Name: LPS和ATP诱导的PMA分化THP-1巨噬细胞死亡及其验证 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 了解利用流式细胞术和扫描电子显微镜研究LPS和ATP诱导的PMA分化THP-1巨噬细胞死亡机制的方法。该技术可识别细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡特征，为炎症性疾病研究提供重要依据。

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我们非常感谢成都中医药大学中医药创新研究院孙佳怡和杨璐在流式细胞术方面提供的协助，感谢西南道地药材国家重点实验室陈翠萍在扫描电子显微镜方面给予的帮助。本工作得到国家自然科学基金[82104491]、四川省自然科学基金[2023NSFSC0674]以及中国博士后科学基金[2021M693789]的资助。

1. 细胞系与细胞培养
<ol>
	<li>将人单核细胞系 THP-1 培养于含 10% 胎牛血清、1% 青霉素-链霉素和 0.05 mM β-巯基乙醇的 RPMI-1640 完全培养基中。在 37 °C、5% CO2 的湿化空气中培养细胞。每 2–3 天传代一次。 
	注意：THP-1 为悬浮细胞，传代时建议更换一半培养基。若在光学显微镜下观察到大量细胞碎片，可在室温下以 300 × g 离心 3 分钟，随后将细胞重悬于预热的新鲜完全培养基中。</li>
	<li>所有实验均使用处于对数生长期的细胞（第 4–10 代）。当细胞状态良好且处于对数生长期时，在 100 × 光学显微镜下观察应呈圆形、明亮、致密，且无团块和细胞碎片。</li>
</ol>
2. THP-1 细胞的分化
<ol>
	<li>制备浓度为 1 mM 的佛波酯（PMA）储备液（将 1 mg PMA 溶解于 1.62 mL 二甲基亚砜中）。用完全细胞培养基将 PMA 储备液稀释至终工作浓度为 100 nM。</li>
	<li>将培养皿中的细胞收集至 10 mL 无菌离心管中，在室温下以 300 × g 离心 3 分钟，用含 PMA 的 3 mL 完全培养基重悬细胞。</li>
	<li>打开细胞计数仪并启动计数软件。吸取 20 µL 细胞悬液加入细胞计数板，然后将计数板插入细胞计数仪。点击 预览 B1，调节仪器右下角的旋钮，调整焦距，使软件中显示的细胞具有明亮的中心和清晰的轮廓。点击 计数 开始计数。</li>
	<li>根据计数结果，使用含 PMA 的完全培养基将细胞密度调整为 1 × 106 个细胞/mL。将细胞接种于 6 孔板中，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时后，开始后续处理。</li>
</ol>
3. THP-1细胞的处理
<ol>
	<li>制备浓度为 1 mg/mL 的 LPS 储存液（将 1 mg LPS 溶解于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中）。用无血清培养基将 LPS 储存液稀释至终工作浓度为 1 µg/mL。制备浓度为 500 mM 的 Na2ATP 储存液（将 0.3026 g ATP 溶解于 1 mL PBS 中）。</li>
	<li>吸除含有 PMA 的培养基，用 PBS 洗涤 1 次。向对照组加入无血清培养基，向模型组加入含 LPS 的无血清培养基。于 37 °C + 5% CO2 条件下孵育 6 小时，随后进行后续处理。</li>
	<li>6 小时后，向模型组加入 ATP 储存液，使其终工作浓度为 500 nM。于 37 °C + 5% CO2 条件下孵育 45 分钟，然后继续后续操作。</li>
</ol>
4. 流式细胞术分析（方法1）
<ol>
	<li>实验样品的制备
	<ol>
		<li>按照步骤2在6孔板中接种并培养细胞。设立四个未处理的对照组：一个不染色对照组、两个单染对照组（每种染料各一个）和一个双染对照组。设立一个处理组，并按照步骤3进行处理。</li>
		<li>处理后，吸除各孔中的全部上清液，用PBS洗涤两次。每孔加入500 µL 0.05%胰蛋白酶（无EDTA），在培养箱中孵育30秒。</li>
		<li>每孔加入1 mL RPMI-1640完全培养基以终止细胞脱落，并将细胞收集至5 mL离心管中。在室温下以300 × g离心3分钟。</li>
		<li>加入1 mL PBS重悬细胞。将装有细胞的离心管置于37 °C水浴中3分钟。所有样品在室温下以300 × g离心3分钟。</li>
		<li>取200 µL 5×结合缓冲液与800 µL蒸馏水混合，稀释成1×结合缓冲液。每管加入100 µL 1×结合缓冲液重悬细胞，并将细胞转移至5 mL离心管中。</li>
		<li>向一管对照组细胞中加入5 µL Annexin V-PE溶液，室温避光孵育10分钟；向另一管对照组细胞中加入5 µL 7-AAD溶液，室温避光孵育5分钟（分别作为单染对照）。轻轻涡旋混匀每管，使染料充分混合，孵育结束后每管加入400 µL PBS，轻轻涡旋以终止孵育。</li>
		<li>向其余各管中加入5 µL Annexin V-PE溶液，室温避光孵育5分钟。轻轻涡旋混匀每管，孵育后每管再加入5 µL 7-AAD溶液，室温避光继续孵育5分钟。孵育结束后每管加入400 µL PBS，轻轻涡旋以终止反应。</li>
		<li>使用5 mL聚苯乙烯圆底管配套的35 µm尼龙滤网过滤细胞悬液。将离心管置于冰上待测。检测前轻轻混匀，然后插入仪器中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术
	<ol>
		<li>使用荧光激活细胞分选流式细胞仪进行检测。打开流式细胞仪数据分析软件，确认检测器和激光器的性能状态。点击Cytometer，选择Fluidics startup，等待系统准备就绪。通过点击Cytometer &#62; Clean Modes &#62; De-gas Flow cell排除流动室中的气泡。</li>
		<li>点击Experiment，依次选择New folder, Experiment, Specimen, Tube和Edit Name。试管前的五边形箭头点亮时变为绿色。</li>
		<li>点击Cytometer FACSCelesta图标（快捷键图标），选择Parameter，然后选择FSC、SSC和PE信号。点击Global Worksheet图标（快捷键图标）建立PE直方图。本研究所用流式细胞仪中，Annexin V的PE信号在586 nm处检测，并绘制于X轴；7-AAD的PerCP-Cy5.5信号在700 nm处检测，并绘制于Y轴。</li>
