Name: 改良 Langendorff 灌注延长啮齿动物心脏移植物的灌注时间 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 了解改良Langendorff灌注技术，通过降低灌注压力至30-35毫米汞柱，延长啮齿动物心脏移植物的灌注时间并维持其功能。该方法为心血管研究和移植保存提供了优化方案。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（K99/R00 HL1431149；R01HL157803）和美国心脏协会（18CDA34110049）向 S.N.T. 提供的慷慨资助。我们还衷心感谢来自美国国立卫生研究院（R01DK134590；R24OD034189）、国家科学基金会（EEC 1941543）、哈佛医学院Eleanor和Miles Shore学者 fellowship、Polsky家族基金会、麻省总医院研究执行委员会代表颁发的Claflin杰出学者奖，以及波士顿Shriners儿童医院（资助号 #BOS-85115）的资助。

本研究遵循麻省总医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行。
1. 系统设计
<ol>
	<li>组装系统，包含三个双层夹套组件：气泡捕获器、储液罐、氧合器、蠕动泵和水循环器。</li>
	<li>将所有带夹套的组件连接到一个夹持架上。使用硅胶管以两种不同的顺序依次连接各组件（图1A).
	<ol>
		<li>序列1 - 水流经夹套的流动模式（实线表示） 图1A):
		<ol>
			<li>使用 36 G 管路将水循环器的出口连接至去泡阱夹套的底部入口。这将确保灌流液保持在适当的温度（37 &#176;C）在到达心脏之前，因为水在流经系统的其他组件时会散失热量。</li>
			<li>使用相同尺寸的管路将气泡捕集器夹套的顶部入口连接到储液罐夹套的底部入口。</li>
			<li>随后，将储液罐夹套的顶部入口连接至氧合器夹套的底部入口。</li>
			<li>最后，将氧合器的顶部入口连接至水循环器的进水口。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>序列2 - 灌注液在系统中的流动模式（虚线表示） 图 1A)
		<ol>
			<li>将鲁尔接头连接至16 G管路的两端。将其中一端连接至储液罐底部，并穿过蠕动泵泵头。将另一端连接至氧合器内硅胶线圈的一个入口。</li>
			<li>将另一段两端带有鲁尔锁接头的16 G管路连接至氧合器硅胶线圈的第二个入口，并连接到带有长突起的气泡捕集阱的入口。</li>
			<li>将一段较短的、带有鲁尔接头的16 G导管连接至气泡捕集器未使用的出口，并连接至三通鲁尔锁阀。</li>
			<li>在三通阀的另一端，连接一段16 G导管，导管另一端带有第二个鲁尔阀。&#160;该第二个阀门位于储液器正上方。将阀门的另一端连接至更多16 G导管，再连接压力传感器。</li>
			<li>连接一根直径较小的管子（&#732;将内径为3.7 mm的管路通过连接器与三通阀的垂直端口相连，再连接至插管（14 G血管套管）。灌注液从储液器流出，经除泡阱进入氧合器，随后通过主动脉插管连接回流至储液器。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 灌注液制备
<ol>
	<li>准备基础灌流液：0.96% Krebs-Henseleit 缓冲液、9.915 mM 右旋糖酐、25 mM 碳酸氢钠、1.054 mM 牛血清白蛋白、1% 青霉素-链霉素、0.13% 胰岛素、0.02% 氢化可的松、0.5% 肝素和 2.75 mM 氯化钙，用蒸馏水定容。</li>
</ol>
3. 灌注系统设置
<ol>
	<li>将两个 10 mL 注射器连接至除泡阱顶部和侧向排气口。</li>
	<li>向储液器中加入基础灌注液（75 mL）。启动蠕动泵，并将水浴循环器设定为 37 °C。</li>
	<li>将氧气（95% O2 和 5% CO2）管路连接至氧合器的第三个入口，并将灌注液氧合至 pO2 至少达到 400 mmHg。</li>
	<li>在除泡阱后方的三通阀垂直端口处固定一个注射接口。将带 1 mL 注射器的带翼输液针连接至该注射接口（用于取样）。轻敲注射接口或用 1 mL 注射器吸取灌注液，以清除进入管路中的气泡。</li>
