Name: 使用数字叶面学和单位面积的叶质量用化石叶重建陆地古气候和古生态学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学习使用数字叶面学和单位面积的叶质量方法，通过化石叶片重建陆地古气候和古生态学。该方法利用连续叶性状与气候的强相关性，为研究古代植物群落的气候和生态提供可靠的重建模型。

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AJL 感谢华盛顿大学 2020-2022 年本科 Team Leaf 团队为开发 DiLP 有效培训材料所提供的动力和建议。AGF、AB、DJP 和 DLR 感谢卫斯理大学和贝勒大学的众多本科生，他们测量了现生和化石叶片，其反馈对于修改和更新本实验方案至关重要。作者感谢 PBot 定量性状工作组及 PBOT 团队鼓励开展本协议的规范化工作，使其更广泛地惠及科研群体。本研究得到了美国国家科学基金会（DLR 获资助项目 EAR-0742363，DJP 获资助项目 EAR-132552）和贝勒大学（青年研究者发展计划资助 DJP）的支持。我们感谢两位匿名审稿人及评审编辑所提出的反馈意见，这些意见有助于提升本实验方案的清晰性和全面性。

Digital Leaf Physiognomy for Paleoclimate and Paleoecological Reconstruction

本文介绍了如何在木本双子叶被子植物化石叶片上测量叶片形态的连续性状，并将其应用于基于现代校准数据建立的代用指标，以重建古气候和古生态。为此，必须确保方法学步骤与代用指标校准数据集中的方法保持一致5,6,10。这一考虑应从化石叶片采集阶段即开始，尤其涉及样本量问题。建议尽可能在较窄的地层范围内合并化石叶片组合，以获得足够数量的可测量标本和形态类型，从而最大限度地减少时间平均效应。同时建议，将古气候重建限定在具有至少350个可鉴定标本以及至少15–20种木本双子叶被子植物形态类型的遗址上19,51,52。此外，在选择用于分析的叶片时，建议尽可能多地测量每种形态类型的叶片数量，并至少选取能够代表该形态类型内叶片形态变异性的标本。
在实施制备和测量步骤时，必须格外注意与校准数据集保持一致。制备阶段的操作最有可能因操作者不同而引入主观性并导致结果差异。然而，若仔细遵循本方案，并经常参考附加注意事项表格（表2、表3）及规则文档（补充文件3），该方法可获得客观且可重复的叶片形态学测量结果。对于初次使用该方法的用户，建议由经验更丰富的人士协助确认叶片是否已正确制备。在测量叶柄宽度以用于MA重建时需特别谨慎。由于这些数值会被平方，测量中的任何不准确都会被放大。不完整的保存状态或样品损伤可能改变叶柄的尺寸，应仔细避免。 
这些方法存在一些值得注意的局限性。最重要的是，dilp R 软件包中包含的代用指标仅适用于木本双子叶被子植物，因此可能排除了古代群落中其他重要的植物类群。然而，已有针对具叶柄的广义裸子植物5,8、草本被子植物8以及蕨类植物9的基于叶片叶柄的物种级MA代用指标发表，用户可根据需要单独引入这些方法。在木本双子叶被子植物以外的植物类群缺失的情况下，对样地水平MA均值和方差的重建影响可能最为显著，因为这将导致对整个群落内经济策略的评估不完整。系统发育历史会影响叶片锯齿的出现23，因此分析具有新颖分类组成的化石群落时，可能会给估算结果带来不确定性，尽管这种潜在影响尚未经过检验和证实。
化石叶片还需要得到充分保存，才能进行超出叶缘状态的叶片形态计量学定量测量。对于DiLP方法而言，这一点对于全缘叶尤其重要，因为只有当整个叶片或半个叶片被保存下来或可被重建时，它们才能提供除叶缘状态之外的其他信息。同样，叶片只有在满足以下条件时才能用于MA重建分析：（1）叶柄在叶片基部的着生部位被保存下来，或在特定情况下，叶片基部及中脉最基部区域被保存（见步骤3.6中的注释）；（2）能够估算叶片的大小，可通过完整叶片测量或半叶重建实现。这意味着某些形态类型可能完全无法纳入站点级别的MA分析。最后，时间是本实验方案的一个限制因素，因为用于古气候重建的单变量替代方法所需时间相对较短。
