于小鼠更快恢复。
我们选择基于先前研究20中报道的15 mU弹性蛋白酶剂量，该研究显示15 mU与25 mU剂量之间无显著差异。此外，他们指出较高浓度会导致更高的死亡率。尽管在15 mU剂量下曾报告有28%的死亡率20，但本研究采用的方法在整个实验动物群体中未出现任何死亡。在所有小鼠的整个手术过程中我们未观察到死亡，术后至术后3个月内死亡率为5-10%。然而，本研究的主要重点在于理解迂曲扩张（dolichoectasia），即大血管的扩张。这一重点使我们将基底动脉作为测量扩张程度的主要参考指标。此外，将弹性蛋白酶注射至小鼠小脑延髓池可产生广泛效应，导致大血管和小血管均发生扩张。
向任何动物的小脑延髓池注射时，必须考虑脑组织与小脑延髓池之间的距离，以避免针头损伤脑组织。由于小鼠的这一距离相对较小，我们仅将注射器针尖斜面插入小脑延髓池。为最大限度降低感染风险，操作必须使用无菌外科器械进行，并在小鼠麻醉状态下完成。术前给予布比卡因和美达康（Metacam）有助于减轻术后不适，并促进动物更快恢复。小脑延髓池位于颅底，通过无菌棉签彻底干燥手术区域可使其清晰可见。在本研究中，手术区域大小约为1 cm，这是能够清晰观察小脑延髓池的最大范围。此外，较小的切口有助于动物更快愈合。
最大限度地将药物保留在小脑延髓池腔隙中至关重要。既往研究尝试在注射弹性蛋白酶后，于注射部位放置棉签以防止药物外漏21。然而，我们对该方法的有效性存有疑虑，因为棉签具有吸水性，可能在注射后重新吸收弹性蛋白酶，从而影响其作用效果。同样，在另一项研究中20，在将弹性蛋白酶注入小脑延髓池后迅速拔出针头，这可能导致药物未能充分进入小脑延髓池腔隙，从而引起弹性蛋白酶渗漏至脑脊液中。因此，本文提出的方法首先穿刺小脑延髓池以释放脑脊液（CSF），随后在穿刺部位放置无菌棉签，吸收多余的脑脊液并减轻腔隙内压力。接着移除棉签，并将针头重新插入同一位置，向池腔内注射弹性蛋白酶，且不再重新放置棉签。此外，我们在注射后保持针头留置1–2分钟，使弹性蛋白酶有足够时间在小脑延髓池内充分扩散，之后再缓慢退出针头。需要注意的是，该技术要求操作者在穿刺小脑延髓池和缓慢注射弹性蛋白酶时，能够单手完成注射操作并稳定固定针头。同时，在注射过程中应避免损伤横跨小脑延髓池的大血管，否则可能导致术后动物出现转圈等并发症，这属于实验终点，需实施安乐死。总体而言，该方法通过单次向小脑延髓池注射弹性蛋白酶，可实现持续长达3个月的扩张效应，优于以往方法中仅观察到的2周扩张效果20,21。综上所述，该方法不仅延长了扩张持续时间，还能稳定地将弹性蛋白酶等物质直接递送至脑组织。由于其具有微创性，可有效跨越血脑屏障递送物质，因此更受青睐，且具备进一步拓展为中枢神经系统药物递送平台的潜力。

