Name: 卵巢皮层组织的玻璃化以达到玻璃状聚集状态 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 了解卵巢组织玻璃化冷冻技术，用于年轻女性癌症患者的生育力保存。该方法通过快速冷冻避免冰晶形成，提高卵泡存活率，已有五例成功分娩报道。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

感谢 Cara Färber 提供校对帮助；感谢 Katharina Wollersheim、Martin Mahlberg、Lea Korte 和 Jasmin Rebholz 提供技术协助。

本研究经波恩大学医院伦理委员会批准（批准号：007/09）。所有患者均签署书面知情同意书。研究组包括50名患者在冷冻保存前的人卵巢组织，平均年龄为27.4岁，详见图1。本研究所用试剂与仪器列于材料表中。
1. 加载装置的制备
<ol>
	<li>准备手术剪刀和用于定制的金属网。按照图2A所示，将金属网裁剪成25 mm × 8 mm的条状。</li>
	<li>将定制好的金属网放入灭菌容器中，高压蒸汽灭菌2小时（图2B）。灭菌后，将灭菌容器和1.8 mL离心管置于超净工作台内。</li>
	<li>开启超净工作台的紫外（UV）照射功能，在254 nm波长下照射30分钟，以实现额外灭菌。</li>
	<li>打开灭菌容器，取出金属网，并将其安装到1.8 mL离心管的管盖中，如图2C所示。盖紧1.8 mL离心管。 
	注意：上述所有组织培养操作均应在II级生物安全柜中进行。操作时应佩戴一次性实验手套（建议使用无粉手套），并用表面消毒剂清洁超净工作台台面。</li>
</ol>
2. 玻璃化冷冻液的制备
<ol>
	<li>准备一支10 mL血清移液管、一支电子移液器辅助装置，以及三个50 mL离心管，分别用于配制玻璃化冷冻溶液1（VS1）、玻璃化冷冻溶液2（VS2）和玻璃化冷冻溶液3（VS3），并记录配制日期。开启超净工作台的紫外线（UV）辐射以进行额外灭菌。</li>
	<li>配制VS1（15 mL）：向一个50 mL离心管中加入12 mL卵母细胞操作培养基（厂家已添加人血清白蛋白）、1.5 mL血清替代补充物（SSS）和1.5 mL乙二醇。</li>
	<li>配制VS2（15 mL）：向一个50 mL离心管中加入10.5 mL卵母细胞操作培养基（厂家已添加人血清白蛋白）、3 mL乙二醇和1.5 mL SSS。</li>
	<li>配制VS3：向一个50 mL离心管中加入8.5 mL卵母细胞操作培养基（厂家已添加人血清白蛋白）、5.25 mL乙二醇，并加入2.57 g蔗糖和0.75 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。具体操作详见图3。将所有溶液在3,000 rpm条件下涡旋振荡混合。 
	注意：上述所有组织培养操作均应在II级超净工作台内进行。操作时佩戴一次性实验手套（建议使用无粉手套），并用消毒剂清洁超净工作台表面。</li>
</ol>
3. 玻璃化冷冻准备
<ol>
	<li>佩戴一次性实验手套，使用表面消毒剂清洁超净工作台；建议使用无粉手套。</li>
	<li>准备一个6孔板、一个细胞筛、一把手术刀、镊子、一个2 mm活检打孔器以及两个90 mm圆底培养皿。同时准备培养基：组织移植保存液和VS1-3。将每种预冷的溶液（VS1-3）各5 mL分别移入不同的孔中，并静置30分钟，使溶液升至室温。</li>
	<li>使用自动紫外照射系统对液氮进行灭菌；或者，可将超净工作台的紫外照射时间设为120分钟以实现灭菌。</li>
</ol>
4. 组织玻璃化
<ol>
	<li>通过去除髓质来制备卵巢皮质组织。由于皮质通常比髓质更硬，因此两者容易区分并分离。
	<ol>
		<li>将卵巢皮质组织切成所需的形状（移植用10 mm x 5 mm；玻璃化冷冻前后用于活卵泡计数的为2 mm x 2 mm的组织块），如图4A所示。 
		注意：避免因用力过猛而损伤组织，操作时应小心谨慎。不同患者的组织样本可能存在差异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞筛置于含VS1的6孔板的第一个孔中。将卵巢皮质组织放入6孔板第1孔的5 mL VS1溶液中，使用细胞筛平衡5分钟。