尽管存在这些局限性，DiLP 和 M 的使用仍然具有重要意义A 重建方法相较于其他方法仍具有若干优势。MA 重建是化石记录中复原叶片经济策略的少数可行方法之一，利用二维叶柄宽度和叶面积测量值，可基于常见的印痕/压型叶化石进行重建。对于DiLP方法而言，引入多个与气候功能相关联的连续性测量指标，有助于提高测量的可重复性以及气候重建结果的准确性6,13本方案旨在通过利用叶片碎片进行叶缘锯齿度测量，以应对化石记录的不完整性。尽管叶面积的连续测量可提供更多关于叶片大小的信息，但为增加样本量，可结合使用叶片大小分级的方法来补充基于连续测量的DiLP MAP估算结果。16,53 或通过结合叶片面积的叶脉比例估算42,54,55与大多数复杂方法一样，随着使用者在操作中积累经验并增强信心，该方案的时间效率将会提高，尤其是在准备步骤方面。按照本方案进行位点水平DiLP测量的事实已表明 &#62;150 现代6,10,56 迄今已有至少22个化石组合证实了其可行性6,38,39,40,41,42最后，叶片形态的全面测量具有超出本文讨论范围的应用价值，可有助于描述植物生态学、生理学、进化及发育的其他方面，并适用于现代56 以及古生态学研究40.
总之，实施本文详述的方法可使用户利用可靠且可重复的方法重建古气候与古生态。这些方法为展示气候和生态系统对环境扰动的过往响应实例提供了重要机会，并有助于进一步揭示地球自然系统之间复杂的相互作用。

叶片是基本的生产单位，能够促进植物与其周围环境之间能量（如光、热）和物质（如二氧化碳、水蒸气）的交换1,2。为了实现这些功能，叶片必须在静止和有风的空气中依靠机械结构支撑自身重量以抵抗重力3,4。由于这些内在联系，叶片的大小、形状和叶缘锯齿特征（即形态学）在多个方面反映了其功能和生物力学特性，并为了解其生存环境与生态提供了重要线索。以往研究已量化了现代全球范围内叶片形态学与气候及生态之间的关系，建立了可用于化石叶片组合的代用指标5,6。这些代用指标为重建古气候和古生态提供了重要机会，有助于更深入理解地球历史上各系统之间复杂的相互作用。本文详细介绍了两种代用指标的应用方法：1）基于单位叶面积质量的古生态重建方法；2）数字叶片形态学用于古气候重建。
单位叶面积干重（MA）是新近纪植物学和古植物学中常被测定的植物性状。MA 的主要价值，尤其是对于化石重建而言，在于它是叶片经济谱的一部分；叶片经济谱是一组高度相关叶片性状的综合轴线，包括叶片光合速率、叶片寿命以及单位质量叶片的养分含量7。通过化石重建 MA 的能力，为我们了解这些原本无法获取的代谢和化学过程提供了窗口，并最终揭示有关植物生态策略和生态系统功能的有用信息。
Royer 等人5提出了一种基于叶片面积和叶柄宽度来估算木本双子叶被子植物（非单子叶植物）化石叶片MA的方法。理论上，叶柄起到悬臂的作用，将叶片重量维持在最佳位置3,4。因此，构成梁强度最主要部分的叶柄横截面积应与叶片质量高度相关。通过将叶柄形状简化为圆柱形管状结构，叶柄横截面积可用叶柄宽度的平方来表示，从而能够从二维化石中估算叶片质量（更多细节见 Royer 等人5）。叶片面积可直接测量。叶柄宽度的平方除以叶片面积（即叶柄度量指标；表1）共同构成了对化石MA的良好代用指标，使古植物学家得以进入现代基于性状的生态学研究领域。MA重建方法还已扩展至阔叶具柄裸子植物5,8、草本被子植物8以及蕨类植物9，这些类群所得到的关系不同于木本双子叶被子植物之间的关系，也彼此不同。扩展后的木本双子叶植物数据集以及用于重建样地水平MA均值与方差的新回归方程，使得推断化石植物群中木本双子叶被子植物叶片经济策略的多样性及其主要策略成为可能10。
一个世纪以来，人们已经注意到植物叶片形态特征与其生长气候之间的关系11,12。具体而言，木本双子叶被子植物叶片的形态特征与温度和湿度密切相关13。这一关系已成为众多单变量14,15,16,17 和多变量6,18,19,20,21,22 叶片形态古气候代用指标的基础。在过去约1.2亿年（白垩纪至今）的地球历史中，单变量和多变量叶片形态古气候方法已被广泛应用于各大洲以被子植物为主的化石植物群研究23。
叶片形态学古气候代用指标中利用的两个基本观测现象是：1）叶片大小与年均降水量（MAP）之间的关系，以及2）叶片锯齿（即叶片边缘向外突出的部分）与年均温度（MAT）之间的关系。具体而言，某一地区所有木本双子叶被子植物物种的平均叶片大小与年均降水量呈正相关，而该地区具有锯齿状叶片的木本双子叶被子植物物种所占比例，以及锯齿的大小和数量，则与年均温度呈负相关6,12,13,14,15,16,24。
这些叶片形态特征与气候之间关系的功能性联系，在理论和观测上均得到了有力支持1,2,25。例如，尽管较大的叶片可提供更大的光合作用表面积，但其需要更强的结构支撑，通过蒸腾作用会损失更多的水分，并由于更厚的边界层而保留更多的感热1,26,27。因此，在更湿润、更炎热的环境中，较大叶片更为常见，因为蒸腾作用增强所导致的水分流失能够有效冷却叶片，且在此类环境中水分补充相对充足，问题较小。相比之下，在干燥炎热的气候中，较小的叶片通过减少水分流失并增加感热散失来避免过热28,29。然而，对于其他叶片性状而言，究竟是哪些因素或因素组合对解释其功能性联系起主导作用，目前仍不明确。例如，针对叶片锯齿与年均温（MAT）关系的解释，已有多种假说被提出，包括叶片冷却、芽体高效包装、对较薄叶片的增强支撑与养分供给、通过排水器进行吐水作用，以及提高生长季早期的生产力等30,31,32,33。