		<li>首先将未染色对照样品插入仪器。点击Acquisition Dashboard图标（快捷键图标），从目标细胞群中至少采集10,000个事件。在FSC-A与SSC-A散点图上设门（P1）排除碎片。将流速调整为中速并记录数据。调节电压使细胞群落在FSC/SSC直方图的对角线上，点击Restart。再次将流速设为中速并记录数据。</li>
		<li>点击Next tube，运行Annexin V和7-AAD的单染对照样本以调整补偿。随后运行其余样本并收集数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 扫描电镜成像（方法2）
<ol>
	<li>实验样品的制备
	<ol>
		<li>按照步骤2将细胞接种并培养于6孔板中，并按照步骤3进行处理。</li>
		<li>处理后，吸净各孔中的全部上清液，用 PBS 洗涤 2 次。每孔加入 500 µL 0.05% 胰蛋白酶（不含 EDTA），放入培养箱中孵育 30 秒。</li>
		<li>向每孔加入 1 mL RPMI-1640 完全培养基以终止细胞脱落，并将细胞收集至 5 mL 离心管中。在 300 x g 室温下持续3分钟。</li>
		<li>使用500 µL电子显微镜固定液（2.5%戊二醛，100 mM磷酸盐）在室温下固定细胞2小时，随后在4 °C下过夜。</li>
		<li>制备重铬酸钾明胶溶液：将1.0 g明胶加入100 mL超纯水中，于70 °C水浴加热并搅拌均匀。加入0.05 g重铬酸钾明胶，搅拌均匀后用滤纸过滤。将洁净的盖玻片浸入重铬酸钾明胶溶液中，在37 °C下孵育2 h，随后在37 °C烘箱中干燥，备用。 
		注意：目的是防止实验过程中细胞脱落。</li>
		<li>从固定液中收集细胞。在 300 x g 室温孵育3分钟。加入100 µL PBS，轻柔吹打使细胞脱落。将细胞悬液滴加至盖玻片上，静置5分钟。吸除全部上清液，用PBS洗涤3次，每次5分钟。 
		注意：操作必须轻柔，以防止细胞脱落。切勿剧烈振荡，动作应缓慢，并沿器壁缓慢加入液体。</li>
		<li>加入500 μL 1% 锇酸&#160;酸固定1小时。吸除全部液体&#160;上清液，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟&#160;每次</li>
		<li>依次使用系列浓度的乙醇（EtOH）溶液（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%）对样品进行脱水，每种乙醇溶液处理15分钟。 
		注意：盖玻片可以&#160;在 4 °C 条件下用 100% EtOH 保存数天&#160;但应尽快干燥，以避免&#160;过度脱水</li>
		<li>打开临界点干燥仪，开启 CO₂2 将样品在腔室压力为0 psi时迅速用滤纸包裹，并放入腔室中，然后将腔室冷却至10 °C。</li>
		<li>打开进气阀，通过CO观察2 观察窗，升高液态CO₂2 位于两条红线之间的液位（不得超过上限），关闭进样阀。浸泡样品10分钟。同时打开进样阀和排气阀，使CO2 1 分钟（液态 CO2 置换乙醇。关闭排气阀以升高液态CO₂2 调节至指定位置后，关闭进样阀。</li>
		<li>将温度设置为 35 °C，压力设置为 1250 psi。待温度和压力稳定后，以 100 psi/min 的速率降压。当腔室压力降至零时取出样品，并关闭仪器。</li>
		<li>使用导电胶带将样品固定在扫描电镜铝制样品台上。采用溅射镀膜仪在样品表面覆盖一层金（2–5 nm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像
	<ol>
		<li>使用高分辨率冷场发射扫描电镜进行成像。将扫描电镜的加速电压设为 3 kV，工作距离设为 10 mm。将放大倍数设为 1,000× 以观察全景图像，再将放大倍数设为 5,000× 和 20,000× 以定位细胞膜并对样品进行成像。 
		注意：通过扫描电镜观察PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞的过程与其他类型细胞和组织的处理类似，具体操作取决于所使用的仪器。参考文献14 提供详细的扫描电镜（SEM）实验方案及配套视频。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Analyzing LPS/ATP-Triggered Cell Death Mechanisms in THP-1 Cells

<ol><li>Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis%2C+pyroptosis+and+apoptosis%3A+an+intricate+game+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death.</a> Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).</li>
<li>Rao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+in+inflammatory+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer.</a> Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).</li>
<li>Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+and+the+cellular+consequences+of+gasdermin+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores.</a> Semin Immunol. 69, 101803(2023).</li>
<li>Kovacs, S. B., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermins%3A+Effectors+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gasdermins: Effectors of pyroptosis.</a> Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NINJ1+mediates+plasma+membrane+rupture+during+lytic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death.</a> Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).</li>
