Name: 在基于高吸水性聚合物的自养系统上接种和观察丛枝菌根培养物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 了解在高吸水性聚合物自养系统上接种和观察丛枝菌根真菌的方法。该技术可实现实时监测和高效建立单孢培养物，为研究AMF与植物根系的相互作用提供新平台。

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我们感谢两位匿名审稿人的建议。本研究由加拿大农业与农业食品部（AAFC）资助，项目编号为 J-002295（加拿大农业与农业食品部生物样本库的管理与提升）。

1. 双室培养皿的改造
注意：此步骤所需的材料列在材料表中。
<ol>
	<li>改造培养皿盖。
	<ol>
		<li>使用旋转工具和合适的雕刻钻头，在盖子顶部钻两个孔（直径约 7 mm），并在侧面开一个 1 cm 的开口。其中一个孔用于灌溉根系（蛭石）区室，另一个用于菌丝（SAP）区室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>改造培养皿底部。
	<ol>
		<li>使用电动旋转工具在培养皿底部侧面钻一个用于植物茎秆的凹槽。注意凹槽不宜过深，以免液体流失。该凹槽将与盖子上的 1 cm 开口对齐（步骤 1.1）。</li>
		<li>为用尼龙网滤膜替代双区室培养皿中的塑料隔板，使用电动旋转工具向下钻一个 30 mm 的矩形凹槽，直至培养皿底部。</li>
		<li>为实现高分辨率观察，在培养皿底部钻直径约 25 mm 的圆形孔。根据需要，可在 SAP 区室一侧开一个或多个孔，或在每个区室各开一个孔。确保所钻孔位不与盖子上的灌溉孔垂直对齐。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装尼龙网滤膜。
	<ol>
		<li>使用金属导板和回形针将尼龙网滤膜固定到位，并将其牢固压在塑料隔板上。使滤膜顶部与塑料隔板顶部对齐，并确保滤膜从导板底部伸出。</li>
		<li>使用电烙笔工具，沿金属导板边缘切割，使滤膜熔融并密封至培养皿底部及分隔两个区室的塑料隔板上。</li>
		<li>保持金属导板和回形针固定，用镊子小心去除多余的尼龙网滤膜。</li>
		<li>在解剖显微镜下检查，确认尼龙网滤膜已与塑料完全密封，防止根系侵入菌丝（SAP）区室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装盖玻片。 
	注意：盖玻片置于培养皿底部下方。此设计可使用浸油，并便于清洁盖玻片。
	<ol>
		<li>沿圆形孔边缘（培养皿底部外侧）涂抹硅胶密封剂。</li>
		<li>将盖玻片贴附于培养皿底部外侧，轻轻按压以确保完全粘合。</li>
		<li>静置晾干，并用刀片去除多余的密封剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查与清洁。
	<ol>
		<li>使用气流吹除可能附着在培养皿上的灰尘或塑料碎屑。</li>
		<li>在解剖显微镜下检查，发现并修正任何缺陷。 
		注意：佩戴手套，避免在培养皿上留下指纹</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 配制1升营养液mMS-1
<ol>
	<li>配制储备液。
	<ol>
		<li>大量元素：称取以下试剂并溶于 1 L 蒸馏水中： 
		7.31 g MgSO4·7 H2O、0.80 g KNO3、0.65 g KCl 和 0.048 g KH2PO4，。</li>
		<li>称取 2.88 g Ca(NO3)2·4H2O，溶于 1 L 蒸馏水中。</li>
		<li>称取 0.80 g NaFeEDTA，溶于 0.5 L 蒸馏水中。</li>
		<li>称取 0.375 g KI，溶于 0.5 L 蒸馏水中。</li>
		<li>微量元素
		<ol>
			<li>将 3 g MnCl2·4H2O 溶于 100 mL 蒸馏水中。</li>
			<li>将 1.325 g ZnSO4·7H2O 溶于 100 mL 蒸馏水中。</li>
			<li>将 0.75 g H3BO3 溶于 100 mL 蒸馏水中。</li>
			<li>溶解后，混合步骤 2.1.5.1–2.1.5.3 中制备的溶液。</li>
			<li>称取 0.65 g CuSO4·5H2O，溶于 50 mL 蒸馏水中。</li>
			<li>将 0.12 g Na2MoO4·2H2O 溶于 100 mL 蒸馏水中。</li>
			<li>向步骤 2.1.5.4 所得溶液中加入 5 mL 步骤 2.1.5.5 的溶液和 1 mL 步骤 2.1.5.6 的溶液。</li>
			<li>用蒸馏水将步骤 2.1.5.7 所得溶液定容至 500 mL。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 1 L mMS-1 培养基。
	<ol>
		<li>向一个 2 L 玻璃瓶中加入 700 mL 蒸馏水。</li>
		<li>在磁力搅拌条件下，依次加入 100 mL 大量元素溶液（步骤 2.1.1）、100 mL 硝酸钙溶液（步骤 2.1.2）、5 mL 柠檬酸铁 EDTA 溶液（步骤 2.1.3）、1 mL KI 溶液（步骤 2.1.4）和 1 mL 微量元素溶液（步骤 2.1.5）。</li>
		<li>用蒸馏水将溶液定容至 1000 mL。 
		注：mMS-1 培养基改编自 Bécard 和 Fortin（1988）14。由于 SAP-AS 非无菌体系，因此可在 121 °C 下灭菌 15 分钟，但此步骤为可选。pH 无需调节，因为 SAP 具有较强的缓冲能力，且 Paré 等（2022）12 表明 SAP 上的环境相对中性（pH 6.7 至 7.4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. SAP 的制备