构成血脑屏障（BBB）的主要成分为脑毛细血管内衬的微血管内皮细胞1，该屏障在调控中枢神经系统与外周循环之间物质交换方面发挥关键作用。神经系统组织所需的必需营养物质可被允许通过血脑屏障进入脑内，而某些必需氨基酸（如谷氨酸）则被排出脑外，因其高浓度可对脑组织造成永久性神经兴奋性损伤2。在正常生理条件下，血脑屏障限制白蛋白3,4和凝血酶原等血浆蛋白进入脑组织，因为这些物质可能产生有害影响5,6,7。最后，血脑屏障可保护大脑免受外周循环中神经毒素的侵害，例如来自食物或环境中的异生物质1。总体而言，脑组织的损伤是不可逆的，且与神经发生水平低下相关的衰老过程8凸显了血脑屏障在保护脑组织、防止任何加速神经退行性病变因素方面的重要性。
在动脉延长扩张（或大血管扩张）中，可观察到血管弹性下降，导致血管发生形态学改变，从而使其功能受损9，并引起脑部血流减少。血流减少继而降低氧气和葡萄糖的供应，最终通过激活反应性星形胶质细胞触发血脑屏障（BBB）损伤10。当血管的内层弹力膜因动脉延长扩张而受损时11，需要血管内皮生长因子（VEGF）的反复刺激以促进血管生成。这可能导致形成渗漏性血管，并最终导致病理性血管生成，其特征是缺陷性血管的形成12。在病理性血管生成过程中，当血管出现缺陷时，机体似乎会通过上调紧密连接蛋白来启动一种代偿机制以恢复血管完整性。然而，当血管的结构完整性丧失时，这一过程可能无意中破坏血脑屏障13。这种情况可能进一步破坏血脑屏障并促进淀粉样斑块的产生14。此外，外周渗漏可引起神经炎症15，导致神经元变性和继发性记忆丧失。
从结构上看，血脑屏障（BBB）的保护作用依赖于紧密连接，这些连接可阻止外源性物质从血液进入脑组织。当允许某些物质进入脑内时，血脑屏障主要通过两种主要机制实现：被动扩散或特异性通道（如离子通道和转运蛋白）1。在阿尔茨海默病（AD）中，研究表明功能障碍的血管系统在疾病进展中起着重要作用12,13。β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块的形成和神经退行性变可由血脑屏障的破坏12,13以及脑血流紊乱16引起。在被诊断为血管性痴呆和阿尔茨海默病的老年人中，可观察到脑血流量减少17,18。血脑屏障（BBB）的损伤伴随脑血流（CBF）功能障碍，可能导致脑内Aβ浓度增加，并伴有外周循环中外来物质的渗入19。
为了研究阿尔茨海默病（AD）和血管性痴呆（VaD）等神经系统疾病的发病机制，研究人员开发了能够模拟这些疾病的模型。体外模型被广泛使用，但缺乏用于深入疾病建模的生物学环境，例如多种细胞群体共存的复杂体系，因此凸显了体内模型的重要性。小鼠因其易于进行遗传操作，可产生类似人类的疾病特征（如病理变化），而被普遍采用。尽管目前已取得诸多进展，但仍需进一步优化模型，以更好地模拟诸如大血管扩张等疾病表型及其在AD中的作用。为此，我们发现了一个改进现有技术的机会，即向小鼠小脑延髓池注射弹性蛋白酶20,21。弹性蛋白酶是一种已被证实可降解结缔组织中弹性蛋白22以及紧密连接周围结构的酶23。选择小脑延髓池作为注射位点，是因为其位置紧邻脑部最大血管——Willis环。通过向小脑延髓池注射弹性蛋白酶，可破坏血脑屏障（BBB）和血管结构，降解紧密连接，并诱导血管扩张（Willis环）24,25。将该技术与AD病理小鼠模型相结合，有助于更深入理解AD中血管成分的发病机制，从而揭示这两种不同病理过程之间复杂的相互作用与影响。
既往研究已发现，部分患者同时表现出阿尔茨海默病（AD）和血管性痴呆（VaD）的病理特征，这种情况通常被称为混合性痴呆26,27。因此，阐明这两种疾病之间的相互关联机制，有助于更全面地理解这些神经退行性疾病的进展过程和临床表现，加深我们对潜在发病机制及可能治疗策略的认识。为此，我们在阿尔茨海默病病理小鼠模型（AppNL-F）中应用弹力酶，以识别其中的血管变化。