<li>Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+pyroptosis%2C+and+necroptosis-Oh+my%21+The+many+ways+a+cell+can+die%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die.</a> J Mol Biol. 434 (4), 167378(2022).</li>
<li>Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell-derived+exosomes%3A+messages+from+dying+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells.</a> Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).</li>
<li>Imre, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+signalling+in+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Cell death signalling in virus infection.</a> Cell Signal. 76, 109772(2020).</li>
<li>Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL%3A+Functions+beyond+serving+as+the+Executioner+of+Necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis.</a> Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).</li>
<li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+macrophages+deal+with+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">How macrophages deal with death.</a> Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+endotoxin+activates+the+coagulation+cascade+through+gasdermin+D-dependent+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure.</a> Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).</li>
<li>Gong, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESCRT-III+acts+downstream+of+MLKL+to+regulate+necroptotic+cell+death+and+its+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences.</a> Cell. 169 (2), 286-300 (2017).</li>
<li>Dong, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell+surface+expression+of+phosphatidylserine+in+ovarian+carcinoma+effusions+using+the+annexin-V%2F7-AAD+assay%3A+clinical+relevance+and+comparison+with+other+apoptosis+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters.</a> Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).</li>
<li>JoVE, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Electron+Microscopy+%28SEM%29%2C+JoVE+Science+Education+Database%2C+Analytical+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2024).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+is+driven+by+non-selective+gasdermin-D+pore+and+its+morphology+is+different+from+MLKL+channel-mediated+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis.</a> Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).</li>
<li>Herr, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+characteristics+of+DHA-induced+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromol+Med%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis.</a> Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).</li>