注意：此步骤所需的材料列在材料表中。
<ol>
	<li>水化SAP：将5 g干SAP与500 mL mMS-1营养液（步骤2.2）混合。</li>
	<li>在室温（RT）下静置水化12小时（过夜）。</li>
	<li>沥干并收集水化后的SAP颗粒。
	<ol>
		<li>当将水化后的SAP用于填充12孔板（第7节）时，不要沥干水化SAP，需将水化颗粒与剩余的mMS-1营养液一同使用。 
		注意：干SAP有三种粒径规格：小、中、大。中等粒径（1–2 mm）最为合适。大粒径SAP水化后膨胀过度，导致培养皿盖无法闭合；而小粒径SAP颗粒间空隙过小，不利于观察颗粒间真菌结构。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 幼苗的制备
注意：此步骤所需的材料列在材料表中。
<ol>
	<li>在培养皿中，将P. lanceolata种子置于用mMS-1营养液润湿的滤纸上进行萌发。</li>
	<li>在室温下避光培养。</li>
	<li>根据需要补充水分，直至根长达到至少2 cm。</li>
</ol>
SAP-AS 的组装与管理
注意：此步骤所需的材料列于材料表中。
<ol>
	<li>组装 SAP-AS（步骤 1 + 步骤 2 + 步骤 3 + 步骤 4）
	<ol>
		<li>将幼苗茎部置于培养皿侧边的凹槽中，根部朝内，子叶/叶片和茎部朝外。&#160;</li>
		<li>用约 1.5–2 g 蛭石覆盖根部。</li>
		<li>用 8 mL mMS-1 营养液润湿根室，以帮助稳定根系和蛭石。</li>
		<li>沿根室一侧的尼龙网滤膜加入 5 g 水合 SAP。</li>
		<li>向菌丝室加入 15 g 水合 SAP。菌丝室是指培养皿底部侧面无凹槽的区域。</li>
		<li>在用盖子封闭培养皿之前，确保盖子和培养皿底部的侧边凹槽对齐，以免损伤茎部。</li>
		<li>用石蜡条密封培养皿，将皿底和盖子连接起来，注意不要压碎幼嫩茎部。</li>
		<li>称重并记录培养皿的平均重量，以确定 SAP-AS 何时需要重新补水。</li>
		<li>叠放&#160;培养皿以优化空间利用。使用带有侧面开口的不透明盖子将培养皿保持在黑暗环境中，以便幼苗生长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>管理 SAP-AS。
	<ol>
		<li>仅使用 mMS-1 营养液对培养皿进行补水。</li>
		<li>以平均重量为参考标准。当培养皿重量减轻 5–6 g 时，添加 mMS-1 营养液使其恢复至原始重量。确保蛭石和 SAP 保持湿润但不过度积水。根部必须能够获得氧气。</li>
		<li>随着幼苗及其真菌伙伴的发育，需增加灌溉频率。无需同时对两个室进行灌溉。灌溉需求取决于幼苗发育状况，也受 SAP-AS 培养环境条件的影响。</li>
		<li>若植株健康叶片超过三片，可通过去除老叶来降低灌溉需求。及时清除枯死叶片。 
		注意：mMS-1 营养液中的阳离子（如 K+、Mg2+ 和 Ca2+）会随着时间推移降低 SAP 网络的膨胀程度13。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 用单个孢子接种 SAP-AS
注意：此步骤所需的材料列在材料表中。
<ol>
	<li>用单个孢子接种。
	<ol>
		<li>用火焰蜡烛或本生灯加热玻璃移液管。当玻璃熔化时拉伸玻璃管，直至其断开。</li>
		<li>在体视显微镜下，折断玻璃移液管的尖端，以减小其内径（通常为100–300 µm）。这将极大地方便对单个孢子的操作。</li>
		<li>打开培养皿，确定孢子放置的位置，并在尼龙滤膜上的5 g水合SAP中清理出一块空间，以暴露一段根部。</li>
		<li>在解剖显微镜下，用拉制好的移液管吸取一个孢子。在吸取孢子前，先吸取少量液体。收集孢子后避免再次吸取液体。</li>
		<li>在解剖显微镜下，小心地将孢子沉积在根部表面。此前吸入的液体有助于将孢子排出。如果孢子未沉积在理想位置，可用针灸针或毛刷轻触，使其重新与根部接触。如有必要，可拍摄孢子在根部上的位置照片作为参考，并用标记笔标注接种位点。</li>
		<li>将SAP重新覆盖在根段上，为根部和孢子提供湿润的微环境。接种后至少等待24小时再对根室进行灌溉，并注意避免将孢子从根部冲走。</li>
		<li>在盖上培养皿盖之前，确保盖子侧面的缺口与培养皿底部对齐，以免损伤幼苗茎部。 
		注意：当根部生长至尼龙滤膜处时，SAP-AS即已准备好用于接种，理想时间为灌溉后数天，此时系统中无游离液体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 在 SAP 上进行孢子萌发（可选）
注意：此步骤所需的材料列在材料表中。
<ol>
	<li>孢子萌发。
	<ol>
		<li>将水合后的SAP混合，以获得均匀的质地（参见步骤3.3.1）。气泡通常在24小时内消失，或通过高压灭菌（可选）混合后的SAP可加速气泡消除。</li>
		<li>使用20 mL无针头注射器，将约2 g（相当于2 mL）混合好的SAP加入12孔板的每个孔中。</li>
		<li>在解剖显微镜下选择一个孢子，并按照第6节所述使用挤出式移液器。</li>
		<li>在解剖显微镜下，将一个孢子置于每个孔的中央。</li>
		<li>将12孔板置于室温避光条件下培养，并定期观察萌发情况。</li>
		<li>在解剖显微镜下，挑选出具有生长菌丝（长度至少达数毫米）的孢子。</li>
		<li>向孔中加入1 mL mMS-1营养液，静置数分钟，使培养基变得更易流动。</li>
		<li>如有必要，可用针灸针轻轻将孢子和菌丝从基质中取出。</li>
		<li>可用移液器收集孢子，或通过将幼苗根部接触培养基表面，使孢子和菌丝粘附于根部。随后，按照步骤5.1.3所述将幼苗放入培养皿中。 
