Name: 实现骨组织空间转录组学的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学习骨组织空间转录组学方法，通过脱钙处理保存高质量RNA，用于骨肉瘤及肺转移研究。该技术可识别关键基因并发现潜在治疗靶点，为骨癌研究提供重要工具。

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本工作得到了匹兹堡治愈肉瘤基金会（PCS）和骨肉瘤研究所（OSI）的资金支持。

以下所述的所有动物实验程序均经匹兹堡大学牙医学院《实验动物护理与使用指南》合规批准。
1. 需要脱钙的骨组织样本福尔马林固定石蜡包埋块的制备方法
<ol>
	<li>试剂和材料的准备
	<ol>
		<li>配制 20% pH 8.0 的 EDTA 溶液。配制 1 L 溶液时，将 200 g EDTA 溶解于 800 mL 超纯水中，用 10 N 氢氧化钠调节 pH 至 8.0&#160;，最后用超纯水定容至 1 L。室温保存。 
		注意：始终使用新鲜配制的 20% pH 8.0 EDTA 溶液。10 N 氢氧化钠（NaOH）通过将 400 g NaOH 溶解于 1 L 超纯水中配制而成。</li>
		<li>在通风橱中使用不含钙和镁的 1× PBS 配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液。 
		注意：在通风橱内指定一个区域专门用于处理高浓度多聚甲醛溶液或多聚甲醛固体，并明确标识。为避免暴露，应尽可能保持容器密闭。仅使用实验所需的最小实用量。若需称量多聚甲醛粉末而天平无法置于通风橱内，应先取一容器，在通风橱内加入 PFA 粉末并盖好，再返回天平进行称量。始终使用新鲜配制的 4% PFA 溶液。</li>
		<li>为每个样本使用合适的容器。 
		注意：例如，对于 1 mg 骨组织，应使用能容纳至少 1 mL 溶液与骨组织充分接触的容器。</li>
		<li>对所有用于解剖的外科器械进行灭菌。</li>
		<li>使用去污溶液清洁所有操作区域，以去除 RNase。</li>
		<li>收集其余实验材料，包括冰盒、70% 乙醇喷雾，并确保可使用旋转摇床。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从小鼠中分离骨组织样本
	<ol>
		<li>通过 CO2 暴露处死小鼠，随后进行颈椎脱位，将其仰卧放置。用 70% 乙醇喷洒小鼠皮肤。</li>
		<li>使用无菌解剖剪剪开皮肤，暴露腿部肌肉。沿腿部剪开肌肉以清晰观察骨骼位置，并轻柔地脱位取出骨骼，避免损伤。 
		注意：无需完全去除附着在骨骼上的所有肌肉。操作应尽可能迅速，以减少 RNA 降解。</li>
		<li>立即将骨组织样本放入含有 4% PFA 的离心管中，并将离心管置于冰上。</li>
		<li>根据需要重复上述步骤以收集其他骨组织样本。</li>
		<li>将含 4% PFA 的样本置于旋转摇床上，于 140 rpm&#160;、4 °C&#160;条件下振荡至少 24 小时，以实现充分固定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨组织样本的脱钙
	<ol>
		<li>固定完成后，从旋转摇床上取出骨组织。</li>
		<li>在旋转摇床上以 140 rpm 振荡，用 1× PBS 洗涤骨组织两次，每次 3 分钟，以去除残留的 PFA。</li>
		<li>使用无菌解剖剪去除仍附着在骨骼上的任何残留肌肉。</li>
		<li>再用 1× PBS 洗涤骨组织一次，每次 3 分钟。</li>
		<li>将骨组织放入新容器中，加入 20% EDTA pH 8.0 溶液，然后将容器置于旋转摇床上，于室温（RT）下以 140 rpm 振荡 30 分钟。</li>
		<li>弃去溶液，向容器中加入新鲜的 20% EDTA pH 8.0 溶液，继续在旋转摇床上以 140 rpm 振荡 30 分钟，室温进行。</li>
		<li>重复步骤 1.3.6 共 10 次。</li>
		<li>弃去溶液，加入新鲜的 20% EDTA pH 8.0 溶液，将容器置于 4 °C 冷室中的旋转摇床上，以 140 rpm 振荡过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨组织样本的脱水
	<ol>
		<li>从容器中取出骨组织样本。</li>
		<li>检查组织，通过轻柔扭转和弯曲骨骼来评估脱钙效果。或者，可使用 X 光机对骨骼进行 X 光成像。 
		注意：若样本易于弯曲，则表明已达到良好的脱钙程度；否则应增加脱钙参数（如时间、振荡速度、所用 20% EDTA pH 8.0 溶液体积等）。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤骨组织两次，每次 3 分钟，以去除 EDTA 残留。</li>
		<li>将骨组织放入新容器中，开始用 70% 乙醇进行脱水处理，于 140 rpm 振荡孵育 15 分钟。</li>
		<li>弃去 70% 乙醇溶液，将样本转移至 90% 乙醇溶液中，于 140 rpm 振荡孵育 15 分钟。</li>
		<li>弃去 90% 乙醇溶液，将样本转移至 100% 乙醇中，于 140 rpm 振荡孵育 15 分钟。</li>