<li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide%2Fadenosine+triphosphate+induces+IL-1%CE%B2+and+IL-18+secretion+through+the+NLRP3+inflammasome+in+RAW264.7+murine+macrophage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells.</a> Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).</li>
<li>Gurung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FADD+and+caspase-8+mediate+priming+and+activation+of+the+canonical+and+noncanonical+Nlrp3+inflammasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes.</a> J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+caspase-1+protects+against+TBI-induced+pyroptosis+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflam%22%5BJournal%5D)">Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo.</a> J Neuroinflam. 15 (1), 48(2018).</li>
<li>Wang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK-3%CE%B2-mediated+activation+of+NLRP3+inflammasome+leads+to+pyroptosis+and+apoptosis+of+rat+cardiomyocytes+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts.</a> Euro J Pharmacol. 920, 174830(2022).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP3+dependent+NLRP3+inflammasome+activation+is+implicated+in+acute+lung+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice.</a> J Transl Med. 16 (1), 233(2018).</li>
<li>Rogers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermin+pores+permeabilize+mitochondria+to+augment+caspase-3+activation+during+apoptosis+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation.</a> Nat Comm. 10 (1), 1689(2019).</li>
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<li>Kang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-8+scaffolding+function+and+MLKL+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+downstream+of+TLR3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3.</a> Nat Comm. 6, 7515(2015).</li>
<li>Wang, Y., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pyroptosis%2C+apoptosis+and+necroptosis+to+PANoptosis%3A+A+mechanistic+compendium+of+programmed+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Str+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways.</a> Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodiola+crenulata+alleviates+hypobaric+hypoxia-induced+brain+injury+by+maintaining+BBB+integrity+and+balancing+energy+metabolism+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction.</a> Phytomedicine. 128, 155529(2024).</li>
<li>Shuwen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+induction+in+CD8%2B+T+cell+exhaustion+in+colorectal+cancer+via+the+regulation+of+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites.</a> Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).</li>