	<ol>
		<li>随后，将带有皮质组织的细胞筛转移至含有5 mL VS2的第2孔中，平衡5分钟。最后，在5 mL VS3中平衡6分钟，如图3和表1所示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开已准备好的冻存管。用灭菌的液氮填充冻存管，并将其放入装有液氮的冷冻杜瓦瓶中。在1分钟内将组织样本加载到玻璃化冷冻装置的金属网格上（图4B、C）。
	<ol>
		<li>将加载在金属网格上的组织样本插入已准备好的基于网格的冻存管液氮中（图4D）。 
		注意：加载在金属网格上的组织快速冷冻对该方法的成功至关重要。上述所有组织培养操作均应在II级生物安全柜中进行。操作时应佩戴一次性实验手套（建议使用无粉手套），并用表面消毒剂清洁生物安全柜工作台面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 快速复温培养基的制备
<ol>
	<li>按照图5和表2中的说明配制溶液。称取快速复温液（RWS）和平衡液（ES）所需的蔗糖，并转移至离心管中。使用刻度移液管和移液器加入卵母细胞操作培养基（由生产商添加人血清白蛋白）。根据表2列出的成分加入SSS和蔗糖。</li>
	<li>盖紧管盖，置于滚动摇床中振荡至完全溶解。 
	注意：上述所有组织培养操作均应在II级生物安全柜中进行。操作时佩戴一次性实验手套，使用表面消毒剂清洁生物安全柜工作台面；建议使用无粉手套。</li>
</ol>
6. 快速升温准备
<ol>
	<li>快速复温前一天，在超净工作台中用紫外灯对耗材进行准备和去污染：准备用于快速复温系统的样本杯、用于ES、RS1和RS2的6孔板，以及快速复温后组织转运用的样本杯。将无菌一次性镊子、移液设备及其他耗材放入超净工作台中。</li>
	<li>将加热板预热至 37.2 °C。将 RWS 在 37 °C 下孵育至少 1 小时。</li>
	<li>准备一个无菌的6孔板，每孔分别加入6 mL ES和6 mL RS &#34;RS1&#34; 以及另外6 mL的RS用于 &#34;RS2&#34; 在层流工作台中。参考 图5 如需6孔板的示意图，请参见图示。在加热组织前，于室温孵育1小时。</li>
	<li>在无菌条件下，将RWS转移至无菌样品杯中，并置于加热板上。RWS应保持在37 °C。 
	注意：快速复温需要较高的复温速率。将复温系统（RWS）维持在 37 °C 对于确保第一步成功至关重要。</li>
</ol>
7. 卵巢组织的快速复温
<ol>
	<li>将含有玻璃化冷冻卵巢皮质组织的冻存管置于液氮中运输至超净工作台。在冻存管部分浸没于液氮中的状态下打开管盖。迅速将带有玻璃化组织的网格浸入RWS溶液中，并在37 °C条件下静置1分钟。 
	注意：此步骤是快速复温过程中最关键的环节，必须立即完成，不得有任何延迟。</li>
	<li>使用无菌镊子将组织转移至ES溶液中，在摇床中轻轻振荡孵育3分钟。</li>
	<li>按照图5所示，在摇床上分别于室温下用RS1和RS2各冲洗组织10分钟。</li>
	<li>将复温后的组织转移至含有5 mL组织移植保存液的无菌样品杯中，并在运输至移植部位期间保持在4 °C条件下。 
	注意：上述所有组织培养操作均应在II级生物安全柜中进行。操作时应佩戴一次性实验手套（建议使用无粉手套），并用表面消毒剂清洁超净工作台。</li>
</ol>
8. 卵泡活力的测定
<ol>
	<li>将二甲基亚砜（DMSO）于室温下放置过夜，使其呈液态。取100 µL DMSO加入一支钙黄绿素（calcein）小瓶中，混匀以溶解钙黄绿素。吸取3 µL已溶解的钙黄绿素溶液加入一支1.5 mL离心管底部，并将小瓶于-20 °C保存。</li>
	<li>将 0.007 g 胶原酶置于一个 1.5 mL 离心管中，于 -20 °C 保存。</li>
	<li>向一个1.5 mL离心管中加入997 µL DPBS至预先分装并冷冻的3 µL钙黄绿素中，重悬以溶解钙黄绿素。加入0.007 g胶原酶，配制成1000 µL工作液。</li>
	<li>使用500 µL工作液在37 °C避光条件下消化两片2 mm卵巢皮质组织碎片，消化时间90 min，置于4孔板中。分别在60 min和70 min时反复重悬溶液。最后测定卵泡活力。 通过 荧光显微镜，如图所示 图6.</li>
</ol>