	<li>当基础灌注液达到设定温度和氧合水平后，进行生化参数的初始测定，以确保离子浓度（表 1）正确且氧合充分。 
	注意：离子浓度和 pH 值必须在溶液升温至 37 °C 并以适当气体混合物（95% O2，5% CO2）完成氧合后进行测定。</li>
	<li>通过松开连接的管路夹，使灌注液流经开放的压力传感器和插管，以平衡系统压力，从而对压力传感器进行归零操作。平衡完成后，按下传感器盒上的归零按钮，并重新夹闭管路。在心脏连接系统之前，记录流速从 1 mL/min 到 15 mL/min 范围内的基础压力值。</li>
	<li>低压灌注
	<ol>
		<li>腺苷输注：用基础灌注液配制初始浓度为 20 mM 的腺苷储备液。将装有溶液的管子置于温水浴中并通过反复倒置混匀，使腺苷完全溶解。</li>
		<li>将腺苷储备液进一步稀释至 0.06 mg/mL 的工作浓度，并加入 50 mL 注射器中。</li>
		<li>将带翼输液针连接至 50 mL 注射器，并将其接入三通阀上的注射接口。将注射器固定于注射泵上，设定输注速度为 166.6 µL/min。 
		注意：可通过轻敲或弹击注射接口以释放其中产生的气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>高压灌注：
	<ol>
		<li>浓缩红细胞（pRBCs）分离：
		<ol>
			<li>通过供体大鼠心脏穿刺采集 10–12 mL 全血。</li>
			<li>以 2000 ×g 离心 10 分钟。</li>
			<li>用移液器吸除血浆层和白膜层。</li>
			<li>用不含氯化钙的灌注液以 1:1 比例重悬 pRBCs（例如，5 mL pRBCs 加 5 mL 灌注液），通过倒置混匀。</li>
			<li>重复步骤 3.8.1.2–3.8.1.4 两次，共完成 3 次洗涤。</li>
			<li>最后一次洗涤后，以 1:1 比例将细胞重悬于灌注液中，并将混合液加入已含有 75 mL 基础灌注液的灌注系统中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>让细胞在系统中均匀分布，并使用血液分析仪测定灌注液的血细胞比容。血细胞比容范围为 5%–7%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 心脏移植物获取准备
<ol>
	<li>在开始器官获取前，务必完全预充灌注系统，以尽量缩短冷缺血时间。</li>
	<li>准备手术器械。手术器械包括蓝色垫巾、手术胶带、5-0 丝线、棉签、生理盐水注射器（50 mL 和 10 mL）、手术剪、镊子、显微剪、显微镊、哈尔斯塔德钳、30 U 肝素、用于门静脉冲洗的 16 G 管路、用于心脏插管的 14 G 管路、16 G 套管针、带套袖的改良 14 G 套管针、压力传感器、装有冰块的冰桶、47 mm 培养皿、纱布。</li>
	<li>通过将一段细管（内径 [ID] 0.167 mm，外径 [OD] 2.42 mm）套在 14 G 插管上形成套袖结构，从而制备改良插管。
	<ol>
		<li>取下插管针芯，在套环下方滴一滴超级胶水。小心地将套环滑动至距插管基部约 1/4 英寸处。使用前确保胶水完全干燥。</li>
		<li>尽可能靠近套袖处以倾斜角度剪断插管，并去除锐利边缘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用肝素化生理盐水（0.03 U/mL）填充 60 mL 注射器，用于门静脉冲洗。将注射器连接至压力传感器，再连接 16 G 冲洗管路。</li>
	<li>将 10 mL 肝素化生理盐水（0.03 U/mL）注射器连接至 14 G 管路。将管路另一端连接至主动脉插管，并冲洗以排除所有气泡。</li>
	<li>将主动脉插管置于盛有生理盐水并铺有纱布的 47 mm 培养皿中。将培养皿置于冰上，直至心脏连接至灌注系统。</li>
</ol>
5. 心脏移植物的获取
<ol>
	<li>将大鼠置于含3%异氟烷的麻醉箱中进行麻醉。</li>
	<li>当观察不到反射反应时，将大鼠从麻醉箱中取出，放置于手术区域，并通过面罩持续给予3%异氟烷。</li>