<li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide+induced+intestinal+injury+is+alleviated+by+blocking+the+TLR9%2Fcaspase3%2FGSDME+mediated+intestinal+epithelium+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis.</a> Int Immunopharmacol. 119, 110244(2023).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，采用两种方法检测LPS和ATP诱导的PMA分化THP-1巨噬细胞死亡。使用Annexin V/7-AAD双染法，并通过流式细胞术对整体染色结果进行分析。与其他流式细胞术分析类似，设置了未染色细胞组以及两个单染细胞组，以排除假阳性与假阴性结果。结果显示，在LPS/ATP刺激后，部分细胞失去细胞膜完整性，提示可能发生细胞死亡。该检测方法使我们能够从整体细胞水平评估细胞死亡情况。值得注意的是，Annexin V/7-AAD双染法不足以区分细胞焦亡、凋亡与坏死性凋亡。在这三种死亡方式的早期阶段，磷脂酰丝氨酸（PS）均会外翻至质膜外侧，Annexin V染色呈阳性；在晚期阶段，细胞膜完整性均丧失，染色结果表现为双阳性。因此，我们进一步采用扫描电镜（SEM）观察可能发生的细胞死亡形态。
在细胞凋亡中，BAX/BAK 在线粒体外膜上形成孔道，随后发生细胞皱缩和细胞膜出泡。坏死性凋亡通过 MLKL 在细胞膜上打开孔道，而焦亡信号则激活 gasdermin 在细胞膜上形成孔道。值得注意的是，焦亡和坏死性凋亡在最终阶段均伴随细胞膜破裂。然而，gasdermin 形成的孔道明显大于 MLKL 形成的孔道，因此 gasdermin 孔道不具备离子选择性。坏死性凋亡细胞在形态学上表现出显著的肿胀15，最终导致膜破裂。无论细胞膜通透性激活上游的信号通路如何，这三种细胞死亡形式均伴随着细胞膜的变化。我们采用扫描电镜（SEM）进一步观察细胞膜，以直观地检测细胞死亡。我们观察到焦亡的特征，包括膜出泡和膜破裂，以及坏死性凋亡的特征，包括细胞肿胀和膜破裂，这些结果与先前研究者报道的特征一致15。我们还观察到膜出泡和细胞皱缩，与先前研究者所描述的细胞凋亡特征相符16。
在以往的研究中，通常使用LPS和ATP联合处理来诱导细胞焦亡。有趣的是，我们观察到了细胞凋亡和坏死性凋亡的特征。尽管这三种死亡形式均可能出现在LPS/ATP诱导的细胞死亡过程中，但先前的研究表明，焦亡仍是主要的死亡方式。LPS是最具代表性的病原体相关分子模式之一。ATP在细胞内浓度较高，并可在细胞死亡时释放到胞外，属于危险相关分子模式之一17。LPS/ATP是一种经典的两步刺激法，用于诱导细胞焦亡。研究表明，在LPS刺激的细胞中加入ATP可迅速激活caspase-118，而沉默caspase-1基因则可显著逆转LPS/ATP诱导的细胞死亡19。在以往的研究中，我们也发现LPS/ATP可诱导凋亡和坏死性凋亡相关靶蛋白的活化20,21。尽管LPS/ATP是一种经典的焦亡诱导剂，但它也可能同时诱导细胞凋亡和坏死性凋亡。
事实上，这三种细胞死亡形式通常并非独立存在，而是不同信号阶段之间存在相互串扰。例如，gasdermin 蛋白可靶向线粒体，促进细胞色素 c 的释放，从而增强线粒体介导的凋亡通路22。caspase-3 的活化可切割 gasdermin E，进而触发细胞焦亡23。一项研究表明，MLKL/PIPK3 信号通路参与了 NLRP3 炎性小体的活化过程24。这种复杂的相互作用催生了 PANoptosis 的概念，即一种由 PANoptosome 复合物调控的、具有细胞焦亡、凋亡和/或坏死性凋亡关键特征的炎症性程序性细胞死亡通路，其特性无法单独由上述任何一种程序性细胞死亡通路解释25。随着 PANoptosis 概念的提出，科学家对程序性细胞死亡的发生过程有了更全面的描述，这也凸显了程序性细胞死亡的复杂性。同时，这也揭示了当前研究方法的局限性。尽管在 LPS/ATP 诱导的细胞死亡中，细胞焦亡被认为占主导地位，但仍无法确定这些死亡形式各自所占的比例，也无法确认它们是否均存在，甚至可能涉及其他类型的程序性细胞死亡。这将是未来值得深入探索的研究方向。
本方案基于LPS和ATP诱导的巨噬细胞死亡。我们描述了一种从整体到个体的检测方法，该方法同样适用于其他模型和细胞。实验结果表明，细胞可能经历了焦亡、凋亡或坏死性凋亡，并不仅限于焦亡，有助于研究人员更好地理解LPS和ATP刺激后的细胞死亡情况，并选择更合适的实验方法。在以往的研究中，通常采用Annexin V/7-AAD或Annexin V/PI双染法来指示凋亡的发生26, 27，部分研究人员也使用该方法研究凋亡28。实际上，我们无法通过这些双染法区分三种细胞死亡类型。本方案提醒研究人员，尤其是初学者，Annexin V/7-AAD或Annexin V/PI双染法不能定性细胞死亡的类型，仅能整体反映细胞损伤与死亡，或提示细胞可能发生了某种形式的死亡。在更精确的研究中，有必要引入抑制其他类型死亡的对照组，以确证程序性死亡的发生。类似地，进一步的机制研究将探讨不同类型程序性死亡的关键靶点。
此外，在实验准备过程中，我们发现目前针对贴壁细胞的扫描电镜（SEM）实验步骤已有许多详细描述，而对悬浮细胞的处理方法则鲜有介绍。本文提供了更为详尽的悬浮细胞样品制备方法。步骤5.5是辅助将悬浮细胞固定于细胞载玻片上的必要操作。后续操作必须轻柔进行，以防止细胞脱落。除铬明矾溶液外，聚-L-赖氨酸也可用于细胞固定。

细胞死亡是所有生物体中一种基本的生理过程。近年来，大量研究表明，细胞死亡参与了机体内的免疫反应与稳态维持。研究细胞死亡有助于我们更好地理解疾病的发生与发展。目前已描述了多种程序性细胞死亡形式，并鉴定出这些过程中的一些关键靶点。焦亡、凋亡和坏死性凋亡是三种在基因层面明确界定的程序性细胞死亡通路，参与机体稳态及疾病过程1。
细胞焦亡的特征是细胞膜上形成孔隙并释放细胞内容物。活化的caspase或颗粒酶可切割gasdermin蛋白，使其N端结构域被释放，随后发生寡聚化、与细胞膜结合并形成孔隙2,3,4。gasdermin形成的孔隙在细胞膜上提供了一种非典型的分泌通道，引发下游细胞反应，包括内容物释放和离子内流2,3,4。最终，细胞在ninjurin-1的促进下发生质膜破裂和焦亡性裂解5。在细胞凋亡过程中，活化的Bax和Bak在线粒体外膜上形成寡聚体，释放细胞色素C，该过程受到BCL-2家族促凋亡与抗凋亡蛋白、起始caspase（caspase-8、-9和-10）以及效应caspase（caspase-3、-6和-7）之间的平衡调控1,6,7。凋亡的形态学变化包括膜出泡、细胞收缩、核碎裂、染色质浓缩以及凋亡小体的形成6,8。受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK3）和混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）是坏死性凋亡通路中的两个下游核心组分1。RIPK3招募并磷酸化MLKL，磷酸化的MLKL（p-MLKL）发生寡聚化，与细胞膜结合，引发膜穿孔，导致离子内流，增加细胞内渗透压，最终引起细胞破裂6,9。gasdermin蛋白和MLKL分别通过结合质膜介导焦亡和坏死性凋亡，而BAX/BAK则通过结合线粒体外膜介导凋亡6。