		<li>弃去 100% 乙醇，将样本转移至新的 100% 乙醇中，于 140 rpm 振荡孵育 15 分钟。</li>
		<li>弃去 100% 乙醇，将样本转移至新的 100% 乙醇中，于 140 rpm 振荡孵育 15 分钟。</li>
		<li>弃去 100% 乙醇，将样本转移至新的 100% 乙醇中，于 140 rpm 振荡孵育 30 分钟。</li>
		<li>弃去 100% 乙醇，将样本转移至新的 100% 乙醇中，于 140 rpm 振荡孵育 45 分钟。 
		&#8203;注意：脱水也可使用自动组织处理仪完成。此时应设置程序，采用与手动脱水相同的条件。上述条件适用于厚度不超过 4 mm 的样本（即从小鼠获得的骨组织样本）。对于厚度超过 4 mm 的样本，脱水时间需通过实验确定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨组织样本的透明化
	<ol>
		<li>将骨组织样本放入新容器中，开始使用二甲苯进行透明化处理，于 140 rpm 振荡孵育 20 分钟。</li>
		<li>弃去使用过的二甲苯，加入新二甲苯，继续于 140 rpm 振荡孵育 20 分钟。</li>
		<li>弃去使用过的二甲苯，加入新二甲苯，于 140 rpm 振荡孵育 45 分钟。 
		&#8203;注意：透明化也可使用自动组织处理仪完成。此时应设置程序，采用与手动透明化相同的条件。上述条件适用于厚度不超过 4 mm 的样本。对于厚度超过 4 mm 的样本，处理时间需通过实验确定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>骨组织样本的浸蜡与包埋
	<ol>
		<li>透明化完成后，从旋转摇床或自动处理仪中取出骨组织样本。</li>
		<li>将骨组织样本放入包埋盒中，开始用石蜡（见材料表）进行浸润，于 60 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>弃去使用过的石蜡，加入新石蜡，于 60 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>弃去使用过的石蜡，加入新石蜡，于 60 °C 孵育 45 分钟。</li>
		<li>小心地将骨组织样本按所需方向放入模具中。</li>
		<li>将组织块在冷表面上冷却固化。</li>
		<li>将获得的 FFPE 组织块于 4 °C 保存，直至准备切片。 
		注意：FFPE 组织块可在切片前长期保存多年。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 未脱钙FFPE样本切片的指南
注意：以下指南提供了有价值的建议和操作说明，有助于显著提高组织切片的质量，同时避免RNA降解，特别是在处理小型未脱钙骨样本时尤为重要。当有脱钙骨样本时，这些指南也可适用。对于较大的骨组织样本，应进行脱矿处理以获得更高质量的切片；在此类情况下，应遵循上述已报道的方法，并相应调整各项参数（如时间、溶液用量等）。无论是在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）骨组织已经完成处理的情况下（例如从组织库或其他实验室获取的FFPE组织块），还是在所获得的切片将用于需要高质量RNA、高质量组织切片或两者兼需的各类分析时，本指南均适用。
<ol>
	<li>设备准备
	<ol>
		<li>使用去RNase的去污溶液喷洒所有工作表面和仪器，以去除RNases。</li>
		<li>准备一个装有双蒸水的水浴锅，并将温度设定为42 °C。</li>
		<li>取一把切片刀，先用70%乙醇喷洒以去除油渍，再用去污溶液喷洒以去除RNases。</li>
		<li>将刀片固定在切片机上，确保 Clearance 角度设置为10°。 
		注意：切片时务必使用新刀片。</li>
		<li>准备两个装有冰块的容器。</li>
		<li>取出镊子、毛刷和探针，用去污溶液喷洒以去除RNases，然后放入两个冰桶中的一个。</li>
		<li>在另一个冰桶中加入双蒸水，制备冰水浴。 
		注意：FFPE组织块不应在加入的水中漂浮；因此，加入冰桶中的水量应恰好足以润湿样本而不使其漂浮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切片
	<ol>
		<li>从4 °C保存环境中取出FFPE组织块，放置于切片机上。将设定调至修片模式或设定卷片厚度为14 µm，开始修片，直至组织暴露。 
		注意：若FFPE组织块已修整完毕且组织已暴露，则跳过步骤2.2.1。确认组织块无孔洞或裂纹；若无，则直接进入步骤2.2.2；若有，则切去若干切片以平整表面并避开孔洞和裂纹，然后进入步骤2.2.2。</li>
		<li>将FFPE组织块置于冰水浴中以水合样本。水合时间需通过实验确定。
		<ol>
			<li>初始水合时间为2分钟，若水合不足可适当延长，但不得超过10分钟。水合可使组织膨胀，减少“百叶窗”效应（&#34;Venetian blinds&#34;）和条纹的形成。过长的水合时间可能导致石蜡块开裂，甚至组织脱落。</li>
			<li>若10分钟仍不足以充分水合样本，可进行多次水合，每次不超过10分钟，并再次尝试切片。</li>