Follicular Viability Assessment in Vitrified Human Ovarian Cortex Tissues

本文介绍了一种适用于临床常规的高通量人类卵巢皮质组织玻璃化冷冻方案。与卵母细胞或胚胎的玻璃化冷冻类似，该操作的成功实施需要严格遵循方案中关于玻璃化冷冻液和复温液的温度以及平衡时间的具体要求。同时，还必须符合欧盟组织指令37对空气质量和无菌性的相关规定。
玻璃化过程可形成非晶态、无定形或玻璃状状态。总体而言，玻璃化是一种多功能的技术，在多个科学与技术领域具有重要意义。玻璃化的主要优势在于其能够将组织转化为玻璃态，从而防止冰晶形成38,39,40，而冰晶的形成可能对组织完整性及其组分产生不利影响。
在冷冻保护剂（CPAs）中添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可在不影响玻璃化溶液质量的前提下降低CPA的浓度41,42。此外，与基于塑料的载体系统相比，金属网格具有更高的热导率。网格结构还有助于样品表面附着，从而确保组织样本和小块皮质钻孔样本在质量控制措施下的安全、稳定冷冻保存。若使用其他厂商的冷冻管，需预先测试金属网格的尺寸，以确保其在冷冻管盖内具有足够的稳定性与牢固抓握性，并能良好地嵌入管体中。
确保成功玻璃化冷冻的关键步骤包括将组织浸入无菌液氮中实现快速玻璃化，以及立即进行快速复温，以避免产生不良结果。在成本效益方面，与慢速冷冻程序相比，组织玻璃化冷冻的要求较低，这可能影响人员配置规划。此外，玻璃化冷冻无需购买和维护慢速冷冻所需的设备。
生物学指标和荟萃分析已证明，与慢速冷冻相比，玻璃化冷冻具有相当甚至更优的效果43。然而，玻璃化冷冻后结果的差异可能源于冷冻装置和操作方案缺乏标准化，包括所用溶液在不同研究间的差异。未来的研究应探索从玻璃化冷冻/快速复温组织中进行卵泡培养的潜力，以实现在体外监测其生长情况，这一点已在多个研究团队对小鼠卵巢组织的研究中成功实现44,45,46,47,48,49,50。
总之，卵巢组织玻璃化冷冻是一种重要的替代方法，可取代目前广泛使用的慢速冷冻方案，已有日本Suzuki51、美国Silber52和德国Sänger53报道的五例成功分娩案例支持。与市面上已有的用于细胞的玻璃化冷冻培养基和试剂盒相比，目前获得FDA/CE认证的卵巢组织冷冻系统较少，这可能限制其在临床环境中的应用。因此，建议开发获得FDA/CE认证的卵巢组织玻璃化冷冻及快速复温试剂盒和培养基30。