		注意：需协调好孢子萌发与幼苗生长的时间。该方法仅在R. irregularis孢子中进行过测试。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 共生关系发育的活体监测
注意：此步骤所需的材料列在材料表中。
<ol>
	<li>使用解剖显微镜、直立显微镜或倒置显微镜进行常规观察。
	<ol>
		<li>使用带有白色照明和暗场的解剖显微镜，在20x – 40x下观察每个隔室的顶部。</li>
		<li>若无倒置显微镜，可通过翻转培养皿，使用解剖显微镜或直立显微镜观察每个隔室的底部。在翻转培养皿前，需将SAP-AS干燥2天，使SAP轻微粘附于培养皿底部。</li>
		<li>通过培养皿底部在40x下进行详细观察，并通过盖玻片在最高100x（油浸）下观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察孢子和菌丝网络。 
	注意：SAP颗粒内部发育的真菌结构可进行染色。
	<ol>
		<li>根据Vierheilig等（1998）15的方法配制墨水-醋酸溶液。勿加热。</li>
		<li>取出含有菌丝和孢子的SAP颗粒，置于室温下的墨水中。墨水将在数分钟内渗入SAP颗粒，使内部的菌丝和孢子着色。</li>
		<li>取出SAP颗粒并将其放入mMS-1营养液或自来水中。墨水将在&#160;12小时内从颗粒中析出，但孢子和菌丝仍保持染色状态。</li>
		<li>将SAP颗粒置于两块显微镜载玻片之间压平，以便拍照和孢子计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察丛枝结构。
	<ol>
		<li>从根部隔室中取出少量根，按照Vierheilig等（1998）15的墨水-醋酸染色法进行染色。注意根在KOH溶液中浸泡时间不得超过2–3分钟，否则根组织将过于脆弱，难以进行后续操作，并可能碎裂成无法使用的碎片。</li>
		<li>在解剖显微镜下，选取一段约5 mm长、可能含有丛枝的根段，将其置于载玻片上的水滴中。</li>
		<li>使用针灸针或极细的镊子，逐层撕取厚度为数个细胞的根组织。</li>
		<li>吸去多余水分，于显微镜下检查含有丛枝的片段是否仍存在且质量良好，并正确放置于载玻片上。此时，丛枝应在根细胞层内清晰可见。</li>
		<li>静置干燥2–3分钟，使根组织层牢固粘附于载玻片。滴加一滴聚乙烯醇-乳酸甘油（PVLG）封片剂，加盖盖玻片，采用标准显微镜方法进行观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Culturing Arbuscular Mycorrhizal Fungi Using SAP-AS for Enhanced Observation

<ol><li>Dotzler, N., Krings, M., Taylor, T. N., Agerer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+shields+in+Scutellospora+%28Glomeromycota%3A+Diversisporales%2C+Gigasporaceae%29+from+the+400+million-year-old+Rhynie+chert%5BTitle%5D)+AND+%22Mycol+Prog%22%5BJournal%5D)">Germination shields in Scutellospora (Glomeromycota: Diversisporales, Gigasporaceae) from the 400 million-year-old Rhynie chert.</a> Mycol Prog. 5 (3), 178-184 (2006).</li>
<li>Redecker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomalean+fungi+from+the+ordovician%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glomalean fungi from the ordovician.</a> Science. 289 (5486), 1920-1921 (2000).</li>
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<li>Saha, A., Sekharan, S., Manna, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superabsorbent+hydrogel+%28SAH%29+as+a+soil+amendment+for+drought+management%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Tillage+Res%22%5BJournal%5D)">Superabsorbent hydrogel (SAH) as a soil amendment for drought management: A review.</a> Soil Tillage Res. 204, 104736(2020).</li>
<li>Bécard, G., Fortin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+events+of+vesicular-arbuscular+mycorrhiza+formation+on+Ri+T-DNA+transformed+roots%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA transformed roots.</a> New Phytol. 108 (2), 211-218 (1988).</li>