<table><tbody><tr><td>23 G 导管</td><td>University Medstore</td><td>2546-CABD305145</td><td>灌注所需&amp;nbsp;（https://www.uoftmedstore.com/index.sz）</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>University Medstore</td><td>https://www.uoftmedstore.com/index.sz</td><td>用于去除Microfil</td></tr><tr><td>聚维酮碘外科 scrub</td><td>#</td><td>https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrub</td><td>消毒</td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHW</td><td>消毒</td></tr><tr><td>布比卡因</td><td>动物设施提供</td><td>N/A</td><td>镇痛剂</td></tr><tr><td>电动剃毛器</td><td>BrainTree Scientific Inc</td><td>CLP-41590</td><td>剃除毛发</td></tr><tr><td>棉签</td><td>University Medstore</td><td>1962</td><td>用于手术（https://www.uoftmedstore.com/index.sz）</td></tr><tr><td>弹性蛋白酶</td><td>Sigma-aldrich</td><td>&amp;nbsp;E7885</td><td>用于血管扩张</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>University Medstore</td><td>39752-P016-EAAN</td><td>消毒（https://www.uoftmedstore.com/index.sz）</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td>用于标记成熟神经元</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 10</td><td>Graphpad Prism 10</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td>统计分析软件</td></tr><tr><td>哈密尔顿注射器</td><td>Sigma-aldrich</td><td>28614-U</td><td>注射弹性蛋白酶</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Amazon</td><td>https://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZ</td><td>维持体温</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>Fiji ImageJ 软件</td><td>imagej.net (USA)</td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>诱导室</td><td>动物设施提供</td><td>N/A</td><td>麻醉诱导</td></tr><tr><td>美达克</td><td>动物设施提供</td><td>N/A</td><td>镇痛剂</td></tr><tr><td>水杨酸甲酯</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6752</td><td>用于去除Microfil</td></tr><tr><td>Microfil</td><td>Flow Tech, Carver, Massachusetts</td><td>https://www.flowtech-inc.com/order/</td><td>&amp;nbsp;染料（黄色）</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 NeuN 抗体</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB377</td><td>用于标记成熟神经元</td></tr><tr><td>Olympus VS200 载玻片扫描仪及 VSI 软件</td><td>Olympus Life Science</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[downloads][id]=847254104</td><td>成像软件</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>University Medstore</td><td>PAR070.1</td><td>用于蛋白质固定&amp;nbsp;（https://www.uoftmedstore.com/index.sz）</td></tr><tr><td>灌注泵</td><td>VWR International</td><td>https://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumps</td><td>灌注所需</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>University Medstore</td><td>2580-M90-10</td><td>用于手术（https://www.uoftmedstore.com/index.sz）</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>动物设施提供</td><td>N/A</td><td>用于在手术中固定动物</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>University Medstore</td><td>22751-A9-240</td><td>用于手术（https://www.uoftmedstore.com/index.sz）</td></tr><tr><td>手术胶带</td><td>University Medstore</td><td>https://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2</td><td>将动物固定在尿布上</td></tr><tr><td>缝合线</td><td>University Medstore</td><td>2297-VS881</td><td>用于手术（https://www.uoftmedstore.com/index.sz）</td></tr><tr><td>X2 镊子</td><td>University Medstore</td><td>7731-A10-612</td><td>用于手术（https://www.uoftmedstore.com/index.sz）</td></tr></tbody></table>

一种用于诱导小鼠脑血管扩张以模拟大血管介导的脑血管功能障碍的可视化方法

A Visual Approach for Inducing Dolichoectasia in Mice to Model Large Vessel-Mediated Cerebrovascular Dysfunction

血脑屏障（BBB）是一个关键系统，可调节大脑与外周之间的选择性血液循环，例如允许必要营养物质进入大脑，同时排出过量的氨基酸或毒素。为了模拟在血管性痴呆（VaD）或阿尔茨海默病（AD）等疾病中血脑屏障如何受损，研究人员开发了新型方法以模拟血管扩张。在这些疾病状态下，受损的血脑屏障可能造成严重危害，导致血脑屏障功能失调，进而引发不利的病理性后果，影响大脑功能。我们改进了一种现有技术，使其能够直接向小脑延髓池（CM）注射弹性蛋白酶（elastase），从而诱导血管扩张，并破坏血脑屏障的紧密连接（TJ）。通过该方法，我们在多个指标上取得了优于以往技术的成果，包括稳定的血管扩张效果、降低的死亡率或改善的恢复情况，以及优化了用于标记血管以进行扩张分析的填充/造影剂——一种硅橡胶化合物——的递送效率。这种改进后的微创方法已取得令人鼓舞的结果：在注射后2周至3个月期间，小鼠大型血管持续扩张程度提高了19%–32%。这一改善与以往研究形成对比，后者仅在注射后2周观察到扩张增加。其他数据还表明，血管扩张状态可持续超过9.5个月。该扩张效应通过比较弹性蛋白酶注射组与载体对照组的血管直径得以确认。总体而言，该技术在利用动物模型研究影响中枢神经系统（CNS）的病理性疾病方面具有重要价值。