大多数叶片形态古气候代用指标依赖于对叶片性状进行类别划分，而非对连续变量进行定量测量，这导致了若干潜在的缺陷。类别化方法排除了纳入与气候高度相关的连续性测量所捕获的更详细信息（例如锯齿数量、叶片狭长程度），从而可能降低古气候估算的准确性6,20,34。此外，在某些叶片性状评分方法中，被类别化评分的性状可能具有模糊性，导致可重复性问题，且部分性状与气候之间功能联系的实证支持有限6,15,16,35,36。
为解决这些不足，Huff 等人20提出了一种称为数字叶形态学（digital leaf physiognomy, DiLP）的方法，用于数字化测量连续的叶片性状。与以往方法相比，DiLP 的一个关键优势在于其依赖的性状具有以下特点：1）可在不同使用者之间可靠测量；2）在本质上是连续的；3）在功能上与气候相关联；4）在不同生长季节之间表现出表型可塑性6,37。这使得 DiLP 对年均温（MAT）和年均降水量（MAP）的估算比以往基于叶片形态学的古气候方法更为准确6。此外，该方法通过提供处理受损和不完整叶片的步骤，适应了化石记录不完整的特性。DiLP 方法已成功应用于来自多个大陆、跨越广泛地质年代的多种化石植物群6,38,39,40,41,42。
以下方案扩展了先前研究中描述的方法5,6,20,34，旨在说明利用木本双子叶被子植物化石叶片，结合DiLP和MA重建方法，重建古气候与古生态所需的各项操作步骤（有关本方案所测量与计算变量的解释，请参见表1）。此外，本方案还提供了用于记录和计算叶性状的步骤，这些性状虽未包含在DiLP或MA分析中，但易于实施，并可对叶片形态提供有价值的表征信息（表1）。本方案按以下顺序进行：1）化石叶片成像；2）叶片数字化处理，分为五种可能的处理情景；3）叶片数字化测量，同样按这五种可能的处理情景组织；4）使用R语言程序包dilp进行DiLP和MA分析10。
M的实验方案A 重建被嵌入在DiLP方案中，因为两者便于同时准备和测量。如果用户对M感兴趣A 仅用于分析时，无论叶缘是否具锯齿，均应遵循DiLP制备方案2中所述的制备步骤，以及仅包含叶柄宽度、叶柄面积和叶面积测量的测量步骤。随后，用户可在dilp R软件包中运行相应的函数以执行MA 重建

<table><tbody><tr><td>复制架或三脚架</td><td></td><td></td><td>用于化石摄影</td></tr><tr><td>数码相机</td><td></td><td></td><td>用于化石摄影，建议使用高分辨率相机</td></tr><tr><td>图像编辑软件&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>用于数字处理。示例包括 Adobe Photoshop 和 GIMP，后者为免费软件（https://www.gimp.org/）</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>IJ1.46pr</td><td></td><td>用于进行数字测量，免费软件（https://imagej.net/ij/index.html）</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>或类似的数据录入软件</td></tr><tr><td>R 软件</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>用于运行提供的 R 脚本（https://www.r-project.org/）。RStudio 提供用户友好的 R 环境（https://posit.co/download/rstudio-desktop/）。两者均为免费软件。</td></tr><tr><td>dilp R 程序包</td><td></td><td></td><td>可按照此处说明进行安装：https://github.com/mjbutrim/dilp</td></tr></tbody></table>

利用数字叶形态学和单位叶面积质量通过化石叶片重建陆地古气候与古生态

Reconstructing Terrestrial Paleoclimate and Paleoecology with Fossil Leaves Using Digital Leaf Physiognomy and Leaf Mass Per Area