	<li>进行足趾夹捏测试，随后经阴茎静脉注射30 U肝素对动物进行肝素化处理。</li>
	<li>剃除大鼠整个腹部及上胸部区域的毛发，并清除手术区域内的毛发碎屑。用胶带固定每只肢体，确保手术过程中无移动。</li>
	<li>再次进行足趾夹捏测试，确认反射消失。然后在下腹部皮肤做一条水平正中切口，暴露腹肌。</li>
	<li>在腹肌上做第二条水平正中切口，暴露内脏器官。</li>
	<li>暴露胸骨，用止血钳固定并向上牵拉，以暴露肝脏和门静脉。使用16号套管针穿刺门静脉。</li>
	<li>将装有肝素化生理盐水的60 mL注射器连接至套管针，并在下腔静脉和腹主动脉处做切口以排气。通过门静脉灌注全部生理盐水。 
	注意：&#160;灌注压力应维持在约10 mmHg。</li>
	<li>在膈肌上做一水平切口，随后在胸骨两侧的肋骨近端做切口，以暴露胸腔。</li>
	<li>将心脏从胸腔中取出，并立即置于含冰盐水的培养皿中。</li>
	<li>识别主动脉弓，用止血钳夹住，并清除残留结缔组织以暴露降主动脉。</li>
	<li>在降主动脉上做一半横切口，并用14号套管针进行插管。 
	注意：切勿使套管针穿透主动脉瓣。</li>
	<li>在套管 cuff 上方用缝线固定套管，并松开止血钳。</li>
	<li>将心脏置于冰上保存，直至接入灌注系统。</li>
</ol>
6. 灌注启动
<ol>
	<li>将蠕动泵的流速设置为 1.0 mL/min。 
	注意：主动脉插管始终以与心脏呈 90˚ 角的方式操作，以避免将气泡引入冠状动脉（图 1B）。</li>
	<li>在将心脏连接至系统之前，称量带插管的心脏。 
	注意：主动脉插管必须完全无任何气泡。</li>
	<li>将插管连接至系统中的接头，并启动计时器。</li>
	<li>当心脏出现完全收缩后，以每次 0.2 mL/min 的幅度逐步增加流速，同时密切观察压力变化。</li>
	<li>当达到目标压力或流速至少达到 3.5 mL/min 时，停止增加流速。
	<ol>
		<li>低压灌注
		<ol>
			<li>对于 30–35 mmHg 的压力，使用 4.5 mL/min 的流速。</li>
			<li>启动腺苷注射泵。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>高压灌注
		<ol>
			<li>对于 70–80 mmHg 的压力，使用至少 5.0 mL/min 的流速。</li>
			<li>启动腺苷注射泵。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 心室内球囊：
<ol>
	<li>将一个小型（50 µL）乳胶球囊连接到带有锥形尖端（1.4 mm 直径）的球囊导管（2 mm 直径，15 cm 长）上。</li>
	<li>通过鲁尔锁接头将导管连接至压力传感器，并将整个装置固定在夹具支架上。</li>
	<li>通过连接在压力传感器顶端的注射器向球囊/导管/压力传感器系统注入约 200 µL 生理盐水，并排除传感器、导管和球囊内的气泡。</li>
	<li>使用血压计校准压力传感器。</li>
	<li>在左心房上方做一个小的横向切口。通过抽吸压力传感器顶部的注射器使球囊放气，并将其插入左心室。</li>
	<li>启动数据采集，然后充盈球囊，直至舒张压读数为 0 mmHg。</li>
</ol>
8. 取样
<ol>
	<li>在灌注开始后的前20分钟以及此后每小时，采集心率、主动脉流量和冠状动脉压力。</li>
</ol>
9. 结束/清理
<ol>
	<li>灌流结束后，将心脏从系统中取出并称重，以评估水肿程度。</li>
	<li>通过环形切口切除心脏心尖，并在液氮中快速冷冻，用于灌流后的分析。</li>
	<li>切取心脏的一圈组织用于组织学成像与染色，其余部分连同心室插管一并处理掉。</li>
	<li>向储液器中加入大量去离子水（DI水），启动蠕动泵，冲洗系统的所有组件，并将冲洗液收集到外部桶中。</li>
	<li>重复步骤9.4两到三次。</li>
	<li>彻底冲洗所有取样口和压力传感器管路。</li>
	<li>在储液器中加入600 mL去离子水和3 mL实验室级清洗剂，通过系统循环清洗。</li>
	<li>关闭水浴加热器、氧气瓶和蠕动泵。</li>
</ol>