			<li>若组织块表面因裂纹或切痕而不平整或不洁净，建议重新包埋样本。重新包埋过程不会影响RNA质量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将样本装入切片机的样本夹中，与刀片对齐，开始切片。设定卷片厚度为5 µm。</li>
		<li>使用预冷的镊子和毛刷收集切片，并将其放入42 °C的水浴锅中。 
		注意：若后续将进行组织切片的RNA提取，可将切片收集至离心管中，并按照试剂盒说明书进行RNA制备（参见材料表）。</li>
		<li>将切片在水浴锅中孵育，以拉伸组织并消除残留的皱褶和折叠。 
		注意：每张切片在水浴中漂浮的时间需通过实验确定。若出现组织脱落问题，可考虑将骨组织切片额外多漂浮1分钟。切勿漂浮过久，因长时间漂浮可能损伤组织。</li>
		<li>将切片转移至载玻片上，随后在42 °C孵育3小时。</li>
		<li>将载玻片置于干燥器或室温下过夜干燥。</li>
		<li>将附有切片的载玻片在室温下存放于切片盒中。 
		注意：载玻片可在室温下长期保存多年。若将进行空间转录组分析，则应将切片置于制造商提供的空间基因表达专用载玻片上，并遵循其推荐操作流程（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Protocol to Prepare Demineralized FFPE Bone Tissue Samples with RNA Integrity 

<ol><li>Baig, M. A., Bacha, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaig%2C+MA+%22Histology.+Bone%22">Histology. Bone</a>. , StatPearls Publishing. (2024).</li>
<li>Currey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+consequences+of+variation+in+the+mineral+content+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone.</a> J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).</li>
<li>Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undecalcified+bone+preparation+for+histology%2C+histomorphometry+and+fluorochrome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis.</a> J Vis Exp. (35), e1707(2010).</li>
<li>Wallington, E. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWallington%2C+EA+%22Histological+Methods+for+Bone%22">Histological Methods for Bone</a>. , Butterworths. London. (1972).</li>
<li>Callis, G. M., Sterchi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decalcification+of+bone%3A+Literature+review+and+practical+study+of+various+decalcifying+agents.+methods%2C+and+their+effects+on+bone+histology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology.</a> J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).</li>
<li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utilization+of+formalin+fixed-paraffin-embedded+specimens+in+high+throughput+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Genomics%22%5BJournal%5D)">The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies.</a> Int J Genomics. 2017, 1926304(2017).</li>