卵巢组织冷冻保存是生育力保存的重要选择。含有卵泡（其中嵌有卵母细胞）的卵巢组织被取出后进行冷冻保存。保存后的卵巢组织可经解冻、复温，再重新移植回患者体内。对于有活力的细胞或组织，目前有两种冷冻保存方法：慢速冷冻和玻璃化冷冻1。
玻璃化冷冻技术用于保存胚胎和卵母细胞等生物材料，其存活率优于慢速冷冻方案1,2,3,4。慢速冷冻存在一些局限性，例如冰晶的形成可能对细胞和组织结构造成损伤。然而，慢速冷冻是一种重要的低温保存方法，可实现生物样本的长期储存，其有效性已得到广泛验证5。玻璃化冷冻可诱导形成玻璃态聚集，从而防止冰晶生成6,7。从技术层面而言，玻璃化冷冻通过减少设备维护、降低操作失误风险以及缩短冷冻过程所需时间，显著简化了低温保存的操作流程8,9。在女性生育力保存中，卵巢组织冷冻保存是在癌症治疗前采取的关键措施10。多个研究团队已成功验证基于慢速冷冻方案的组织冷冻、解冻与移植概念11,12,13,14，该方法目前被视为标准方案15。
在节约资源22、卵泡存活率、DNA片段化水平以及血管生成潜能平衡等方面23,24,25,26,27，卵巢组织玻璃化冷冻被认为是一种颇具前景的替代方法16,17,18,19,20,21。日本28、美国29和德国30已成功实现临床分娩，进一步证实了该技术的可行性。
比较卵巢组织冷冻保存（OTC）的两种方案——玻璃化冷冻与标准的慢速冷冻程序——目前的荟萃分析结果部分存在冲突16。造成这一现象的原因可能有多种，因为现有的玻璃化冷冻方案差异较大。这些差异包括冷冻保护剂的选择或保护剂组合、其浓度、OTC 培养基的成分、组织碎片的大小以及用作组织载体的装置。因此，目前尚无标准化的复温程序。
由于作者发现了一种在组织处理、细胞活性、凋亡起始、促血管生成因子释放，甚至在移植后成功妊娠报告等方面均能获得令人信服结果的方法9,27，因此本文提供了该实验方案的极为详尽的描述。所述方法提供了一种有效且可靠的方案，有望推动卵巢组织玻璃化冷冻技术的标准化进程。

<table><tbody><tr><td>1.8 mL 小瓶</td><td>VWR International GmbH</td><td>479-6837</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>4 孔板</td><td>Gynemed</td><td>GYOOPW-FW04</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 管</td><td>Sarstedt</td><td>62.559.001</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Bacillol AF</td><td>Hartmann</td><td>973385</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Merck</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 I 型 A</td><td>Merck</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Cryosure DMSO</td><td>WAK Chemie</td><td>WAK-DMSO-10</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol</td><td>Dr. Franz K&amp;ouml;hler Chemie</td><td>00867288</td><td></td></tr><tr><td>DPBS CTS</td><td>Gibco Life technologies</td><td>A12856-01</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne 移液器辅助器</td><td>Starlab</td><td>S7166-0010</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>Euronda 灭菌容器</td><td>euronda</td><td>282021</td><td></td></tr><tr><td>G-MOPS+</td><td>Vitrolife</td><td>10130</td><td></td></tr><tr><td>金属筛网</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum 剪刀</td><td>world precision instruments</td><td>501262102</td><td></td></tr><tr><td>N-Bath 系统</td><td>Nterilizer</td><td>N-Bath 3.0</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)</td><td>SAGE</td><td>ART-4005</td><td></td></tr><tr><td>血清替代补充剂 (SSS)</td><td>Fujifilm Irvine scientific</td><td>99193</td><td></td></tr><tr><td>无菌杯</td><td>Sarstedt</td><td>75.562.105</td><td></td></tr><tr><td>无菌镊子</td><td>Carl Roth</td><td>KL05.1</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Merck</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