<li>Vierheilig, H., Coughlan, A. P., Wyss, U., Piché, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ink+and+vinegar%2C+a+simple+staining+technique+for+arbuscular-mycorrhizal+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi.</a> Appl Environ Microbiol. 64 (12), 5004-5007 (1998).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

接种是本实验方案中最关键的步骤，而拉制的玻璃巴斯德移液管被证明是精确操作丛枝菌根真菌单个孢子并保持其完整性的理想工具。使用蜡烛或本生灯的火焰可轻松塑形拉制的玻璃巴斯德移液管，并可在体视显微镜下调节其开口大小，以匹配待移取孢子的尺寸。操作孢子时必须使用与丛枝菌根真菌孢子大小相适应的工具（补充图1），并且应在宿主植物根系生长至足以接触到尼特克斯膜（Nitex膜）上所放置孢子的位置时，对SAP-AS进行接种。
SAP-AS 可轻松根据实验需求进行调整。可使用带有多个区域的较大培养皿，以监测亲缘关系较近的菌株之间或不同种丛枝菌根真菌（AMF）之间的相互作用，或改变化学环境（pH）或生物环境（引入&#160;线虫、细菌、真菌）。也可选用多种菌根依赖性宿主植物，为丛枝菌根真菌提供光合产物。营养液 mMS-1 源自 Bécard 和 Fortin（1988）15 描述的最小（M）培养基配方，但去除了蔗糖、维生素和细菌琼脂，以限制碳源。然而，可根据实验目的在 SAP-AS 中添加不同的营养液。
在SAP-AS体系中扩增丛枝菌根真菌需要定期浇水。蛭石和SAP的有限体积使根系和丛枝菌根真菌暴露于湿度波动之中，尤其是在标准的双室培养皿（直径10 cm）中。随着时间推移，SAP颗粒的膨胀能力及其透明度会逐渐降低。事实上，营养液中的阳离子会逐步限制丙烯酸盐网络的膨胀，因此需要在数月后更换SAP。此外，如果培养皿未适当避光或浇水过多，可能会随时间推移生长出绿藻和霉菌。
迄今为止，已有七种丛枝菌根真菌（AM真菌）在SAP-AS体系中成功培养，这一数量远低于可在盆栽培养中繁殖的AM真菌种类。然而，SAP-AS体系中的生物和非生物条件与盆栽培养非常相似，因此其他AM真菌种类很可能也能在SAP-AS中繁殖。若使用非无菌的孢子或种子进行接种，将孢子直接接种至SAP-AS中可能更接近自然土壤根际环境，因为体系中存在根系分泌物和/或细菌。这种方法应优于使用已萌发孢子进行接种。此外，目前对AM真菌孢子萌发所依赖的条件仍了解甚少，因此用mMS-1营养液水合的SAP可能并不适合其他AM真菌种类的孢子萌发。此前在用mMS-1营养液水合的SAP上进行孢子萌发试验，目的是专门筛选具有活力的孢子，并仅使用R. irregularis接种物进行接种步骤。
在 SAP-AS 系统中，丛枝菌根（AM）共生体系的接种及发育过程监测操作简便。经改良的双室培养皿可支持不同种类 AM 真菌的培养。Paré 等人12已成功扩繁了来自六个属、三个科的七种不同 AM 真菌。双室培养皿的改造可使用廉价工具轻松完成。制备和维持 SAP-AS 所需材料（蛭石、SAP、巴斯德移液管等）和试剂（mMS-1）的成本低、用量少，因而可在最低成本下管理大量 SAP-AS 系统。SAP-AS 可堆叠的特性也显著减小了 AM 真菌培养所需的空间，相较于盆栽培养具有明显优势。例如，50 套 SAP-AS（每 10 套堆叠为一组，共 5 组）可放置于长度仅为 1 米的架子上（补充&#160;图 2）。这些特点使 SAP-AS 成为一种简单且经济的技术，适用于在高中实验课程或大学本科阶段开展 AM 共生教学。已定殖的 SAP 颗粒可用于接种新的 SAP-AS 系统或盆栽培养。
在培养皿底部背面放置盖玻片，可实现对菌根真菌胞外菌丝结构的高分辨率拍照和录像。在接近自然条件的活体状态下，可方便地研究细胞质流动。这对于研究丛枝菌根真菌菌丝体相关功能（如养分、水分运输、土壤结构等）以及菌丝形态发生具有重要意义。
丛枝菌根真菌（AMF）在植物根部及根际环境中完成其生物生命周期。由于土壤环境本身难以直接观察，土壤微生物的研究十分复杂。SAP-AS 的主要目标是重建一个尽可能接近根际的环境，以促进丛枝菌根真菌（AM真菌）的繁殖，同时保持对其发育过程进行精细观察的能力。由于该系统涉及非无菌条件，应限制可利用碳的含量，以防止腐生微生物的过度增殖。目前对AM真菌在根际中行为的了解仍极为有限，而SAP-AS系统提供了在不同物种之间进行详细比较的可能性，包括它们在根外环境中觅食的能力、孢子产生能力以及根系定殖能力。此外，通过引入与其他土壤生物（如细菌、线虫、原生生物以及根部致病真菌）的相互作用，可进一步拓展该系统的应用，从而借助SAP-AS系统增进对土壤微生物群落相互作用的认识。

丛枝菌根真菌（AM真菌，Glomeromycotina）是一类古老的植物根部共生体（约5亿年前出现1,2），可能在维管植物定殖陆地土壤的过程中发挥了关键作用。AM真菌与维管植物之间长期的共同进化，使丛枝菌根成为跨界互利共生的典范。AM真菌的菌丝显著增强了宿主植物从土壤中获取养分的能力3，并通过菌根网络将养分传递给新的宿主植物4。菌丝网络可改善土壤结构，而球囊霉素的产生可能有助于减少土壤侵蚀5。将部分大气碳转移至真菌根部共生体，有助于提高土壤碳封存能力6。总体而言，AM真菌能够增强植物对非生物和生物胁迫的抗性，因此在农业生态学领域受到广泛关注7。事实上，有利于AM真菌的农业管理措施有望减少作物生产中对化学投入品的依赖，并提高土壤有机碳含量。这些正是农民在实施管理措施时需要纳入考虑的重要目标，以符合国家和国际关于向可持续农业转型及应对气候变化的承诺。