气候和环境强烈影响植物叶片的大小、形状和锯齿特征（叶形态）。这些关系，特别是在木本双子叶被子植物中，已被用于开发基于叶片的古气候和古生态代用指标，应用于重建地球历史上过去约1.2亿年来的陆地古生态系统。此外，由于这些关系已在现存植物中得到记录，因此对于理解植物进化特征以及植物如何响应气候和环境变化具有重要意义。为了对现代和化石植物进行此类分析，必须采用可重复的方法准确测量叶片形态特征。本方案描述了一种基于计算机的方法，用于测量和分析现代及化石叶片中的多种叶形态变量。该方法可测量叶形态性状，特别是与叶缘锯齿、叶面积、叶裂程度和狭长性相关的变量，这些变量被用于数字叶形态代用法重建古气候；同时也可测量叶柄宽度和叶面积，用于重建单位叶面积质量，这是一种古生态代用指标。由于这种数字化叶片性状测量方法可应用于化石和现存植物，因此其应用不仅限于古气候和古生态重建，还可用于探索可能有助于理解叶片形态功能、叶片发育、叶性状系统发育关系以及植物进化的叶片性状。

本研究采用先前发表的来自不列颠哥伦比亚省中南部早始新世麦卡比（McAbee）化石遗址的叶片形态测量数据集，以展示数字叶片形态学（DiLP）和单位面积叶片质量（MA）两种重建方法的代表性结果（Lowe 等人38；数据见补充文件2）。该遗址为在高地火山地貌背景下重建新生代最温暖时期（即早始新世气候最适宜期）的古气候与古生态提供了重要机会38,45,46,47。化石组合采自湖相沉积序列中两个独立的层位，分别命名为H1（厚28 cm）和H2（厚27 cm），通过普查法在狭窄的地层范围内进行整合取样，即收集或统计所有可归入特定形态类型的标本38,48。
McAbee 叶片形态数据通过了 dilp_errors() 标记的误差检查，经 dilp_outliers() 标记的七个离群值也进行了复核，以确保这些数值反映的是数据中真实的变异，而非方法学上的错误。随后，数据通过 dilp() 函数用于古气候重建，并通过 lma() 函数进行单位面积叶片质量的重建。
MA 重建结果及其95%预测区间的下限和上限已报告于 表4 在物种和位点水平上，使用Royer等人提出的方法进行计算。5 以及 Butrim 等人10重建值在 M 的范围内A 现代陆生物种的典型值（30-330 g/m）2)49. 使用 Royer 等人所述的阈值5，大多数物种具有重建的 MA 与叶片寿命相一致的 &lt;1年（≤87克/米）2），约1年（88–128 克/平方米）2），而没有一种是典型的 &gt;1年（≥129克/米）2）。位点M的重建A 均值和方差在McAbee反映了该地点叶片经济策略的普遍性与多样性10,50H1与H2时期在位点均值和方差之间无显著差异，因此没有证据表明这两个时间段内叶片经济策略的组成和多样性存在变化。此外，使用Royer等人提出的方程进行的位点均值重建结果也支持这一结论。5 以及 Butrim 等人10 非常相似。
使用Peppe等人6中提出的多元线性回归（DiLP）以及单一线性回归（叶缘和叶面积分析）方程对年均温（MAT）和年均降水量（MAP）进行重建的结果见表5。若化石叶片组合的叶片形态特征落在校准数据集的形态空间范围内，则古气候估算结果最为可靠。这一评估通过函数dilp_cca()执行的典范对应分析（CCA）步骤完成。McAbee H1和H2均位于校准数据集中观察到的叶片形态范围之内（图7A）。如果某遗址的重建值超出校准空间范围，则应谨慎解释其古气候重建结果（例如，需结合独立的证据进行比对；详见Peppe等人6的进一步讨论）。H1和H2的MAT与MAP重建结果均表明其属于温带季节性生物群系（图7B、C），这与独立证据高度一致，包括基于McAbee化石植物群和昆虫群最近现生亲缘种所推断的结果45。
<img alt="化石叶片形态：羽状脉和掌状脉，具裂片，无裂片示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66838/66838fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：本文中使用的叶片形态及结构术语。（A）羽状脉、无裂片、全缘叶；（B）掌状脉、无裂片、具锯齿叶；（C）羽状脉、具裂片、全缘叶；（D）掌状脉、具裂片、具锯齿叶。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/66838fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="叶片形态分析流程图；完整边缘与锯齿边缘情景；叶片测量方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66838/66838fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：方法流程图。 