Enhancing CVD Research with Modified Langendorff Perfusion

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</ol>

SNT 拥有与本研究相关的专利申请，并在致力于开发器官保存技术的 Sylvatica Biotech Inc. 公司担任科学顾问委员会成员。所有利益冲突均已由麻省总医院（MGH）和 Partners HealthCare 根据其利益冲突政策进行管理。

Langendorff 灌流是一种极为灵活的技术，可根据广泛的实验需求进行高度定制和调整。这种定制性得益于大多数灌流参数（包括灌流压力）具有显著的可调节性。由于 Langendorff 灌流为逆向灌流，灌流压力等同于冠状动脉灌流压力（CPP），而冠状动脉灌流压力在心脏功能中起着关键作用。已知冠状动脉灌流压力可直接调控心脏做功，因为多种心脏功能指标（如左心室压力、收缩力（dP/dt）最大），壁张力，心室僵硬度）与CPP成正比16,17,18历史上，该领域采用60 mmHg至80 mmHg的灌注压，实际上即脑灌注压（CPP），以试图模拟生理条件5,8,15,19,20,21然而，逆行性的非生理特性 离体 机器灌注结合高强度工作负荷，会导致心脏功能随时间延长而持续下降图3）或者，较低的灌注压力（30–35 mmHg），尽管不能准确模拟大鼠心脏的生理条件 体内，固有地降低心脏做功需求，并在不随时间推移而丧失功能的情况下实现延长的灌注时间（4 h）图3），以及减轻移植物水肿（图2C）。尽管较低的灌注压力意味着偏离了生理状态下的灌注压（CPP），但与使用生理灌注压力相比，其具有显著优势：通过消除Langendorff灌注过程中因技术因素导致的功能丧失，该方法被改进为一种更精确、可预测性更高的模型系统，有望显著推动心血管疾病研究的发展。特别是那些需要延长灌注时间才能达到科学意义的研究领域（如药物处理、免疫反应分析、基因编辑、常温器官移植保存等），在应对心血管疾病（CVDs）的挑战中正变得愈发重要。
朗根多夫灌注无疑是心血管研究领域中不可或缺的重要工具。因此，尽管该科学方法为科研界带来了显著益处，但也伴随着较高的科学复杂性。事实上，该方案中存在多个关键步骤，必须进行严格标准化，主要目的是在灌注开始前、过程中以及刚结束后避免心脏移植物受损。移植物损伤的第一个潜在风险出现在门静脉冲洗阶段，这一阶段的损伤往往不易察觉。使用肝素化生理盐水进行冲洗，旨在尽可能清除心脏移植物中的全血，具有双重目的：第一，通过放血实现安乐死；第二，由于大鼠全血的凝固时间极短，该步骤可最大限度地减少在心脏获取、插管及运输过程中移植物内发生凝血的可能性22,23。然而，在完成数百次成功的心脏灌注后发现，冲洗过程中施加于大鼠机体的压力至关重要，理想的冲洗压力约为10 mmHg。较高的门静脉冲洗压力似乎会导致心脏移植物血管系统的损伤，从而引起血管阻力升高（<img alt="阻力计算公式，R=灌注压/灌注流量，医学生理学方程。" src="/files/ftp_upload/66815/66815eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式1">）。血管阻力升高实际上会导致在较低灌注流量下即达到目标灌注压力。这种压力与冠状动脉血流之间的不平衡会反映在左心室脉压（LVPP）上，从而导致显著的变异性。
下一个可能造成心脏移植物损伤的情况是在将移植物通过冠状动脉连接至系统时引入气泡。气泡可能因操作不当处理插管的心脏（图 1B）或在气泡捕集器上游的灌注系统中未能正确去除气泡而轻易引入24。由于该装置采用逆行灌注方式，任何气泡的进入都将导致心脏空气栓塞，引发缺血性损伤、心室纤颤，并且非常常见地导致移植物死亡。最后，确保本方案成功的关键步骤发生在启动灌注时。与绝大多数报道使用Langendorff技术的研究不同，本方案中灌注的启动是在相对较低的流量下（1 mL/min）进行，并逐步递增（+0.2 mL/min），从而实现对灌注压力的完全控制5,8,15,19,20,21。这种流量（从而压力）的逐步增加至关重要，因为压力的突然变化会不可逆地增加血管阻力，并破坏精细的流量/压力平衡。
在压力控制型 Langendorff 灌流中，高血管阻力具有重要影响，因为目标灌流压力在较低流量下即可达到，导致移植物灌注不足。该方案对流量与压力之间精确平衡的高度依赖，可能是其最主要的局限性，因为任何先前的移植物损伤（无论是有意的，如延长的冷保存、热缺血损伤、心肌梗死等，还是无意的）都会导致血管阻力升高。因此，该方案特别适用于实验在灌流开始后才进行的研究（如药物处理、免疫反应分析、基因编辑、常温移植物保存等），而不适用于灌流前阶段。这一局限性充分说明，一种固定的 Langendorff 模式并不适用于所有研究目的，应特别注意根据具体实验需求调整灌流参数。