<li>Trinks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+clinically+relevant+features+in+single-cell+RNA+profiles+of+patient-matched+fresh+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+lung+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Oncol+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue.</a> Cell Oncol (Dordr). , (2024).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+single+nucleus+total+RNA+sequencing+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues+by+snRandom-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq.</a> Nat Commun. 14 (1), 2734(2023).</li>
<li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visium+Spatial+Gene+Expression+Reagent+Kits+for+FFPE+-+User+Guide.%2C+Document+Number+C+CG000407+Rev+C%5BTitle%5D)+AND+%2210x+Genomics%22%5BJournal%5D)">Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE - User Guide., Document Number C CG000407 Rev C.</a> 10x Genomics. , (2021).</li>
<li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+Space+Ranger+Web+Summary+Files+for+Visium+Spatial+Gene+Expression+for+FFPE+F+FFPEAssay.%2C+Document+Number+CG000499+Rev+A%5BTitle%5D)+AND+%2210x+Genomics%22%5BJournal%5D)">Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A.</a> 10x Genomics. , (2022).</li>
<li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visium+Spatial+Gene+Expression+for+FFPE-Tissue+Preparation+Guide.%2C+Document+Number+C+G+CG000408+Rev+D%5BTitle%5D)+AND+%2210x+Genomics%22%5BJournal%5D)">Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D.</a> 10x Genomics. , (2022).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

此处提供了一种详细的方法，用于制备脱钙骨组织的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片，并在测序（即下一代测序，NGS）或其他RNA相关技术中保持RNA完整性（即 原位 杂交、定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）等。
该方法利用EDTA对骨组织样本进行脱钙；EDTA孵育可实现缓慢而精细的脱矿，从而最大程度地保存组织的组织学特征。通常，骨组织脱钙采用10% EDTA（pH 7.0）处理至少2周，并每隔一天更换一次溶液4。然而，长时间的脱钙过程会显著导致RNA降解6,7,8。为解决这一问题，将EDTA浓度提高至20%，pH升至8.0，并将溶液更换频率增加至每30分钟一次。结合组织暴露于大量溶液、剧烈振荡以及高容器/组织体积比等条件，这些改进可最大化脱钙效率并缩短处理时间，实现温和而快速的脱矿。值得注意的是，当骨组织样本将用于转录组测序时，可能无需完全脱钙。在此情况下，需在充分脱矿与良好RNA保存之间找到最佳平衡。另一个需要强调的是，无论样本如何处理，只要经过固定，其RNA均会发生片段化。本文所述方法可保留长度超过200个核苷酸的RNA片段（%DV200）（图2F），表明RNA质量较高9,11。
该方法存在一定的局限性。首先，由于小鼠是骨组织样本的唯一来源，该方法仅在小鼠骨骼上得到验证，而小鼠骨骼相对较小。此外，尚不清楚该方法是否适用于年龄大于或小于8周的小鼠，因为该方法仅在8周龄小鼠上进行过测试。我们选择8周龄小鼠是因为其骨骼已发育成熟。由于衰老会改变骨骼的矿物质含量，因此可能需要对该方法进行相应调整。
此外，本文还报告了相关指南，以帮助提高使用小块未脱钙骨标本的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本时组织切片的质量，例如直接从组织库获取的样本。在这些情况下，如果RNA已经降解，则无法补救，但切片质量仍可改善。另一方面，对于RNA含量良好的样本（如本文所示），只要遵循所提供的指南，即可进行空间转录组分析。值得注意的是，在原发性骨肉瘤标本中，肿瘤组织的存在可能改变骨结构，使实际样本变得更脆弱易碎，这反而可能有利于切片。因此，采用戈德纳三色染色法（Goldner's Trichrome staining）来评估是否存在这种情况，因为该染色技术能够区分矿化与非矿化区域（图3C）。