该流程图展示了不同的叶片保存状态和叶片类型如何决定可可靠测量的叶片性状类型（黄色框）。这将决定本实验方案中采用的制备情景，以及数据录入表格中应填写数据的列（项目符号所示）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/66838fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="化石叶片复原情景；示意图展示各种制备方法及结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66838/66838fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：不同的制备情景。 不同的制备情景，展示已完成数字化制备、可用于测量阶段的图像示例。(A) 情景1，全缘叶，其整体面积或半叶面积无法重建；(B) 情景5，具锯齿叶，其整体面积或半叶面积无法重建，且不具备≥2个连续锯齿和/或保存叶片比例不足25%；(C) 情景2，全缘叶，其整体面积或半叶面积得以保存或可被重建；(D) 情景3，具锯齿叶，其整体面积或半叶面积无法重建，但具有≥2个连续锯齿且保存叶片比例≥25%；(E) 情景4，具锯齿叶，其整体面积或半叶面积得以保存或可被重建。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/66838fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="化石叶片重建示意图；叶片形态与模式分析，含比例尺参考。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66838/66838fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：损伤去除示意图。 展示如何切除受损边缘以及邻近该受损边缘的叶片区域。红色虚线表示使用套索工具进行选择的方式。请注意，损伤边界的起始位置有意选在主齿的缺刻处（参见补充图2以帮助区分主齿与次级齿）。(A) 一种羽状脉叶片，其选择范围延伸至中脉。(B) 一种掌状脉叶片，其选择范围延伸至最近的主脉。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/66838fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="叶脉模式分析示意图，展示分形几何结构及放大后的叶脉细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66838/66838fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：展示如何裁剪出叶齿的示例。（A）红色虚线表示如何使用套索工具进行选择。请注意，本例中叶齿为复合型，因此仅在主级缺刻之间进行选择（参见补充图2以帮助区分主级叶齿与次级叶齿）；（B）叶齿选择方式的放大视图，红色圆点表示选择过程中鼠标点击的位置；（C）去除叶齿后叶片的复制图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/66838fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="化石叶片测量示意图，记录面积、形状和叶齿参数，用于古植物学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66838/66838fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：制备方案4的示意图。 以按方案4制备的一个叶片为例，展示其制备决策和测量步骤。(A) 一种制备方案，其中决定采用半片叶片以获得最可靠的叶形和叶面积测量结果，并保留两侧中段的叶缘用于叶齿参数测量。(B) 一个示例，展示在制备后的叶片各部分所测量的不同变量。加粗文字标示了用于DiLP和MA分析所需的测量参数，而非加粗文字（叶片周长、最小费雷特直径和人工中周长）则标示了虽非必需但对其他形态特征描述（例如形状因子和紧密度；表1）有帮助的测量参数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/66838fig06largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="气候数据分析；年均降水量与温度关系；多色生物群落带图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66838/66838fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：代表性结果。 