心血管研究领域在心血管疾病（CVD）的诊断和治疗方面取得了重要进展。然而，尽管总体发病率和死亡率呈下降趋势，CVD 仍是全球首要的死亡原因1,2。这一令人担忧的事实凸显了加强研究和科学进步的迫切需求，而这些进展无疑依赖于现有研究工具的准确性和可预测性。因此，持续需要对研究工具集进行创新、改进和/或重新利用。例如，逆向或朗根多夫（Langendorff）心脏灌流技术已有超过一个世纪的历史，可通过简单修改以满足更广泛的科研需求，并实现更丰富的应用范围。
在Langendorff灌流过程中，将心脏移植物与机体其他部分分离，可对多种实验参数进行有效控制，包括温度、循环溶液、冠状动脉灌注压力等3,4,5,6,7。对这些参数的调控有助于模拟多种心脏生理或病理状态，从而推动科学研究的进展5,8,9,10。在这些参数中，灌注压力可能是最常被忽视的实验设置之一11。
在朗根多夫灌流过程中，灌流压力与心率、收缩压/舒张压峰值以及耗氧量呈直接相关关系11这种相关性能够对心肌移植物产生的做功量进行直接且精确的调控，可根据具体的实验需求进行调整。尽管具备这一重要的调控能力，但该领域在历史上一直倾向于采用较高的灌注压（60–80 mmHg），使所有心肌移植物均处于高做功负荷状态，而不论实际实验需求如何。8,12,13,14,15过度工作需求所带来的后果源于一个普遍原则，即过度工作往往导致过早衰竭。这一现象在通过兰格多夫（Langendorff）法灌注的心脏移植物中尤为明显，因为该方法本身具有非生理特性，且缺乏对器官恢复的支持。 体内 似乎会加剧移植物功能衰竭。这种移植物功能的过早丧失显著限制了灌注时间和实验时长。实际上，在需要更长灌注时间的实验条件下（例如药物处理、免疫反应分析、基因编辑、移植物保存等），可适当降低心脏做功，以换取移植物更长的存活时间。
本方案证明了在Langendorff灌注过程中采用较低灌注压（30–35 mmHg）的可行性，并进一步表明，与较高灌注压（60–80 mmHg）相比，较低灌注压对心脏移植物功能随时间的变化具有显著影响。此外，本文的研究结果强调了优先优化多种灌注参数的个性化设置，以更好地满足实验需求的重要性。