然而，丛枝菌根真菌（AM真菌）是土壤中的微型真菌，由于其专性活体营养特性以及根际分布特征，对其进行研究十分困难。土壤是研究难度最大的生物栖息地之一，因其不透明性、生态位的高度多样性以及各级尺度上的多营养级相互作用。因此，AM真菌的分离、扩繁与鉴定均存在较大挑战。直至20世纪中期th 世纪，仅形成孢子果的丛枝菌根真菌物种被鉴定8然而，大多数丛枝菌根真菌（AM真菌）物种产生非子实体孢子，其直径范围约为20 μm至500 μm。土壤湿筛法的描述9 为描述这些丛枝菌根真菌物种开辟了道路，此后物种描述的速度逐渐加快。然而，与担子菌门和子囊菌门（Dikarya）相比，丛枝菌根真菌所代表的物种数量仍较少。
诱捕培养，即用含有丛枝菌根（AM）真菌孢子的孢子悬液或环境土壤样品接种装有经高压灭菌基质（如陶粒&#160;和蛭石）及无菌宿主种子（如韭菜、车前草）的培养盆，是可在受控条件下扩繁AM真菌的一种方法10。然而，接种是否成功只能通过染色后镜检根段中是否存在菌根结构（如丛枝），或对部分样品或整盆基质进行湿筛法分离孢子来评估。通常建议在分析培养物前至少6–12周内不要扰动培养系统。该培养技术适用于大多数已知AM真菌物种的扩繁，但无法实现对真菌共生体的活体观察，且接种成功率具有不确定性，尤其是在尝试单孢子培养时更为明显。
相反， 体外 由于培养基的透明性，AM真菌的传播过程可进行实时活体监测11但该培养技术需要有转化根的存在，并且培养基中需含有碳源，才能在无菌环境中发挥作用。孢子必须经过灭菌处理，且由于与异养宿主共生的特性，大多数已知的丛枝菌根真菌种类无法通过该技术成功扩繁。
因此，尽管目前丛枝菌根真菌（AM真菌）的扩繁技术已在大多数实验室中建立并广泛应用，但在AM真菌研究方面仍存在一些局限性。Paré 等人（2022）12 开发了一种利用透明高吸水性聚合物（SAP）结合完整植株的 体内 扩繁技术。该技术被称为基于SAP的自养体系（SAP-AS），操作简便且成本低廉，兼具盆栽培养（与自养型宿主共生、非无菌条件）和 体外 培养（透明培养基、可实时监测共生发育过程）的优点。本文介绍了一种使用单孢子接种建立培养体系并利用SAP-AS对胞外菌丝进行高倍显微观察的实验方案。具体包括：双室培养皿的改造、营养液的配制、高吸水性聚合物（SAP）的准备、幼苗的准备、SAP-AS的组装与单孢子接种、孢子的预萌发处理，以及共生发育过程的活体监测方法。

<table><tbody><tr><td>100 x 15 mm 可叠放双层培养皿</td><td>Kord Valmark</td><td>1204U09</td><td>https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate</td></tr><tr><td>12 孔板&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>665180</td><td>https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html</td></tr><tr><td>18 mm 圆形玻璃盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-cover-glasses-circles-11/12545100#?keyword=12-545-100</td></tr><tr><td>20 mL 聚丙烯/聚乙烯注射器（无针头）</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z683620-100EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/aldrich/z683620?utm_source=google&amp;amp;utm_medium=&lt;br/&gt; cpc&amp;amp;utm_campaign=20674735406&lt;br/&gt; &amp;amp;utm_content=157607444391&amp;amp;gc&lt;br/&gt; lid=Cj0KCQiA5rGuBhCnARIsAN11&lt;br/&gt; vgQOT_WPRg9WFyBEyoO4b0x1&lt;br/&gt; -F7Tks4houU7VTRS5EiYM9l0F-B&lt;br/&gt; oL7saAmFoEALw_wcB</td></tr><tr><td>针灸针&amp;nbsp;</td><td>Lierre</td><td>A143-LP1-3075</td><td>https://www.lierre.ca/products/lierre-plus-acupuncture-needles-100pcs?gad&lt;br/&gt; _source=1&amp;amp;gclid=Cj0KCQiA5rGuBh&lt;br/&gt; CnARIsAN11vgTwupmw51UTdR&lt;br/&gt; k9cKr4ewi12W3dyVikenzH3sjdUB4&lt;br/&gt; g41G-_KnvppoaAkbTEALw_wcB&amp;amp;&lt;br/&gt; utm_campaign=PMax-needles&amp;amp;utm_content=shopify_CA_&lt;br/&gt; 5213169090694_35001500991622&lt;br/&gt; &amp;amp;utm_medium=cpc&amp;amp;utm_source=&lt;br/&gt; google&amp;amp;variant=35001500991622</td></tr><tr><td>吸水纸</td><td>FLINN&amp;nbsp;</td><td>FB0678</td><td>https://www.flinnsci.ca/blotting-paper-12-x-19-pkg.