来自Lowe等人38在早始新世McAbee化石层采集的两个化石层位（H1和H2）的结果。（A）典型对应分析，显示校准数据集中多变量叶片形态特征的表现。校准数据来自Peppe等人6。两个McAbee层位的叶片形态特征叠加显示，位于校准空间之内。（B和C）利用Peppe等人6提出的方程估算的温度和降水量及其相关不确定性（模型标准误差），并将两个McAbee层位的结果叠加于Whittaker生物群落图上。（B）使用数字叶片形态学（DiLP）多元线性回归模型（MLR）重建的估算值，（C）使用叶片面积分析（LAA）和叶片边缘分析（LMA）单一线性回归（SLR）方程重建的估算值，并将两个McAbee层位的结果叠加于Whittaker生物群落图上。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/66838fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：叶片形态学变量。 本方案中测量和/或计算并用于预测模型中的变量，以重建叶片单位面积干重（MA）、年均温（MAT）和年均降水量（MAP）。MAT和MAP采用Peppe等6提出的方程进行重建，其中数字叶片形态学（DiLP）采用多元分析方法，叶缘分析（LMA）和叶面积分析（LAA）采用单变量分析方法。标记为“其他”的变量未用于MA、DiLP、LMA和LAA分析中，但仍根据本方案进行测量和计算，因其易于实施并可提供对叶片形态特征的有用描述。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2： 准备步骤的其他注意事项和说明。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3： 测量步骤的其他注意事项和说明。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/Table%203_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4：基于Lowe等人38的研究对McAbee化石层位的叶片单位面积干重（MA）及其95%预测区间上下限的重建结果。重建分别基于形态型均值5、样地均值5,10以及样地方差10进行。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/Table%204_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表5：利用Peppe等人6提出的数字叶形态学（DiLP）的多元线性回归（MLR）以及叶缘分析（LMA）和叶面积分析（LAA）的单一线性回归（SLR），对中国台湾早始新世McAbee化石层位H1和H2层的年均温度（MAT）与年均降水量（MAP）进行的重建结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/Table%205_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充图 1：哈佛森林的红栎（Quercus rubra）叶片，展示裂片与锯齿的判别规则。 文中已定义线段 p 和 d。比例尺 = 1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/Supplementary%20Figure%201_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 2：哈佛森林的Betula lutea叶片，展示区分次级齿与主齿的规则。 图中孤立的叶片部分已放大 2 倍。蓝色线条连接切入程度最大的叶凹（即主级叶凹），与这些叶凹相关的齿视为主齿（蓝色箭头）。红色圆点标记的齿可被识别为次级齿，因其顶端叶凹的切入程度较小。红色箭头所指的齿与主齿的切入程度相似，但可通过其相对较细的主脉来判断为次级齿。比例尺 = 1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/Supplementary%20Figure%202_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：牙齿状突起选择、羽状裂片规则及裂片优先规则示意图。