<table><tbody><tr><td>5-0 缝合线</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>14 G 血管导管</td><td>Becton Dickinson</td><td>381867</td><td></td></tr><tr><td>16 G 血管导管</td><td>Becton Dickinson</td><td>381957</td><td></td></tr><tr><td>24 mm 心腔适配器</td><td>Radnoti</td><td>140132</td><td></td></tr><tr><td>球囊导管&amp;nbsp;</td><td>Radnoti</td><td>170423</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;直插式无菌注射器 - 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;直插式无菌注射器 - 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;直插式无菌注射器 - 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>气泡捕集顺应性室</td><td>Radnoti</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>夹具支架</td><td>United Scientic</td><td>RTCLMP1</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖</td><td>Sigma</td><td>31389</td><td></td></tr><tr><td>DIN8 延长电缆</td><td>Iworx</td><td>SKU&amp;nbsp;C-DIN-EXT</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 高透明度 50 mL 锥形管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>GSC Go Science Crazy&amp;nbsp;铸铁支撑环架</td><td>Fisher Scientific</td><td>S13748</td><td></td></tr><tr><td>心脏腔室&amp;nbsp;</td><td>Radnoti</td><td>140160</td><td></td></tr><tr><td>加热循环水浴槽</td><td>Cole Parmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠注射液</td><td>Medplus</td><td>G-0409-2720-0409-2721</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Solu-Cortef</td><td>MGH 药房</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Humulin R</td><td>MGH 药房</td><td></td></tr><tr><td>侵入式液体填充血压传感器</td><td>Iworx</td><td>SKU&amp;nbsp;BP-10x</td><td></td></tr><tr><td>Iworx 数据采集系统</td><td>Iworx</td><td>IX-RA-834</td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Henseleit 缓冲液</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>左心室压力球囊</td><td>Radnoti</td><td>170404</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 易装 II 型泵头（用于精密管路，PPS 外壳，不锈钢转子）</td><td>VWR</td><td>MFLX77200-60</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 标准数字泵系统</td><td>VWR</td><td>MFLX07551-30</td><td></td></tr><tr><td>膜式氧合腔</td><td>Radnoti</td><td>130144</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-170-12H</td><td></td></tr><tr><td>精密泵管 - 16</td><td>VWR</td><td>MFLX96410-16</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>5761</td><td></td></tr><tr><td>标准 PHD ULTRA CP 注射泵</td><td>Harvard Aparatus</td><td>88-3015</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 传输软管</td><td>VWR</td><td>MFLX95702-03</td><td></td></tr></tbody></table>

用于延长啮齿类动物心脏移植物灌注时间的改良式朗根多夫灌注法

Modified Langendorff Perfusion for Extended Perfusion Times of Rodent Cardiac Grafts

尽管心血管疾病（CVD）的诊断和治疗已取得重要进展，该领域仍迫切需要加强研究和科学进步。因此，对现有研究工具集进行创新、改进和/或重新利用，可为科研进展提供更优的实验平台。离体心脏灌注（Langendorff 灌注）是心血管疾病研究领域中一项极为重要的研究技术，可通过调整以满足多种实验需求。这种定制化可通过个性化设置大量灌注参数实现，包括灌注压力、流量、灌注液、温度等。本方案展示了 Langendorff 灌注的灵活性，并证明通过采用较低的灌注压力（30–35 mmHg），可在不导致移植物功能丧失的情况下实现更长的灌注时间（4 小时）。在不造成移植物损伤或技术本身引起功能丧失的前提下实现延长灌注时间，有望消除实验结果中的混杂因素。实际上，在需要较长灌注时间的科学研究情境中（例如药物处理、免疫反应分析、基因编辑、移植物保存等），较低的灌注压力可能是科研成功的关键。