-of-10/fb0678/</td></tr><tr><td>商用或科研用搅拌器或手持式厨房搅拌器</td><td>kitchenaid</td><td>KHBV53DG</td><td>https://www.kitchenaid.ca/en_ca/countertop-appliances/hand-blenders/hand-blender-products/p.variable-speed-corded-hand-blender.khbv53dg.html&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dremel 199 雕刻钻头</td><td>Dremel</td><td>2615000199</td><td>https://www.dremel.com/ca/en/p/199-2615000199</td></tr><tr><td>干燥 SAP 培养基粒径 1&amp;ndash;2 mm</td><td>HORTA-SORB MD</td><td>00810085242789</td><td>https://www.horticulturalalliance.com/product/horta-sorb-md-granule/</td></tr><tr><td>不锈钢解剖刀片（适用于解剖刀柄）&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-916-5B</td><td>https://www.fishersci.ca/shop/products/graham-field-stainless-steel-blades-dissecting-knife-handles-8/089165b</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管 230 mm</td><td>Kimble</td><td>RK-25554-14</td><td>https://www.coleparmer.ca/i/dwk-life-sciences-kimble-disposable-pasteur-pipettes-plugged-end-borosilicate-glass-230-mm-1000-cs/2555414</td></tr><tr><td>墨水</td><td>Sheaffer</td><td>94321</td><td>https://www.amazon.com/Sheaffer-Skrip-Bottled-Black-94231/dp/B002IKKKUU</td></tr><tr><td>熔融导板：改良型油漆刮刀，2 英寸</td><td>Mastercraft</td><td>#049-7335-8</td><td>https://www.canadiantire.ca/en/pdp/mastercraft-carbon-steel-flexible-spackling-putty-knife-wall-paint-scraper-2-in-0497335p.0497335.html?loc=plp</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/125525</td></tr><tr><td>Nitex 尼龙网筛滤膜&amp;nbsp;</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX30-108</td><td>https://dynamicaquasupply.com/products/nitex-screen?_pos=1&amp;amp;_sid=ffc105328&amp;amp;_ss=r&amp;amp;&lt;br/&gt; variant=6945749106731</td></tr><tr><td>回形针</td><td>Makanu</td><td>&amp;lrm;Clips-BK-41mm-24</td><td>https://www.amazon.ca/classeur-standard-grandes-trombones-excellentes</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Avantor/vwr</td><td>470201-930</td><td>https://www.avantorsciences.com/ca/en/product/8882964/parafilm</td></tr><tr><td>Plantago lanceolata 种子</td><td>ecoumene</td><td>NA</td><td>https://www.ecoumene.com/produit/semences/herbacees/plantain-lanceole-bio/</td></tr><tr><td>聚乙烯醇-乳酸-甘油（PVLG）</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://invam.ku.edu/recipes</td></tr><tr><td>带细尖头的电烙笔工具包</td><td>Walnut Hollow</td><td>483103</td><td>https://www.walnuthollow.com/collections/creative-wood-burning/products/walnut-hollow-creative-versa-tool</td></tr><tr><td>硅酮密封胶</td><td>Aqueon</td><td>100165003</td><td>https://www.aqueon.com/products/aquariums/silicone-sealant</td></tr><tr><td>外科手术刀柄</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079657</td><td>https://www.fishersci.ca/shop/products/surgical-design-scalpel-handles-blades/22079657#?keyword=scalpel</td></tr><tr><td>双速旋转工具套装</td><td>Dremel</td><td>200-1/21</td><td>https://www.dremel.com/ca/en/p/200-1-21-f0130200ah</td></tr><tr><td>蛭石</td><td>PRO-MIX</td><td>4981110</td><td>https://www.canadiantire.ca/fr/pdp/vermiculite-pro-mix-9-l-0597936p.0597936.html</td></tr><tr><td>X1000 