尽管每条通路具有特定的机制和结果，但它们都会导致细胞膜发生相似的变化。正常情况下，磷脂酰丝氨酸（PS）仅定位于质膜的内小叶。然而，在细胞焦亡、细胞凋亡和坏死性凋亡的早期阶段，PS会暴露于质膜外侧。Caspase-3/caspase-7激活TMEM16和XKR家族蛋白，导致细胞膜不对称，并在细胞凋亡过程中使&#160;PS外翻10。Gasdermin D介导和MLKL介导的Ca2+内流导致细胞膜磷脂双分子层对称性丧失，从而引起PS暴露。这种暴露发生在细胞膜完整性丧失之前11,12。基于这三种程序性细胞死亡在细胞膜上引起的相似变化，我们采用流式细胞术分析Annexin V/7-氨基放线菌素D（7-AAD）双染色来检测细胞死亡。Annexin V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，对PS具有高亲和力，可作为灵敏的探针检测质膜表面暴露的PS13。7-AAD是一种核酸染料，无法穿透完整的细胞膜。它与常用的核酸染料碘化丙啶（PI）类似，具有相似的荧光特性，但7-AAD的发射光谱更窄，对其他检测通道的干扰更小。由于这些相似性，仅凭此方法不足以区分细胞焦亡、细胞凋亡和坏死性凋亡。我们使用流式细胞术从全细胞水平检测细胞死亡。第二种方法是利用扫描电子显微镜（SEM）捕获细胞膜形态，以观察单个细胞可能发生的死亡形式。
我们建立了脂多糖（LPS）和三磷酸腺苷（ATP）诱导的佛波醇-12-十四烷酸-13-乙酸酯（PMA）分化人单核细胞（THP-1）巨噬细胞脂质沉积模型，以观察细胞死亡。本方案侧重于观察细胞死亡，而非探究其作用机制。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰酶溶液（不含EDTA）</td><td>BOSTER 生物科技有限公司</td><td>PYG0068</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>CORNING</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>5 mL离心管</td><td>Labgic Technology Co., Ltd.&amp;nbsp;</td><td>BS-50-M</td><td></td></tr><tr><td>6孔板&amp;nbsp;</td><td>Sorfa Life Science Research Co.,Ltd</td><td>220100</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-PE/7-AAD 凋亡分析试剂盒</td><td>Absin（上海）生物技术有限公司</td><td>abs50007</td><td>Annexin V-PE、7-AAD、5&amp;times;结合缓冲液，凋亡阳性对照溶液</td></tr><tr><td>细胞培养 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Esco（上海）企业发展有限公司</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿，100 mm</td><td>Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>230301</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer K2 荧光细胞计数仪</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Cellometer K2</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer SD100 计数板</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>湖南湘仪实验室仪器开发有限公司</td><td>L530</td><td></td></tr><tr><td>铬明矾&amp;nbsp;</td><td>广东翁江化学试剂有限公司</td><td>PA04354</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，9 毫米</td><td>Labgic Technology Co., Ltd.&amp;nbsp;</td><td>BS-09-RC</td><td></td></tr><tr><td>临界点干燥仪</td><td>Quorum Technologies</td><td>K850</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>BOSTER 生物科技有限公司</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>电子显微镜固定剂</td><td>Servicebio Technology co.ltd&amp;nbsp;</td><td>G1102</td><td>2.5% 戊二醛，100 mM 磷酸盐</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>SHIMADZU</td><td>ATX124</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>成都科龙化工试剂有限公司</td><td>2021033102</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>FACSCanto &lt;图片替代文本&quot;公式 1&quot; 源文本：src=&quot;/files/ftp_upload/66831/66831eq01.jpg&quot; 样式=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术分析软件</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>BD FACSDiva&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 软件</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>广东翁江化学试剂有限公司</td><td>PA00256&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>高分辨率冷场发射扫描电子显微镜</td><td>TITACHI</td><td>Regulus 8100</td><td></td></tr><tr><td>人单核细胞系 THP-1</td><td>普罗赛尔生命科学&amp;amp;Technology Co., Ltd.