取成年雄性Lewis大鼠（体重250-300 g）的心脏，分别在高（70-80 mmHg）或低（30-35 mmHg）灌注压力下进行灌注（每组n = 3）。通过记录心率、水肿程度和左心室功能，评估灌注压力对整体心脏功能和健康状况的影响。
心率与灌注压力之间存在明确的相关性（图2）。除第一个时间点外，在所有其他时间点，高压力组心脏的心率在统计学上均高于低压力组心脏（60 分钟，图2A、B）。有趣的是，低压力组心脏在灌注开始时似乎经历了一段适应期，心率约需 30 分钟才能稳定并达到此后灌注期间维持的水平（图2A）。两组之间左心室脉压（LVPP）也存在显著差异，在每个时间点，高压力组心脏的 LVPP 在统计学上均高于低压力组心脏（图3B）。这种持续的高负荷需求导致高压力组心脏功能进行性下降，在灌注 2 小时后即可观察到 LVPP 的统计学显著降低（图3A、B）。相比之下，低压力灌注的心脏未出现功能下降，LVPP 在整个灌注期间保持不变（图3A、B）。与 LVPP 相似，在整个灌注期间，高压力组心脏的心肌收缩能力（dP/dtmax）和舒张能力（dP/dtmin）均高于低压力组心脏（图3C、D）。相应地，高压力组心脏的收缩和舒张功能也呈现进行性下降，这两个参数在灌注 1 小时时均显著高于灌注最后 1 小时。而低压力组的心肌收缩与舒张功能水平相对较低，在 4 小时灌注期间保持稳定（图3C、D）。除了功能影响外，长时间的高灌注压力还会加剧心脏移植物间质液潴留，导致水肿。该水肿通过重量变化百分比进行半定量评估，结果显示，与低压力灌注的心脏相比，高压力组心脏的体重增加在统计学上更为显著（图2C）。
<img alt="灌注系统静态平衡示意图；气泡捕集器、泵、氧合器、压力监测仪。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66815/66815fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：灌注系统装置示意图。（A）整体灌注系统装置。虚线表示为优化灌流液循环而连接系统各组件的顺序。实心彩色线条表示为优化灌流液温度而连接组件的顺序。（B）插管后正确持握心脏的方法，以避免导管排空及空气进入冠状动脉。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66815/66815fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心率反应图和柱状图，低压与高压应激实验，统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66815/66815fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：压力对心率和水肿的影响。（A）通过心室内球囊测量获得的心率。实线表示实验组的中位数，阴影区域表示四分位距。（B）每小时灌注期间心率数据的曲线下面积（AUC）。（C）在低压和高压下灌注 4 小时后的体重增加百分比。所有数据均表示为中位数 ± 四分位距（IQR）。*p &lt; 0.01，**p &lt; 0.05，***p &lt; 0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66815/66815fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="心脏功能图和柱状图；低压与高压；左心室脉搏、收缩力、舒张分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66815/66815fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：压力对左心室功能的影响。（A）随时间变化的最大收缩压，表示为左心室脉压（LVPP）。实线代表实验组的中位数，阴影区域代表四分位距。（B）每小时灌注期间LVPP曲线下面积（AUC）。（C）通过压力脉冲的最大导数定量的心肌收缩力。（D）通过压力脉冲的最小导数定量的心肌舒张功能。所有数据均以中位数±四分位距表示。*p &lt; 0.01，**p &lt; 0.05，***p &lt; 0.001，****p &lt; 0.0001。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66815/66815fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>离子</td>
			<td>浓度 (mmol/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+ </td>
			<td>135–145 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K + </td>
			<td>&lt;6.00 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca +2 </td>
			<td>1.0–1.3 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cl - </td>
			<td>96–106 </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：灌注液中离子浓度的可接受范围。

本文展示了通过在Langendorff灌注过程中采用低于生理水平（60–80 mmHg）的灌注压力（30–35 mmHg），可实现小鼠心脏移植物在不丧失功能的情况下延长灌注时间（达4小时）的可行性。