在将小鼠小心地固定于立体定位仪上并解剖肌肉后，我们成功定位到颅骨枕部下方的小脑延髓池。该解剖结构呈倒置的三角形，图中以黄色标出，位于颅底下方（图1）。为确保操作精确并防止对脑组织造成损伤，将Hamilton注射器针尖斜面的1-2 mm部分轻柔地插入小脑延髓池中。
弹性蛋白酶注射后，动物在三个不同时间点（2周、1个月和3个月）用PBS和4%多聚甲醛进行灌注。随后，使用硅橡胶化合物固定其血管，以增强血管的可视化效果，如图2所示。从形态学上观察，与接受溶剂注射的对照组相比，弹性蛋白酶诱导的扩张显示出 Willis 环周围小血管的可见性增加，以及基底动脉扩张且走行迂曲（图3）。
定量分析显示，弹性蛋白酶组与对照组之间存在显著差异，弹性蛋白酶组在注射后2周（增加32%；p值= 0.019）、1个月（增加19%；p值= 0.020）和3个月（增加20%；p值= 0.020）均观察到血管扩张（图4）。随后通过逐步提高乙醇浓度对脑组织进行脱水，再浸入水杨酸甲酯，有助于去除多余的硅橡胶化合物，从而提高了组织学染色的质量（图5）。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66792/66792fig01.jpg" /> 
图1：小脑延髓池的位置。 增强成像显示小脑延髓池与邻近颈部肌肉分离，清晰展示其相对于脑组织和颅骨结构（特别是枕骨）的位置。黄色三角形标示的小脑延髓池呈倒置三角形，有助于解剖结构的清晰呈现。比例尺：5 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66792/66792fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66792/66792fig02.jpg" /> 
图2：注射黄色染料。 采用经心灌注法对组织进行处理，以备后续组织学染色。(A) 小鼠灌注装置包括先将PBS泵入体内4分钟以清除血液，随后用PFA灌注4分钟以固定蛋白质。(B) 灌注后将染料注入小鼠左心室，可增强脑内血管的可见性，便于肉眼观察。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66792/66792fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66792/66792fig03.jpg" /> 
图3：经弹性蛋白酶和PBS注射后的大脑示意图。 图示显示，与对照组（PBS）相比，弹性蛋白酶注射后基底动脉（BA）明显扩张，且Willis环（CW）周围血管迂曲程度增加。CW，Willis环；BA，基底动脉。比例尺：3 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66792/66792fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66792/66792fig04.jpg" /> 
图4：弹性蛋白酶诱导的血管扩张在3个月内持续存在。 与PBS处理的对照组相比，在3月龄小鼠小脑延髓池单次注射弹性蛋白酶后，我们观察到显著的脑血管扩张，且该扩张效应可持续达3个月。基底动脉在注射弹性蛋白酶后的2周、1个月和3个月时进行测量。数据以均值±标准差表示；采用双因素方差分析，Sidak法进行事后检验；*p &#60; 0.019（2周），*p &#60; 0.020（1个月），*p &#60; 0.020（3个月）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66792/66792fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66792/66792fig05.jpg" /> 
图5：去除过量黄色染料后脱水脑组织的NeuN染色。 将脑组织依次置于浓度递增的乙醇和水杨酸甲酯中各24小时进行脱水处理后，使用切片机对脑组织进行切片，并对神经元标志物NeuN进行染色。图中可见，（A）&#160;未脱水脑组织中的血管结构比（B）&#160;脱水脑组织更为明显，白色箭头所示即为血管。脱水处理有助于更精确地分析这些切片，因为它减少了与血管相关的背景干扰。比例尺：3 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66792/66792fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们展示了通过化学诱导小鼠大脑大血管扩张，作为研究脑血管功能障碍的模型，该模型可用于血管性痴呆和阿尔茨海默病的建模。我们还展示了通过注射硅橡胶化合物来可视化血管系统，并为测量血管尺寸变化提供清晰的视觉指导。