卵巢皮质组织玻璃化以实现聚集的玻璃态

Vitrification of Ovarian Cortex Tissue to Achieve a Glassy State of Aggregation

卵巢组织冷冻保存（OTC）是生育力保存的重要选择。对于无法推迟性腺毒性治疗的患者或青春期前女孩而言，这通常是唯一可行的生育保护手段。冷冻保存可通过玻璃化冷冻或慢速冷冻方法进行。目前，慢速冷冻是标准方法。越来越多的研究表明，玻璃化冷冻在先进技术条件下可取代慢速冷冻。 体外 体外受精（IVF）实验室中，显著提高了解冻后的存活率，并简化了冷冻保存的技术操作。本文描述了一种基于金属网格的高通量快速玻璃化冷冻方案，适用于临床常规应用。通过对金属网格和液氮进行灭菌处理，确保了操作过程的高质量，符合药品生产质量管理规范（GMP）标准。采用该方法可实现超快速冷却速率的玻璃化冷冻。样品未采用缓慢解冻方式，而是进行快速复温。为评估卵泡的存活能力，在冷冻保存前及快速复温后均进行了钙黄绿素（calcein）染色检测。研究报道了利用金属网格进行玻璃化冷冻与快速复温的成功应用。冷冻前与快速复温后，卵泡存活率未见显著差异。这些结果证实，组织玻璃化冷冻具有较高的临床常规应用潜力，可作为目前广泛使用的慢速冷冻法的一种潜在替代方案。