尽管心血管疾病（CVDs）的诊断和治疗已取得重要进展，但该领域仍迫切需要加强研究和……

本研究旨在突出Langendorff灌注作为一种研究工具所具有的动态性与广泛应用前景，及其在心血管疾病研究中的巨大实用价值。同时强调了根据实验需求，对流量、压力、灌注液和温度等不同灌注参数进行优化调整的重要性。本方案为当前Langendorff灌注的常规方法提供了一种替代性策略。这表明，使用低于常规的灌注压力（例如 30 至 35 毫米汞柱，而非通常的 60 至 80 毫米汞柱）可能对某些类型的实验有益，并可提高相关研究的整体科学结果。该方案通过消除依赖于技术本身的功能丧失，增强了 Langendorff 灌注作为心血管研究技术的重要性。此外，该方案有望引发关于临床灌注心脏移植物（如用于移植保存的心脏）最佳灌注实践的讨论。首先，在确认反射消失后，将已麻醉的大鼠从麻醉舱中取出。将其置于手术区域，并通过面罩持续给予3%异氟烷。进行足趾夹捏测试后，经由动物的阴茎静脉注射30单位肝素。将大鼠整个腹部和上胸部区域的毛发剃除，然后清除手术区域的毛发碎屑。用胶带固定每一只肢体，以防止手术过程中动物移动。现在在下腹部皮肤上做一条水平正中切口，以暴露腹肌。然后通过腹肌做第二条水平正中切口，以暴露内脏器官。接下来，暴露胸骨。用止血钳固定并向上牵拉以暴露肝脏和门静脉。使用16号血管造影导管，将导管插入门静脉，并将含有肝素化生理盐水的60毫升注射器连接至血管造影导管。然后在下腔静脉和腹主动脉处做切口以进行排气。通过门静脉将全部生理盐水冲洗通过。随后，在膈肌上做一水平切口，接着在胸骨两侧的肋骨近端做切口，以暴露胸腔。将心脏从胸腔中取出，并立即置于含有冰上生理盐水的培养皿中。然后辨认主动脉弓，用止血钳夹住，并清除残留的结缔组织以暴露降主动脉。使用解剖显微剪刀，在降主动脉壁上做一水平切口，切至管壁半周，插入14号血管造影导管。在套管上方用缝线固定导管，并松开止血钳。首先，将蠕动泵的流速设定为1.0毫升每分钟。在将分离的大鼠心脏和插管连接到系统之前，先称量其质量。将插管连接至系统的接头，并启动计时器。当心脏完全收缩后，以每分钟0.2毫升的幅度逐步增加流量，同时监测压力。当达到目标压力或流量达到最低3.5毫升/分钟时，停止增加流量。对于30至35毫米汞柱之间的压力，将流量设定为4.5毫升/分钟。然后启动腺苷注射泵。使用鲁尔锁接头将导管连接至压力传感器，并将整个装置固定在夹具架上。随后，将一个小型乳胶气球连接到带有锥形尖端的球囊导管上。使用连接在压力传感器顶端的注射器，向球囊导管和压力传感器内注入约 200 µL 生理盐水。然后借助血压计校准压力传感器。接下来，在左心房上方做一个小的横向切口。通过回抽压力传感器顶部的注射器并将其插入左心室来放空气囊。随后，开始数据采集，并充气气囊直至舒张压显示为零毫米汞柱。心率与灌注压之间建立了明确的相关性。值得注意的是，在整个研究过程中，除初始测量值外，高压心脏的心率均显著高于低压心脏。两组之间的左心室脉压（LVPP）存在显著差异，高压心脏在所有时间点的LVPP均具有统计学意义上的升高。随着时间推移，高压心脏功能呈进行性下降，在两小时后LVPP明显降低。相反，低压心脏在整个灌注过程中左心室舒张末期压力（LVPP）保持稳定。与低压心脏相比，高压心脏表现出更优的心脏功能。

modified-langendorff-perfusion-for-extended-perfusion-times-rodent

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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