血脑屏障（BBB）是一种关键系统，可调节大脑与外周之间的选择性血液循环，例如允许必要的营养物质进入……

我们的研究范围是利用转基因小鼠模型构建脑动脉延长扩张（dolichoectasia）模型，以观察血管改变对阿尔茨海默病病理的最大影响。我们能够证明，向小鼠小脑延髓池单次注射弹性蛋白酶即可导致血管扩张，持续时间长达三个月。目前对于同时患有血管性痴呆和阿尔茨海默病的个体，了解仍然十分有限。我们希望通过在这些转基因小鼠模型中诱导血管改变，来尝试理解这种混合型痴呆的发病机制，从而弥合这一研究空白。既往研究已证实，血管扩张可持续长达两周。在本研究中，我们发现血管扩张可持续长达三个月，且手术过程中的死亡率较低。在转基因小鼠模型中成功扩张大血管，为我们提供了测试药物以预防或改善阿尔茨海默病血管变化的机会。首先，将麻醉后的小鼠置于新的手术单上。在动物眼睛上涂抹眼用软膏，以防止角膜干燥。然后皮下注射美达康，随后注射0.5 mL生理盐水。在枕骨基部剃除小鼠颈部毛发，并用无菌PBS擦拭表面。将小鼠以俯卧位转移至立体定位仪中。将立体定位仪的鼻夹置于小鼠鼻部上方以提供稳定性，并确保上门齿固定牢固。将动物头部与身体呈120度角放置，以抬高并拉伸颈背部。随后，使用无菌纱布，用碘伏溶液和70%乙醇对手术区域进行三次清洁。然后用聚维酮碘溶液擦拭一次。使用手术刀做一个约1厘米的小切口，沿中线小心地移动手术刀，切开肌肉组织。用镊子轻轻将肌肉向左和向右分开，然后用 2.5 L 弹性蛋白酶装填 Hamilton 注射器，避免产生气泡。将针尖斜面向上缓慢插入小脑延髓池中心。穿刺后，小心回撤针尖斜面，以促进少量脑脊液（CSF）释放。接下来，将针头斜面重新插入穿刺部位，缓慢向小脑延髓池注射弹性蛋白酶或对照溶剂，留针一分钟以防止弹性蛋白酶泄漏。拔出针头后，使用不可吸收外科缝线闭合切口，并关闭麻醉装置。将动物从小动物立体定位仪中取出，置于37°C加热垫上，直至小鼠恢复意识。首先，将麻醉后的小鼠置于吸水垫或尿布上。轻捏小鼠脚趾以确认反射消失。使用手术胶带固定四肢，使胸腔朝上。使用镊子和剪刀小心打开胸腔以暴露心脏。将23号钝针插入心脏左心室进行灌注。然后在50 mL离心管中将5 mL硅橡胶化合物溶液与5 mL稀释剂混合。使用连接23号钝头针的软管，将10 mL混合化合物注入心脏。次日，用精细镊子轻轻去除小鼠颅骨，并将取出的脑组织置于4%多聚甲醛中，室温保存。经24小时孵育后，用PBS洗涤脑组织三次，并将其置于4°C的30%蔗糖溶液中保存。脑组织示意图显示，与PBS对照组相比，弹性蛋白酶注射后基底动脉扩张，且Willis环周围血管迂曲程度增加。与经PBS处理的对照组相比，在三个月龄小鼠的枕大池内单次注射弹性蛋白酶后，观察到明显的血管扩张，且该扩张持续了三个月。

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