综上所述，本研究报道的方法是一种易于应用的骨组织样本脱钙方法，可获得可用于下一代测序（NGS）或其他需要RNA完整性的技术的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片。此外，本文还提供了针对那些在石蜡包埋前未进行脱钙处理的样本（例如来自组织库的样本）的切片指南。鉴于空间转录组学分析技术的快速发展，该方法及操作指南在骨组织研究以及骨癌研究中均可能具有重要帮助。

骨是一种特化的结缔组织，主要由I型胶原纤维和无机盐组成1。因此，骨具有极高的强度和刚性，同时又具备轻质和抗创伤的特性。骨的高强度来源于其矿物质含量。事实上，矿物质含量每增加一定百分比，骨的刚度便会提高五倍2。因此，研究者在通过组织学切片方法分析骨样本的生物学特性时，面临着显著的技术难题。
未脱钙骨组织学在某些情况下是可行且必需的，具体取决于研究类型（例如，用于研究骨的微结构）；然而，该技术极具挑战性，尤其是当样本体积较大时。在这种情况下，组织学用途的组织处理需要对标准方案和技术进行多项修改3。通常，为了进行常规组织学评估，骨组织在固定后会立即进行脱钙处理，该过程所需时间从数天到数周不等，具体取决于组织大小和所使用的脱钙剂4。脱钙切片常用于骨髓检查、肿瘤诊断等。脱钙剂主要有三种类型：强酸（如硝酸、盐酸）、弱酸（如甲酸）和螯合剂（如乙二胺四乙酸，即EDTA）5。强酸可快速脱钙，但可能损伤组织；弱酸应用广泛，适用于诊断性操作；螯合剂目前在研究应用中使用最为广泛且最为合适，因为其脱矿过程缓慢而温和，有利于保持高质量的形态结构，并保留基因和蛋白质信息，满足多种实验（如in situ杂交、免疫染色）的要求。然而，当需要完整保存整个转录组（如用于基因表达分析）时，即使是缓慢而温和的脱矿过程也可能造成不利影响。因此，当组织的形态学分析需要与细胞的基因表达分析相结合时，亟需更优的技术和方法。
得益于单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学技术的最新进展，即使组织样本经过福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）保存，现在也能够研究其基因表达谱6,7,8。这一进展使得研究人员能够获取更多样本资源，例如全球各地组织库中储存的样本。若采用scRNA-seq技术，RNA完整性是最关键的要求；然而，在对FFPE样本进行空间转录组学分析时，不仅需要高质量的RNA，还需要高质量的组织切片，以便在每张组织切片的组织学背景下可视化基因表达。尽管软组织样本已能较容易地实现这一目标，但硬组织（如骨组织）却尚未达到同等水平。据我们所知，目前尚无任何研究成功对FFPE骨组织样本进行空间转录组学分析。其主要原因在于缺乏能够在保留RNA含量的同时有效处理FFPE骨组织的实验方案。本文首先提供了一种在避免RNA降解的前提下处理和脱钙新鲜骨组织样本的方法。随后，考虑到全球组织库中收集的FFPE样本对转录组学分析的迫切需求，本文还提出了针对未脱矿骨组织FFPE样本的规范化操作指南。

<table><tbody><tr><td>高级轨道摇床</td><td>VWR</td><td>76683-470</td><td>根据方法说明，用于在孵育期间保持组织处于振荡状态。</td></tr><tr><td>骆驼毛刷</td><td>Ted Pella</td><td>11859</td><td>根据指南，用于操作FFPE切片。</td></tr><tr><td>双索引试剂盒 TS Set A 96次反应</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000251</td><td>用于进行空间转录组学实验。</td></tr><tr><td>200试验证乙醇</td><td>Decon Labs Inc</td><td>2701</td><td>根据方法说明，用于进行组织脱水。</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S312-500</td><td>用于配制20% EDTA溶液（pH 8.0）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fisherbrand 弯头中等尖头通用镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-110</td><td>根据指南，用于操作FFPE切片。</td></tr><tr><td>Fisherbrand 精细精密探针</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-153</td><td>根据指南，用于操作FFPE切片。</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>根据指南，用于贴附卷曲的切片。</td></tr><tr><td>高轮廓金刚石切片刀</td><td>CL Sturkey</td><td>D554DD</td><td>根据指南，用于切取FFPE组织块。