本方案介绍了玻璃化冷冻液的制备、装载装置、玻璃化冷冻、快速复温液的制备、快速复温以及卵泡活力测定的操作步骤。已有研究对慢速冷冻与玻璃化冷冻在卵泡活力及血管生成因子方面的差异进行了直接比较，并已通过验证并发表31,32。
通过比较玻璃化冷冻/快速复温前后存活卵泡的数量，评估了所述玻璃化冷冻方案的整体成功率。实验设计如图1所示，结果见图6。在50名患者中，冷冻前平均观察到77.98个存活卵泡，冷冻/快速复温后为62.99个，存活率为80.8%。根据Wilcoxon检验，差异无统计学意义33。
使用锋利的剪刀将金属网格单独裁剪至 25 mm × 8 mm 的尺寸，该尺寸可适配 1.8 mL 冻存管管盖，如图 2A、C所示。经高温蒸汽灭菌后，在超净工作台内将金属网格与 1.8 mL 冻存管的管盖进行组装，如图 2B所示。该设计可使网格在管盖中牢固固定，无需额外固定措施，并为不同大小的组织提供足够的承载面积。通常用于移植的组织块尺寸为 5 mm × 10 mm，用于快速复温后评估存活卵泡数量的组织块直径为 2 mm，上述两种尺寸均可完全贴合于金属网格上。
在层流台中，于室温下使用摇床，在6孔板中依次用玻璃化冷冻溶液（VS1、VS2和VS3）进行平衡，如图3所示。该方案中的时间设置可确保冷冻保护剂乙二醇有效进入组织。推荐使用6孔板而非单个容器，以便于组织在不同溶液间的快速转移，并有助于避免混淆。
为实现卵巢皮质组织在液氮中的快速垂直玻璃化，需先将其切割成适当大小的片段（图4A）。将卵巢皮质样本置于装载装置上（图4B、C），并垂直浸入液氮中（图4D），通过玻璃化使其达到玻璃态聚集。所选用的金属网格可实现组织的垂直操作，如图4D所示。此外，该金属网格具有高热导率，可确保温度从22 °C迅速降至-196 °C，这是玻璃化过程中的关键步骤。
为实现快速复温，将 RWS 置于无菌杯中于 37 °C 下配制。ES、RS1 和 RS2 在室温下置于 6 孔板中，并在摇床上制备，如图 5所示。大量预热的 RWS 可防止在加入玻璃化组织后溶液温度过度下降，从而在整个快速复温过程中为组织提供持续温暖的环境。
为评估并确保高质量标准，在玻璃化冷冻前及快速复温后，使用钙黄绿素对 2 mm × 2 mm 的活检组织穿孔样本进行染色，通过荧光显微镜检测卵泡活力（图6）34,35。活的卵泡在摄入钙黄绿素后，于495 nm处发出绿色荧光。 alternatively，也可使用中性红染料评估卵泡活力（Table 3）36。
通过遵循本方案中描述的步骤，卵巢组织将转变为一种玻璃态聚集状态，这有助于在快速复温后实现高存活率，荧光显微镜观察结果已证实了这一点。
<img alt="卵巢皮质样本示意图；组织培养及活检活性检测流程详图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：研究设计。 来自50名患者的卵巢皮质样本在玻璃化冷冻及快速复温前后（新鲜状态）进行了存活卵泡数量的检测。每组取两块直径为2 mm的组织样本，在进行卵泡计数前于体外培养24小时。组织经胶原酶消化后，用钙黄绿素染色以评估其活性。使用显微镜确定存活卵泡的数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用通风柜进行样品制备；实验室实验装置中的工具和安全装备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：上样装置的制备。 将金属网格切割成 8 mm × 25 mm 的尺寸（A）。定制的金属网格通过高压灭菌进行灭菌处理（B）。灭菌后的金属网格随后插入 1.8 mL 样品瓶的瓶盖中，以备使用（C）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于样品分离分析的真空过滤装置示意图，显示体积和时间变量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：玻璃化冷冻溶液的制备。玻璃化冷冻溶液（VS）配制后转移至6孔板中。各孔显示了玻璃化冷冻方案中所用每种溶液的体积及各自的孵育时间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用培养皿进行组织培养；用镊子处理样本；分子生物学方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：卵巢皮质组织的处理与玻璃化冷冻。 卵巢皮质组织经去除髓质后，被切割成 5 mm × 10 mm 的组织块（A）。在 图 3 所示的玻璃化冷冻溶液中孵育后，将组织装载至玻璃化冷冻载样装置上（B,C）。为实现卵巢皮质样本的快速垂直玻璃化冷冻，将载有组织的盖帽迅速插入无菌液氮中（D）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示洗涤和样品相互作用时间及体积的色谱装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：快速复温溶液的制备。制备快速复温溶液（RWS）、平衡溶液（ES）以及洗涤溶液（RS）1 和 2，并将其转移至 6 孔板中。图中容器及孔内标注了每种溶液的体积及其相应的孵育时间。注意，RWS 需在加热板上保持 37.2 °C。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像显示细胞聚集体，表明蛋白表达水平和实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：存活率计数。 为评估存活卵泡的数量，将直径为2 mm的组织块用胶原酶消化并用钙黄绿素染色。代表性图像显示：（A）玻璃化前回收的3个卵泡的钙黄绿素染色结果；（B）玻璃化冷冻及快速复温后回收的存活卵泡；（C）慢速冷冻前回收的存活卵泡；（D）慢速冷冻及解冻后回收的存活卵泡。卵泡的存活状态由钙黄绿素指示，这是一种绿色荧光染料，在495 nm激发下，可被活细胞内的酶转化为发出绿色荧光的产物。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>VS 1 (15 mL)</td>
			<td>乙二醇</td>
			<td>10%</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>12 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS 2 (15 mL)</td>
			<td>乙二醇</td>
			<td>20%</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>10.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS 3 (15 mL)</td>
			<td>乙二醇</td>
			<td>35%</td>
			<td>5.25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>蔗糖</td>
			<td>0.5 mol/L</td>
			<td>2.57 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PVP</td>
			<td>5 % (w/v)</td>
			<td>0.75 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>加至 15 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：玻璃化冷冻溶液（VS）的组成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RWS (30 mL)</td>
			<td>蔗糖</td>
			<td>0.8 mol/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8.22 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 30 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES (15 mL)</td>
			<td>蔗糖</td>
			<td>0.4 mol/L</td>
			<td>2.05 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS 1&amp;2 (15 mL)</td>
			<td>SSS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>ad 15 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：快速复温液（RWS）、平衡液（ES）和洗涤液（RS）的成分组成。 本表列出了在玻璃化冷冻后处理过程中所使用的快速复温液（RWS）、平衡液（ES）和洗涤液（RS）的成分及其浓度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>参数</td>
			<td>新鲜</td>
			<td>间隔</td>
			<td>玻璃化冷冻后快速复温</td>
			<td>间隔</td>
			<td>n</td>
			<td>*P-值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>卵泡存活数 [n]</td>
			<td>77.98</td>
			<td>0-386</td>
			<td>62.99</td>
			<td>0.5-349</td>
			<td>50</td>
			<td>0.130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>77.95</td>
			<td></td>
			<td>80.02</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Wilcoxon 检验</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：卵泡活力的代表性结果。 本表展示了在冷冻保存前和快速复温后的卵泡活力评估结果。每位患者取两块直径为2 mm的组织样本，用于统计玻璃化冷冻/快速复温前后存活卵泡的数量。采用Wilcoxon检验对50名患者的配对组织样本进行了分析。