</td><td>CL0233</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td>徕卡显微系统有限公司</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>红外涡旋混匀仪</td><td>VELP Scientifica Srl</td><td>ZX4</td><td></td></tr><tr><td>脂多糖&amp;nbsp;</td><td>北京索莱宝科技有限公司 &amp;amp; 技术有限公司&amp;nbsp;</td><td>L8880</td><td>LPS 来源于大肠杆菌 Escherichia coli 055:B5</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ATP</td><td>北京索莱宝科技有限公司 &amp;amp; 技术有限公司&amp;nbsp;</td><td>A8270</td><td></td></tr><tr><td>佛波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯&amp;nbsp;</td><td>北京索莱宝科技有限公司 &amp;amp; 技术有限公司&amp;nbsp;</td><td>P6741</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Servicebio Technology co.ltd&amp;nbsp;</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf AG</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，10 &amp;mu;L</td><td>Servicebio Technology co.ltd&amp;nbsp;</td><td>T-10PL</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 移液器吸头&amp;nbsp;</td><td>Servicebio Technology co.ltd&amp;nbsp;</td><td>T-1250L</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，200 &amp;mu;L</td><td>Servicebio Technology co.ltd&amp;nbsp;</td><td>T-200L</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 完全培养基</td><td>普罗赛生命科学&amp;amp;Technology有限公司</td><td>CM0233</td><td>RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05 mM &amp;beta;-巯基乙醇 + 1% 青霉素-链霉素</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基&amp;nbsp;</td><td>上海&amp;nbsp;基础培养基&amp;nbsp;有限公司</td><td>K211104</td><td></td></tr><tr><td>鞘液</td><td>贝克曼库尔特</td><td>8546733</td><td></td></tr><tr><td>溅射镀膜仪</td><td>Cressington Scientific Instruments Ltd</td><td>108</td><td></td></tr><tr><td>恒温水浴锅</td><td>国华电器有限公司&amp;nbsp;</td><td>HH-1</td><td></td></tr></tbody></table>

pma诱导分化的thp-1巨噬细胞中lps和atp诱导的死亡及其验证

LPS and ATP-induced Death of PMA-differentiated THP-1 Macrophages and its Validation

细胞死亡是所有生物体中的一种基本过程。本方案建立了一种脂多糖（LPS）和三磷酸腺苷（ATP）诱导的、经佛波醇-12-十四烷酸-13-乙酸酯（PMA）分化的人单核细胞（THP-1）来源巨噬细胞脂质沉积模型，用于观察细胞死亡。LPS联合ATP是一种经典的炎症诱导方法，常用于研究细胞焦亡，但细胞凋亡和坏死性凋亡也对LPS/ATP刺激有响应。正常情况下，磷脂酰丝氨酸仅定位于细胞质膜的内小叶。然而，在细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡的早期阶段，细胞膜仍保持完整，但磷脂酰丝氨酸暴露于膜外；在晚期阶段，细胞膜完整性丧失。本研究采用流式细胞术分析Annexin V与7-氨基放线菌素D（7-AAD）双染色，以检测整体细胞中的细胞死亡情况。结果显示&#160;，经LPS/ATP刺激后有大量细胞死亡。通过扫描电子显微镜，我们观察了单个细胞中可能存在的细胞死亡形态。结果表明，细胞在LPS/ATP刺激后可能发生焦亡、凋亡或坏死性凋亡。本方案重点在于观察LPS/ATP刺激后巨噬细胞的死亡情况。结果表明，LPS与ATP刺激后的细胞死亡不仅限于焦亡，也可能发生凋亡和坏死性凋亡，有助于研究人员更全面地理解LPS与ATP刺激后的细胞死亡类型，并选择更合适的实验方法。

细胞样品按照方案所述进行处理，并进行了流式细胞术检测。正常细胞不能被Annexin V和7-AAD染色（Annexin V-/7-AAD-）。在细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡的早期阶段，磷脂酰丝氨酸（PS）暴露并结合Annexin V，但细胞膜仍保持完整，可将7-AAD排除在细胞外（Annexin V+/7-AAD-）。在后期阶段，细胞膜完整性丧失，细胞同时被Annexin V和7-AAD染色，呈现双阳性结果（Annexin V+/7-AAD+）。坏死细胞仅被7-AAD染色（Annexin V-/7-AAD+）。图1显示，在LPS/ATP刺激后，Q2象限中的细胞数量显著增加，表明发生了细胞死亡。