</td></tr><tr><td>Novaseq 150PE</td><td>Novogene</td><td>N/A</td><td>测序仪。</td></tr><tr><td>32% 电镜级甲醛（PFA）水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>用1×PBS&amp;nbsp;稀释至终浓度为4%，用于组织固定。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-049</td><td>即用型。根据方法说明，用于稀释PFA及进行洗涤步骤。</td></tr><tr><td>Premiere 组织漂浮浴&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A84600061</td><td>根据指南，用于去除FFPE切片上的皱褶。</td></tr><tr><td>RNase AWAY 表面去污剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7002</td><td>根据方法说明，用于清洁所有表面。</td></tr><tr><td>RNeasy DSP FFPE 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>73604</td><td>根据指南，在FFPE切片制备完成后，用于从中提取RNA。</td></tr><tr><td>半自动旋转式切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2245</td><td>根据指南，用于切取FFPE组织块。</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Millipore Sigma</td><td>S8045-500</td><td>将400 g缓慢溶解于1升Milli-Q水中，配制成10 N溶液。</td></tr><tr><td>Space Ranger</td><td>10X Genomics</td><td>2.0.1</td><td>用于处理测序数据输出。</td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast 包埋剂</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td>根据方法说明，用于组织浸润和包埋。</td></tr><tr><td>Visium 附件试剂盒</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000194</td><td>用于进行空间转录组学实验。</td></tr><tr><td>Visium 人类转录组探针试剂盒 小号&amp;nbsp;</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000363</td><td>用于进行空间转录组学实验。</td></tr><tr><td>Visium 空间基因表达载片试剂盒 4次反应&amp;nbsp;</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000188</td><td>若进行空间转录组学实验，用于放置组织切片。</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803665</td><td>根据方法说明，用于进行组织透明化处理。</td></tr></tbody></table>

骨组织空间转录组学研究方法

Methods to Enable Spatial Transcriptomics of Bone Tissues

了解细胞与其在每种组织内位置之间的关系，对于揭示与正常发育及疾病病理相关的生物学过程至关重要。空间转录组学是一种强大的方法，能够在组织样本中分析整个转录组，从而提供有关细胞基因表达及其所处组织学环境的信息。尽管该方法已被广泛应用于多种软组织，但其在骨等硬组织分析中的应用仍具挑战性。主要挑战在于处理硬组织样本以进行切片时，难以同时保持高质量的RNA和组织形态。因此，本文介绍了一种用于处理新鲜获取的骨组织样本的方法，以有效生成空间转录组学数据。该方法可实现样本的脱钙，从而成功获得组织切片，并在避免RNA降解的同时保留组织形态学细节。此外，还提供了针对未经脱矿处理、先前已包埋于石蜡中的样本（例如从组织库收集的样本）的详细操作指南。&#160;利用这些指南，展示了从骨肉瘤原发肿瘤及肺转移的组织库样本中生成的高质量空间转录组学数据。

本文所述方法介绍如何处理新鲜分离的骨骼，以获得脱矿质的石蜡包埋（FFPE）样本，这些样本可轻松使用切片机进行切片，同时保持RNA的完整性（图1）。该方法已成功应用于小鼠股骨，但也可用于其他尺寸相似的骨组织样本，或通过增加所有参数（时间、溶液体积等）调整适用于较大的骨样本（例如人源样本）。