圆形盖玻片 直径 30 mm #1（0.13&amp;ndash;0.16 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>12164692</td><td>https://www.fishersci.fi/shop/products/x1000-cover-slip-diam-30-mm-n-1-1/12164692</td></tr></tbody></table>

在基于超吸水聚合物的自养系统上接种并观察丛枝菌根培养物

Inoculating and Observing Arbuscular Mycorrhizal Cultures on Superabsorbent Polymer-Based Autotrophic Systems

丛枝菌根（AM）真菌由于始终与植物根系共生并在根际环境中繁殖，因而难以进行操作和观察。通常，AM真菌在以下条件下培养 体内 自养寄主条件下或在盆栽培养中的情况 体外 在培养皿中利用根癌农杆菌转化根（异养寄主）进行Ri质粒转移DNA培养的条件。此外，菌根真菌在花盆培养中的生长发生在不透明且非无菌的环境中。相比之下， 体外 培养涉及在无菌且透明的环境中扩增丛枝菌根真菌。基于超吸水性聚合物的自养体系（SAP-AS）最近已被开发出来，该体系结合了现有方法的优点，同时避免了各自的局限性（如不透明性、异养宿主、无菌性问题）。本文提供了一套详细的SAP-AS体系中丛枝菌根真菌的简易制备、单孢子接种及观察的操作流程。通过对培养皿进行改造，实现了对活体样本的高分辨率摄影和视频观察，而这一点在现有常规方法中难以实现或根本无法完成。 体内 和 体外 技术。

SAP-AS 是一种简单且低成本的技术，用于培养丛枝菌根真菌并观察菌丝体内和菌丝体外真菌结构的发育。本文提供了详细的实验方案，以帮助使用者建立 SAP-AS 系统，并介绍了相对于 SAP-AS 原始描述的两项改进。
首先，根室沿 Nitex 膜存在 SAP，有助于通过单个孢子接种系统（图 1）。
<img alt="显示植物根部结构的显微镜图像，箭头指示根瘤；植物解剖示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66848/66484fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：SAP-AS的单孢子接种。（A）接种一个Rhizophagus irregularis孢子。（B）接种一个Funneliformis mosseae孢子。白色箭头指示接种位置。比例尺：500 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66848/66484fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
很容易识别出具有少量根系的区域，以便接种孢子。孢子的确切位置可以在培养皿盖表面标记，并定期检查其萌发情况以及对根系的定殖。SAP水化颗粒的存在提供了利于孢子萌发的湿润环境。在Nitex膜附近的根部进行接种，可促进共生体的快速形成，使菌丝体迅速进入胞外菌丝区并获取养分（图2）。通过观察接种点处的单个孢子是否成功萌发，还可识别并剔除未成功的培养物，以便及时更换。
其次，培养皿底部的盖玻片可实现对菌根真菌共生体的高分辨率活体成像（图2B、C），特别是对菌丝外菌丝体内的细胞质流动进行观察（图2D）。
<img alt="显示真菌孢子生长和结构的显微镜实验；放大倍数分别为10 μm、100 μm、500 μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66848/66484fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：接种后的SAP-AS。（A）接种了单个Rhizophagus irregularis（DAOM 197198）孢子的SAP-AS。寄主植物为Plantago lanceolata。（B）在体视显微镜下透过盖玻片观察到的菌丝室中孢子簇。比例尺：500 µm。（C）在10倍放大倍数的光学显微镜下透过盖玻片观察到的高分辨率孢子簇图像。比例尺：100 µm。（D）在100倍放大倍数的光学显微镜下透过盖玻片观察到的高分辨率菌丝图像。比例尺：10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66848/66484fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
用户可在用 mMS-1 营养液水合的 SAP 上尝试萌发丛枝菌根（AM）真菌孢子，以确保 SAP-AS 仅接种有活力的孢子（图3）。然而，该方法仅在 R. irregularis 的商业孢子中进行过测试，在 mMS-1 营养液水合的 SAP 上其他 AM 真菌物种的孢子萌发成功率可能存在显著差异。
<img alt="显微镜下细胞培养板中神经细胞生长的放大图像，科学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66848/66484fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：R. irregularis 孢子在12孔板中的萌发。 比例尺：500 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66848/66484fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
