利用κ-卡拉胶亚微凝胶介质嵌入式生物打印类组织结构

基于微凝胶悬浮浴的3D生物打印技术为利用软性水凝胶制备复杂的3D结构提供了一个多功能平台，但其打印分辨率和精度较低，仍限制了所打印产物在组织工程中的实际应用。现有的微凝胶浴通常粒径较大且分散性差，导致打印出的丝状结构直径较大且形态不规则。因此，制备粒径小、形态均一的微凝胶浴仍面临重大挑战。

本方案通过一种易于操作的机械研磨策略，制备出均匀且具有生物相容性的阳离子交联κ-卡拉胶亚微米凝胶浴，用于高保真生物打印。由于κ-卡拉胶亚微米凝胶具有均一的特性，粒径小至565纳米，且菌落状态低至0.35%，可实现精确的组织与器官构建，具有极高的保真度和分辨率。首先，将1.75克κ-卡拉胶粉末加入盛有500毫升PBS的1000毫升玻璃瓶中。

制备κ-卡拉胶悬浮液浴后，将一根70毫米的磁力搅拌子放入玻璃瓶中。拧紧玻璃瓶盖，然后将其松开半圈。将玻璃瓶置于70°C的水浴中加热。

然后以 300 RPM 的速度开启磁力搅拌器。将瓶子放置在搅拌器上，持续搅拌直至聚合物完全溶解。使用 0.22 微米滤膜，将完全溶解的κ-卡拉胶溶液过滤至已灭菌的玻璃瓶中。

将κ-卡拉胶溶液在4°C下保存12小时，以诱导阳离子交联凝胶化。然后使用60毫米磁力搅拌子，将κ-卡拉胶水凝胶进行机械研磨，直至其完全转变为液态。首先，打开微挤出泵控制器。

选择相应体积的注射器，并将挤出速率设置为 0.08 毫升每分钟。然后将水凝胶体积除以挤出速率，并结合预期打印时间，计算出挤出持续时间。接下来，将内径为 210 微米的针头安装到注射器上，并将其插入生物打印机的注射器插槽中。

调整注射器控制器，确保注射器的活塞与螺杆紧密接触。然后将3 mL制备好的κ-卡拉胶悬浮液注入35 mm细胞培养皿中。根据代码设置，将培养皿放置在平台上，并确认打印头位于培养皿底部上方1 mm处。

然后，将包含代码的SD卡插入3D生物打印机中。激活代码文件，启动生物打印机，并点击控制器上的开始按钮。接着，将打印出的结构暴露于405纳米的蓝光下照射一分钟，以启动光交联反应。

使用1 mL移液器去除κ-卡拉胶凝胶，随后加入3 mL PBS洗涤并弃去。首先，当培养的食管平滑肌细胞达到80%融合度时，吸除培养基，并用5 mL PBS洗涤平滑肌细胞。

然后向培养瓶中加入 2 毫升 0.2% 胰蛋白酶 EDTA，孵育 2 分钟以消化细胞。加入 2 毫升 DMEM 终止消化过程，并将细胞悬液转移至 15 毫升离心管中。以 675 ×g 离心 3 分钟。

小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于复合明胶甲基丙烯酰胺和丝素蛋白甲基丙烯酰化生物墨水中。生物打印完成后，用 PBS 洗涤三维食管肌层，随后小心吸除 PBS，加入 3 mL 添加 10% FBS 和 1% 青霉素或链霉素的 DMEM 培养基。