我们使用扫描电镜（SEM）捕获细胞质膜表面，直接观察单个细胞的膜特征。 图2A 显示对照组细胞，图2B-D 显示经LPS/ATP刺激后的细胞。我们观察到具有细胞焦亡特征的细胞，包括膜出泡和膜破裂（图2B）；具有细胞凋亡特征的细胞，包括膜出泡和细胞皱缩（图2C）；以及具有坏死性凋亡特征的细胞，包括细胞肿胀和膜破裂（图2D）。
<img alt="流式细胞术结果；散点图和柱状图分析对照组与LPS/ATP细胞激活组。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66831/66831fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：通过流式细胞术检测Annexin V/7-AAD双染色。(A) Annexin V阴性且7-AAD阴性染色（Q4），Annexin V阳性且7-AAD阴性双染色（Q3），Annexin V阳性且7-AAD阳性染色（Q2），以及Annexin V阴性且7-AAD阳性染色（Q1）。(B) A图的定量数据。数据以均值±标准差表示（n=3），非配对t检验，**p &lt; 0.01。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66831/66831fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="对照组和LPS/ATP处理组细胞的扫描电镜显微照片，突出显示结构变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66831/66831fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：PMA诱导分化的THP-1巨噬细胞的扫描电子显微镜图像。（A） 对照组，放大倍数为5,000×/20,000×。（B, C, D） LPS/ATP处理组在5,000×/20,000×放大倍数下显示细胞膜起泡、膜破裂（↑）、细胞肿胀（↑）和细胞皱缩（↑）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66831/66831fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>

本实验方案基于LPS和ATP诱导的PMA分化THP-1巨噬细胞死亡。我们采用流式细胞术分析Annexin V与7-AAD双染色以检测细胞死亡，并利用全细胞进行扫描电子显微镜观察细胞膜形态。

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我们正在研究LPS和ATP诱导的PMA分化THP-1巨噬细胞死亡。LPS和ATP诱导的细胞死亡不仅限于细胞焦亡，也可能发生细胞凋亡和坏死性凋亡。这将有助于您更好地理解LPS和ATP刺激后的细胞死亡机制，并选择更合适的实验方法。铬染技术主要研究组织、细胞和微生物的外部结构。铬染技术为多种生物大分子复合物提供了类原生结构数据。例如，利用铬染技术进行三维重建有助于我们进一步理解焦亡和坏死性凋亡组分的特征。尽管在LPS和ATP诱导的细胞死亡中，细胞焦亡被认为是主要的死亡形式，但尚无法确定这种死亡方式的传播情况或其确切存在。验证多种细胞死亡形式并对其进行定量测量将是未来我们的研究方向。首先，获取已分化的THP-1细胞，并从培养板的孔中移除废弃培养基。用 PBS 洗涤细胞后，向细胞中加入含有脂多糖（lipopolysaccharide 或 LPS）的无血清培养基，并将培养板放入培养箱中孵育。然后，向模型组加入三磷酸腺苷（adenosine triphosphate 或 ATP）储备液，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 45 分钟。接着，吸除培养板各孔中的全部上清液。用 PBS 洗涤细胞两次后，向每孔加入 500 微升不含 EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶，孵育 30 秒。为终止细胞脱落，加入 1 毫升 RPMI 1640 培养基，将细胞转移至 5 毫升离心管中。在室温下以 300 ×g 离心 3 分钟。将细胞重悬于1毫升PBS中后，将含有细胞的离心管置于37摄氏度水浴中3分钟，然后离心。为重悬细胞，加入100微升1X结合缓冲液，并将细胞转移至一个新的5毫升离心管中。在避光、室温条件下，用适当的试剂孵育对照管和模型管。为终止孵育，在管中加入 400 微升 PBS，并轻轻涡旋混匀。将细胞悬液通过固定在 5 毫升聚苯乙烯圆底管上的 35 微米尼龙筛网过滤。将洁净的盖玻片浸入铬矾溶液中 2 小时，然后在 37 摄氏度的烘箱中干燥。将消化后的细胞按前述方法离心收集，并用500 µL电子显微镜固定液在室温下固定2小时，随后在4°C下过夜孵育。从固定液中收集细胞后，在室温下以300 ×g离心3分钟。加入100 µL PBS，轻轻吹打使细胞重悬。将细胞悬液滴加到盖玻片上，静置5分钟。吸除所有上清液，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。加入500 µL 1%的锇酸固定液。一小时后，吸除所有上清液。用 PBS 洗涤三次后，将样品置于浓度递增的乙醇中进行脱水。开启临界点干燥仪。打开二氧化碳气罐，将腔室冷却至10摄氏度。当腔室压力为0磅每平方英寸时，迅速用滤纸包裹样品并放入腔室。待温度稳定在35摄氏度且压力达到1,250磅每平方英寸后，以每分钟100磅每平方英寸的速度进行减压。当腔室压力为零时取出样品。最后，使用导电胶带将样品固定在扫描电子显微镜用铝制样品台。采用溅射镀膜仪，在样品表面覆盖一层2至5纳米厚的金膜。流式细胞术分析显示，经LPS/ATP刺激后，QT区域的细胞显著增加，表明细胞发生死亡。细胞质膜表面的扫描电镜图像显示，LPS/ATP刺激的细胞表现出焦亡的特征，包括膜出泡和破裂，而对照组细胞形态正常。此外，LPS/ATP刺激还导致细胞出现凋亡特征，如膜出泡和细胞皱缩；同时观察到具有坏死性凋亡特征的细胞，表现为细胞肿胀和细胞膜破裂。

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