介绍了一种用于卵巢组织玻璃化冷冻的方案，该方案可作为广泛使用的慢速冷冻法的一种替代性冷冻保存方法。

卵巢组织冷冻保存（OTC）是生育力保存的重要选择。对于因治疗具有生殖腺毒性而无法推迟治疗的患者，或……

我们研究团队的研究方向是年轻女性癌症患者的生育力保护。优化现有方案以提高患者日后妊娠的机会至关重要。这包括卵巢组织的玻璃化冷冻保存以及卵泡的体外培养。体外培养卵巢卵泡的关键在于卵泡分离前的多步组织培养方法，因为卵巢皮质组织非常致密，会限制卵泡的生长。组织玻璃化冷冻比慢速冷冻更为复杂，但能够简化整个流程，并具有其他优势。我们已证实，玻璃化冷冻是传统慢速冷冻方案的重要替代方法，此前已有五例成功分娩的报道支持这一结论。冷冻与解冻过程中的应激，以及再移植后血供不足和再灌注损伤，共同影响卵泡的存活，导致卵泡数量显著减少。尽管慢速冷冻法存在局限性，但玻璃化冷冻被认为在保存卵泡方面具有与之相似甚至更高的成功率。因此，我们的目标是将玻璃化冷冻技术推进到临床前应用阶段，使所有组织库均能开展组织冷冻保存，而不受任何个人或经济条件的限制。首先，将金属网切割成尺寸为25毫米×8毫米的条状。将定制的金属网放入灭菌容器中，并高压灭菌两小时。灭菌后，将灭菌容器和1.8毫升离心管置于超净工作台内。打开灭菌容器，取出金属网格。将网格安装到1.8毫升小瓶的瓶盖内，并盖紧小瓶。在获取人卵巢皮质组织后，去除髓质，并将组织切成所需的形状。向六孔板的第一个孔中加入5 mL玻璃化冷冻溶液一。使用细胞筛，将卵巢皮质组织在第一孔中平衡5分钟。将带有皮质组织的细胞筛转移至第二孔（含5 mL玻璃化冷冻溶液二），继续平衡5分钟。然后将含有皮质组织的滤网放入六孔板的第三孔中，该孔内含有5毫升玻璃化冷冻溶液三，放置6分钟。用无菌液氮填充已准备好的冷冻管，并将其放入装有液氮的冷冻装置容器中。在一分钟内将组织样本加载到玻璃化冷冻装置的金属网上。然后将金属网格放入基于网格的冷冻管中的液氮中。向无菌六孔板的第一孔中加入6毫升平衡液，再分别向第二孔和第三孔各转移6毫升复苏液（RS）。室温孵育1小时。将快速复温溶液倒入无菌样品烧杯中，在设定为 37 摄氏度的加热板上预热一小时。在超净工作台内，打开含有玻璃化冷冻卵巢皮质组织的冻存管。迅速将组织网架转移至快速复温溶液中。使用无菌镊子将组织转移至平衡溶液中，在摇床上孵育3分钟。随后在摇床上分别用RS1和RS2在室温下各冲洗组织10分钟。将钙黄绿素溶于100 µL DMSO中。取3 µL钙黄绿素加入到一个1.5 mL离心管底部，于-20 °C保存。将0.007 g胶原酶加入另一个1.5 mL离心管中，并于-20 °C保存。向已冷冻的3 µL钙黄绿素中加入997 µL DPBS，重悬并溶解钙黄绿素。然后加入冷的胶原酶粉末，制备成1000 µL的工作液。接着加入500 µL的钙黄绿素工作液，将两块直径为2毫米的卵巢皮质碎片转移至四孔板的孔中，于37°C避光孵育90分钟。最后，在荧光显微镜下评估卵泡的存活率。