最后，由于 SAP-AS 是一种在活体（in vivo）条件下非无菌培养 AMF 的技术，因此可在实验台面上直接操作并打开培养皿，以取样已定殖的根系、游离孢子或定殖于 SAP 颗粒上的材料（图4）。菌根内部和外部的真菌结构可采用类似于在盆栽或根器官培养中繁殖的 AMF 的染色方法进行染色（图4C）。
<img alt="菌根真菌相互作用、显微镜图像、细胞结构、200 μm 比例尺、生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66848/66484fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：从 SAP-AS 中提取的胞外和胞内丛枝菌根真菌结构。（A）在根区观察到的R. irregularis游离孢子。比例尺：200 µm。（B）SAP 中染色的R. irregularis孢子。比例尺：500 µm。（C）染色的根片段，显示胞内菌丝和丛枝结构。比例尺：50 µm、100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66848/66484fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：可用于操作丛枝菌根真菌孢子的各种工具厚度比较。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66848/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：堆叠式SAP-AS。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66848/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种在基于超吸收性聚合物的自养体系中接种并观察丛枝菌根真菌的简单且低成本的技术。

丛枝菌根（AM）真菌由于始终与植物根系共生且在...中繁殖，因而难以进行操作和观察。

丛枝菌根真菌是一类古老且重要的植物共生真菌，可增强寄主植物的养分吸收能力，并在细胞健康中发挥关键作用。尽管菌根真菌细胞微生物难以研究，本实验方案可实现对其实时监测、数字化观察以及高效建立单孢子培养体系。目前，丛枝菌根真菌（AM真菌）通常通过盆栽培养在温室条件下扩繁，或利用RITDNE转化途径进行体外培养。近十年来，这两项技术极大地推动了人们对丛枝菌根真菌的认识，但它们各自存在特定的局限性。对真菌共生成功定殖的评估依赖于在根部观察到丛枝结构或在土壤中发现孢子。体外培养技术虽可实现对叶片的监测，但需要使用转化根系并维持无菌条件，这限制了该技术在许多丛枝菌根真菌物种中的应用。用于研究丛枝菌根真菌（AMF）的盆栽培养或体外培养技术在活体观察和成功扩繁方面存在局限性。为克服这些局限，我们开发了这种基于高吸水性聚合物的自养系统（SAP AS），该技术简单且成本低廉，结合了体外培养与盆栽培养的优点。本实验室将重点优化新的AM真菌物种在单孢培养体系中的建立，并研究其与超细胞微生物的相互作用。该技术将使我们能够研究不同丛枝菌根真菌物种之间的竞争动态、高断层传播机制以及养分吸收过程。首先，使用旋转工具和合适的雕刻钻头，在盖子顶部钻两个灌溉孔。在侧面，钻一个一厘米的开口。使用电动旋转工具在培养皿底部侧面钻一个用于植物茎的凹槽。接下来，使用配备合适钻头的电动旋转工具，在培养皿底部钻一个30毫米的矩形凹槽，直至底部。为了进行高分辨率观察，在培养皿底部钻直径约25毫米的圆形孔。确保钻孔位置不直接位于盖子的灌溉孔下方。使用金属导向片和回形针，将尼龙滤膜的一片楔入指定位置，并将其牢固地压在根部或凹槽侧的塑料屏障上。然后将滤膜的顶部与屏障的顶部对齐。使用热烙工具套装，沿着金属导板的边缘进行切割，以熔化并密封尼龙网滤膜，使其与培养皿底部及塑料屏障紧密结合，从而分隔两个区域。在保持金属导板和回形针位置不变的情况下，使用镊子小心地去除多余的尼龙网滤膜。在解剖显微镜下检查，确认尼龙网滤膜已与塑料完全密封，以防止根系穿透进入菌丝区域。然后将硅酮密封剂涂抹在培养皿底部外侧的圆形孔边缘。将盖玻片置于培养皿底部外侧，并轻轻按压以确保完全粘附。首先，称取五克干燥的高吸水性聚合物（SAP），并将其与500毫升MMS1营养液混合。在组装前约一周，将车前草（Plantago lanceolata）种子置于培养皿中的吸水纸上，用MMS一种营养液润湿，使其萌发。然后将培养皿置于室温下避光培养。开始组装SAP AS系统时，将幼苗的茎放入培养皿侧边的切口处，使根朝内，子叶或叶片及茎朝外。用约1.5至2克蛭石覆盖根部。随后，用8毫升MMS一种营养液润湿根部区域。沿根部区域一侧的尼龙网滤膜清理出一块不含蛭石的空间，并加入5克水合SAP。然后向菌丝室中加入15克水合高吸水性树脂（SAP）。将培养皿盖的侧面凹槽与培养皿底部对齐，以避免损伤菌丝茎，然后盖上盖子。接着用一条封口膜将培养皿底部和盖子密封起来。称量培养皿并记录其平均重量，以确定 SAP AS 是否需要重新水化。然后将培养皿叠放以优化空间利用。使用带有侧面开口的不透光盖子，使幼苗保持在黑暗环境中。使用火焰蜡烛或本生灯加热玻璃移液管，待其熔化时拉伸玻璃管以将其分离。在体视显微镜下，折断玻璃移液管的尖端以减小其内径。现在打开培养皿，确定孢子将要放置的位置。在尼龙网滤膜上沿根部暴露一个区域，清除该处五克水合树液。在解剖显微镜下，用移液枪吸取少量液体后，吸取悬浮液中的一个孢子，随后小心地将该孢子接种到根部表面。然后将汁液重新覆盖在根段上，以维持根部和孢子的湿润微环境。24小时后，如有需要，可对根部区域进行灌溉，注意不要冲走孢子。将盖子侧面的凹口与培养皿底部对齐，以避免损伤幼苗茎秆。用培养皿盖盖好培养皿。

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