<img alt="骨组织处理流程图：固定、脱钙、脱水、包埋、切片示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66850/66850fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：实验方案的示意图。 获得脱钙骨组织FFPE包埋块并保持RNA完整性的方法示意图（步骤1和2）。FFPE包埋块切片操作指南的示意图（步骤3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66850/66850fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为验证脱钙时间的准确性，进行了时间过程实验，比较了未脱钙的股骨、脱钙3小时的股骨（每30分钟更换一次EDTA，共更换6次）以及脱钙24小时的股骨（每30分钟更换一次EDTA，共更换10次，随后在EDTA中过夜）图2）。随后根据上述指南对获得的FFPE组织块进行切片，并验证所获切片的组织学质量和RNA完整性。为此，通过苏木精和伊红（H&amp;E) 染色后进行显微镜检查（图2A,C,E），同时通过评估长度大于200个核苷酸（200 nt）的RNA片段所占比例（即DV200评分）来检测RNA质量4 (图 2B,D,F）。H&amp;E图像显示，未脱钙和脱钙3小时的股骨切片出现多处骨折、孔洞和损伤（图 2A,C），而脱钙24小时的股骨切片显示出良好的组织学质量（图 2E所有样本的 DV200 值均高于 50%，该值被认为是进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）或空间转录组学分析的最低标准4. 每日更换EDTA的更长孵育时间，在 4 °C，且在较小容器中轻微振荡的条件也进行了测试，但不推荐使用，因为在此类条件下，样品的RNA完整性会急剧下降（图2H因此，将孵育时间缩短至24小时，同时增加脱钙的频率、振荡强度和脱钙液体积，以提高脱钙效率。
<img alt="骨脱钙过程的组织学与电泳图谱；显微镜图像及分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66850/66850fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图28周龄小鼠股骨脱钙后切片及RNA完整性质量控制（QC） 8周龄小鼠的股骨经新鲜解剖后，用20% EDTA（pH 8.0）固定并脱钙，在不同时间点按所述方法包埋于石蜡中，并依据已报道的指南进行切片。随后通过H&amp;E染色，而RNA完整性则通过评估长度大于200个核苷酸（200 nt）的RNA片段分布值（DV200）来确定。AH&amp;E染色显示未脱钙的8周龄小鼠股骨切片。右图显示方框区域的高倍放大图像。B) 8周龄小鼠股骨切片未经脱钙处理后的RNA质控。C) H&amp;E染色显示脱钙3小时后8周龄小鼠股骨切片。右侧图像为方框区域的高倍放大。D) 脱钙3小时后，8周龄小鼠股骨切片的RNA质量检测。E) H&amp;E染色显示脱钙24小时后8周龄小鼠股骨切片。右侧图像为方框区域的高倍放大。F) 脱钙24小时后8周龄小鼠股骨切片的RNA质量检测。 (GH&amp;E染色显示脱钙72小时后8周龄小鼠股骨切片。右图显示方框区域的更高倍数放大图像。H8周龄小鼠股骨切片经72小时脱钙后的RNA质量检测。缩写：H&amp;E = 苏木精和伊红；DV200 (%) = 片段分布值百分比 &gt; 200 nt；nt = 核苷酸 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66850/66850fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
为了验证已报道的处理非脱钙FFPE样本指南的有效性，我们收集了来自肌肉骨骼肿瘤登记库与组织库（MOTOR）的非脱钙人源原发性骨肉瘤及肺转移性骨肉瘤的FFPE组织块，并进行了空间转录组分析（图3）。在进行空间转录组分析之前，先将FFPE组织块重新包埋于石蜡中，以获得平整的起始切面。随后评估切片的RNA质量和组织学质量（数据未显示）。水化步骤至关重要，因为原发性骨肉瘤样本若未经充分水化则无法切片；相比之下，肺转移灶样本则无需任何水化处理。切片完成后，将组织置于空间转录组芯片上（图3A），进行H&amp;E染色（图3D），并按照制造商说明进行空间转录组分析（见材料表）。对获得的cDNA文库进行测序，并使用Space Ranger进行数据处理以实现质量控制5（图3B）。Space Ranger输出结果显示有效条形码、有效唯一分子标识符（UMIs）、Q30碱基以及每点检测到的基因中位数（介于1700至5000之间）的得分均非常高（接近100%），表明所获数据具有高度的稳健性和可靠性（图3B）。通过无偏图聚类分析，共鉴定出12个主要细胞簇，包括成骨细胞、免疫细胞、上皮细胞、内皮细胞以及脂肪细胞簇（图3E）。值得注意的是，这些细胞簇的边界与病理医师识别出的组织学区域边缘高度吻合（图3D）。此外，对同一样本的其他切片还进行了Goldner三色染色，以显示矿化区域（图3C）。