（A）来自Huyck保护区的Hamamelis virginiana叶片的牙齿状突起选择。深色区域代表被纳入总体牙齿状突起统计的叶组织，因为次级齿与主齿已作区分。（B）来自IES的Quercus alba叶片展示了裂片优先规则。深色区域被测量为裂片，未着色区域被测量为牙齿状突起，但根据裂片优先规则，所有突出部分均被视为裂片。比例尺 = 1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/Supplementary%20Figure%203_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图4： Acer saccharum 来自阿勒格尼国家森林的叶片，用于说明延伸规则和单齿规则。 虚线表示所选牙齿，实线表示相应牙齿的对称轴。黑色区域为用于压平叶片以便拍照的配重。比例尺 = 1 cm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/Supplementary%20Figure%204_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充图5：展示如何从心形基部上方切割叶柄的正确方法。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/Supplementary%20Figure%205_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 1：所有测量的数字叶形态变量的数据录入模板。此文件不应被修改，因为它将用作 R 软件包的输入文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/Supplementary%20File%201%20(data%20entry%20template)_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：来自 Lowe 等人38研究中 McAbee 化石层的示例数据。 该数据用于生成图 7，并用于代表性结果的讨论。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/Supplementary%20File%202%20(McAbee%20example%20data)_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件3：化石数字化叶片形态学规则文档。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66838/Supplementary%20File%203%20(Rules)_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案展示了利用数字叶形态学和单位叶面积质量重建方法，对化石叶片的连续叶形态特征进行数字化测量与分析，以重建古气候和古生态环境。

气候和环境对植物叶片的大小、形状和叶缘锯齿特征（形态学）具有显著影响。这些关系在木本植物中尤为明显……

我们的研究重点是理解现代植物的性状与气候及生态之间的关系。通过这些关系，我们可以建立代用指标或模型，用于重建古代植物群落的气候与生态环境。近期的研究集中于探讨植物性状与气候及生态之间关系的生物学、生理学和进化基础，涵盖当今以及过去的情况。本研究显示，植物性状在单个植物的生命周期以及进化时间尺度上均会对气候和生态作出响应。我们的研究证明，尽管影响植物性状的因素十分复杂，但叶片性状与气候及生态之间仍存在非常显著的经验关系。我们利用这些关系建立了用于重建气候与生态的模型，这些模型已在地球历史不同时期的多种环境中得到应用。这些方法改进了古气候和古生态的重建，使我们能够更全面地理解陆地生态系统和气候，而这种理解仅通过研究现代地球即可获得。随着气候和生态系统对人类活动影响的响应，这种视角对于理解未来地球的状况至关重要。这是一种基于叶片形态学的方法，意味着它不需要精确的分类学鉴定。此外，DiLP 采用对连续型叶片特征进行数字化测量，而非定性或分类性测量，从而提高了可重复性，且这些叶片特征与气候具有功能上的关联。首先，将叶片化石置于相机下方，并确保其尽可能平放。拍摄化石叶片照片，并对图像文件进行适当命名。然后，在图像处理软件中打开一张叶齿图像，其面积在图像中得以保留或可被重建，如有必要，对图像进行裁剪。