vitrification-ovarian-cortex-tissue-to-achieve-glassy-state

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

卵巢皮层组织的玻璃化以达到玻璃状聚集状态

本文介绍了一种改良的被动CLARITY与三维重建方法，用于完整小鼠卵巢中卵巢血管系统及卵泡毛细血管的可视化观察。...

被动CLARITY透明化小鼠卵巢血管结构的三维重建

本文描述了一种使用实验室自制培养基在商用载体上对未成熟猫卵母细胞进行最小体积玻璃化冷冻的实验方案。该方案涵盖了从离体性腺中分离卵母细胞到玻璃化冷冻及复温的每一个步骤。...

最小体积玻璃化冷冻未成熟猫卵母细胞

介绍了牛卵巢皮质的体外培养以及营养性阶梯饮食对卵巢微环境的影响。卵巢皮质组织片段被培养七天，随后评估了类固醇激素、细胞因子及卵泡发育阶段。阶梯饮食处理促进了类固醇生成，从而在培养过程中推动了卵泡的发育进展。...

牛卵巢皮质组织培养

多个国际科学学会已将卵母细胞冷冻保存技术认定为青春期后女性生育力保存的金标准。恰当的临床与实验室策略可确保生育力保存治疗的最大有效性、效率和安全性。...

通过卵母细胞玻璃化冷冻实现生育力保存：临床与实验室视角

本方案旨在提供一种用于成年和幼年绵羊卵母细胞玻璃化冷冻的标准方法。该方案涵盖了从体外成熟培养基的制备到复苏后培养的全部步骤。卵母细胞在MII期采用Cryotop法进行玻璃化冷冻，以确保使用最小必要体积。...

绵羊成年与未成年卵巢体外成熟卵母细胞的玻璃化冷冻

一个专业的团队可以为苗勒管发育不全（Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser）患者提供在腹腔镜阴道成形术的同时进行控制性卵巢刺激和卵母细胞冷冻保存的选择。...

腹腔镜取卵与卵子冷冻保存在 Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser 综合征阴道成形术中的应用

本方案描述了一种利用酪胺交联透明质酸水凝胶包封并培养小鼠卵巢前腔卵泡的新型三维（3-D）培养模型。我们还详细介绍了通过玻璃化冷冻法进行卵巢卵泡冷冻保存的两种方法。...

一种新型透明质酸水凝胶在卵泡三维培养中的应用及小鼠卵巢卵泡冷冻保存方法

开发了一种双模成像系统，用于无接触评估皮肤组织氧合和血管功能。...

双模态成像技术用于皮肤组织氧合与血管功能检测

本文展示了一种创新的视觉方法（摄影发声法或照片引谈法），旨在为患有慢性疾病的患者在临床诊疗中实现公平的诊疗流程，揭示临床知识中的空白，建立更佳的治疗关系，并确定以患者为中心的治疗目标及促进康复的可能性。...

运用视觉与叙事方法实现临床医疗中的公平诊疗流程

本文所述的间皮清除实验利用荧光标记的细胞和延时视频显微镜技术，对卵巢癌多细胞球状体与间皮细胞单层之间的相互作用进行可视化观察和定量测量。该实验模拟了卵巢癌转移的早期步骤。...

体外 腹膜间皮清除实验：模拟卵巢癌转移早期步骤

了解卵巢组织玻璃化冷冻技术，用于年轻女性癌症患者的生育力保存。该方法通过快速冷冻避免冰晶形成，提高卵泡存活率，已有五例成功分娩报道。

卵巢皮质组织玻璃化以实现聚集的玻璃态

探索更多视频