<img alt="组织学切片分析；肿瘤与正常组织；病理学注释；细胞群体分布图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66850/66850fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3。两对未脱钙原发性骨肉瘤（OS）及其肺转移灶的空间转录组学分析。 从本研究团队的 MOTOR 组织库中收集了两对匹配的未脱钙人源原发性骨肉瘤及肺转移灶的 FFPE 组织块。根据已报道的指南对样本进行切片，并将切片置于适用于 FFPE 样本的 Visium 空间基因表达载玻片上，以开展空间转录组学分析。（A）附有组织切片的用于 FFPE 样本的 Visium 空间基因表达载玻片。（B）Space Ranger 输出结果，显示用于评估所有样本数据质量的常用参数。（C）Goldner 三色染色显示矿化骨组织与类骨质的定位。（D）H&amp;E 染色显示病理学家的注释结果。（E）聚类分析显示组织内细胞群体的分布定位。缩写：FFPE = 甲醛固定及石蜡包埋；MOCs = 恶性成骨细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66850/66850fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍一种可对新鲜获取的骨组织进行脱钙并同时保存高质量RNA的方法。此外，还展示了一种对未经脱矿的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）骨样本进行切片的方法，以便在无法获得或采集新鲜组织时仍能获得良好的实验结果。

理解细胞与其在每种组织内所处位置之间的关系，对于揭示相关的生物学过程至关重要……

我们的目标是寻找更有效的治疗方法来治疗一种名为骨肉瘤的人类骨癌。为此，我们希望揭示导致该肿瘤发生、尤其是其转移发展的生物学过程，因为转移是导致患者死亡的主要原因。通过对多例匹配的人类原发性骨肉瘤及肺转移样本进行空间转录组学分析，我们在多个患者中定位到肿瘤区域内共有的细胞群体，并通过比较这些群体，鉴定出多个关键基因，这些基因可能成为预防肺转移的有价值治疗靶点。由于难以在处理硬组织（如骨骼）以进行切片的同时，保持高质量的RNA和组织形态完整性，因此对这类组织进行空间转录组学分析一直极具挑战性。本方案填补了这一技术空白，使研究人员能够成功地将空间转录组学分析应用于此类组织。首先，用70%乙醇喷洒小鼠皮肤。然后使用无菌解剖剪剪开皮肤，暴露腿部肌肉。沿腿部切开肌肉以清晰观察骨骼，并小心去除骨骼，避免损伤。立即将骨骼放入含有4%多聚甲醛的离心管中，并将离心管置于冰上。收集所有骨样本后，将试管置于冷室中的摇床上，4摄氏度条件下至少孵育24小时。固定完成后，从摇床上取出骨组织，用1×PBS缓冲液洗涤两次，每次三分钟。然后使用无菌解剖剪去除附着在骨上的任何残留肌肉组织。用 1× PBS 再次清洗骨组织 3 分钟。将骨组织放入新的容器中，容器内含有 pH 8 的 20% EDTA，于室温下在 140 转/分钟的摇床上孵育 30 分钟。然后更换为新鲜的 20% EDTA 溶液，再以相同条件振荡 30 分钟。最后一次 EDTA 处理后，加入新鲜的 EDTA，将容器置于4°C的摇床上，孵育过夜。接着，从 EDTA 容器中取出样本，用1×PBS 洗涤两次，以去除 EDTA 残留物。将骨组织放入70%乙醇中，启动脱水过程，并在140 RPM 条件下孵育15分钟。 然后弃去70%乙醇溶液，加入90%乙醇溶液，在140 RPM条件下孵育15分钟。接着，将脱水后的骨组织置于盛有二甲苯的新容器中，开始透明处理。在 140 RPM 条件下孵育 20 分钟。将用过的二甲苯更换为新鲜二甲苯，再孵育 20 分钟。接着，将透明处理后的骨样本放入包埋盒中，开始石蜡浸渗。在 60 摄氏度下孵育 30 分钟。弃去用过的石蜡。加入新的石蜡，再孵育 30 分钟。然后更换石蜡，并再孵育45分钟。将骨骼以所需的方向小心地置于模具中。在冷表面上使石蜡固化。将组织块置于 4°C 保存，直至切片。接下来，准备切片所需的设备。使用去污染溶液喷洒所有工作表面和仪器，以去除 RN 酶。同时，准备一个装有双蒸水的水浴，温度设为42摄氏度。用70%乙醇清洁切片刀以去除油渍，然后进行去污染处理以去除RNase。将刀片固定在切片机上，并确保刀片间隙角设置为10度。用去污溶液喷洒镊子、刷子和探针，并将其存放于一个冰桶中。在另一个冰桶中加入重蒸水以制备冰浴。将FFPE组织块置于切片机上，开始切片过程。将切片机设置为修片或设定14微米的切片厚度。开始修片，并持续修片直至组织可见。将FFPE包埋块置于冰浴中进行水化。将水合样本固定在切片机的样品夹中，与刀片对齐，并将切片厚度设置为五微米。开始切片组织。使用预冷的镊子和刷子收集切好的组织，将其放入42摄氏度的水浴中。将组织置于玻片上，在42摄氏度下孵育三小时。将玻片在室温下的烘箱中过夜干燥。将制备好的载玻片存放在室温下的载玻片盒中。通过此方法，从对侧股骨制备了脱钙的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）骨样本。通过比较未脱钙的股骨与脱钙3小时和24小时的股骨，优化了脱钙的时间进程。苏木精和伊红染色显示，较短的脱钙时间会导致切片出现裂纹和损伤，而24小时的脱钙过程则能获得更优的组织学质量。通过RNA片段分布值DV200评估RNA质量发现，脱钙样本的DV200值保持在50%以上，适用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）或空间转录组学等分析。然而，过长的孵育时间会导致RNA完整性下降，因此不推荐使用。

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