选择图像，然后选择画布以增加工作区域的宽度。在当前画布的左侧或右侧添加一个新的画布。现在确定叶片的制备方法，决定是使用整片叶片还是半片叶片进行面积和形状测量。使用套索工具，沿叶片边缘进行描迹，如果存在叶柄，也应包括在内。将选定的叶片部分复制并粘贴到画布的空白区域，制作两份副本，一份为原始副本，另一份作为备份，以便在需要时恢复。从叶缘的可见部分追踪至其与叶柄相接处，该位置通常颜色较深且无明显叶脉。在此处放置一个套索点，并对另一半叶缘重复此操作。围绕整个叶柄画出选区，以完成选择。然后，剪切并粘贴叶柄。复制已去除叶柄的离体叶片，并将其放置在画布的空白区域。使用套索工具修剪多余的叶片组织，以确保制备时保留完整的半片叶片；若需制备整片叶片，则保持叶片完整不剪裁。使用线条或画笔工具，用适当颜色和粗细的线条修复叶片边缘的任何受损区域。对于叶片的锯齿测量，复制该叶片并将其放置在画布的空白区域。使用套索工具去除边缘受损部分相邻的区域。从损伤区域边缘的某一点开始选择，沿垂直于主脉的方向画一条直线。选择起点应位于靠近损伤处、保存最完整的乳牙窦。沿主脉继续选择，直至与损伤边缘的另一边界齐平。然后从主脉垂直画一条直线至叶缘。删除叶片的受损部分，并对所有受损区域重复此操作。复制用于齿测量的叶片版本，并将其粘贴至画布的空白区域。使用套索工具将叶片上的齿状结构去除。从叶尖、裂片尖端或叶片碎片的顶端开始，沿叶片、裂片或碎片依次选择每个主齿的齿间。在选中基部最深的齿间后，应用延伸规则，切除该序列中的最后一个齿状部分。通过切割并将叶缘锯齿移至叶片旁，去除锯齿，确保移除的锯齿不接触原始叶片。首先打开 ImageJ 软件，并设置自动测量参数。进入“分析”菜单，选择“设置测量”。然后选择面积、周长和费雷特直径的选项。接着，通过选择“文件”和“打开”来打开已准备好的化石叶片图像。使用直线工具放大比例尺，并在其上尽可能绘制最长的直线。为设定图像比例尺，点击“分析”并选择“设定比例”。输入比例尺的实际长度（单位：厘米），然后点击“确定”。在数据录入电子表格中，将叶片标记为 0（有齿）或 1（全缘）。此外，如果存在叶柄，测量叶柄宽度，并将数据记录在数据录入电子表格中。然后，选择图像，输入八位以将叶片图像转换为黑白图像。转到图像调整和阈值设置。首先，对图像进行阈值分割。通过滑动滑块条，调整阈值，直到叶片内部变为红色，并与背景明显区分开来。放大叶缘的各个部分以确保准确性。测量已去除叶柄、用于叶面积和叶形测定的叶片时，使用一种工具并点击叶片内部，以黄色线条勾勒其轮廓，确保该轮廓准确反映叶片的形状。通过“分析”和“测量”功能或使用指定的键盘快捷键进行测量，并将数据记录在电子表格中。进行半叶分析时，在线工具中选择分段线工具，沿人工中周长的整个长度进行描迹。然后点击分析并测量，或使用快捷键来测量人工中周长的长度。记录面积、周长、Feret 直径、最小 Feret 直径以及人工中周长的长度。在数据录入电子表格中，若测量对象为半片叶子，需将叶面积和最小费雷特直径乘以二进行校正。并根据给定公式计算叶片周长。如果存在切除的叶柄，需测量其切口部分的面积并记录。测量原始叶片时，使用一种工具选择以黄色标出的叶片内部区域。然后单击“分析”和“测量”，或使用键盘快捷键进行测量。在数据录入电子表格中，将原始叶片的面积和周长记录在指定字段中。测量内部原始叶片时，选择叶片内部区域，并用黄色标出整个叶片的轮廓。通过点击“分析”和“测量”或使用快捷键进行测量。在数据录入电子表格中对应的字段下记录内部原始叶片的面积和周长。通过点击阈值框中的“重置”按钮，或使用“编辑”和“撤销”来移除黑白转换等修改，清除阈值以清晰显示叶片。然后，使用分段线工具沿切割边界的全长进行描迹。通过点击“分析”和“测量”或使用快捷键，测量已描迹的边界长度。为了统计乳牙的数量，首先右键单击点工具以选择多点工具。依次单击每颗乳牙对其进行编号。若需删除误选的点，可在单击该点的同时按住 alt 键或 command（CMD）或 option 键。在数据录入电子表格中记录乳牙的最终数量。单击“编辑”、“选择”并选择“无”，以清除多点工具的计数和标注。然后，为统计牙齿总数，右键单击点工具并选择多点工具。依次点击每颗牙齿，包括主齿和副齿，对其进行编号。McAbee H1 和 H2 两个剖面显示的叶片形态均在校准数据集范围内，表明所获得的古气候估算结果具有可靠性。McAbee H1 和 H2 的重建年均温和年均降水量表明该地区为温带季节性生物群系。

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环境

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