骨组织空间转录组学研究方法

我们的目标是寻找更有效的治疗方法来治疗一种名为骨肉瘤的人类骨癌。为此，我们希望揭示导致该肿瘤发生、尤其是其转移发展的生物学过程，因为转移是导致患者死亡的主要原因。通过对多例匹配的人类原发性骨肉瘤及肺转移样本进行空间转录组学分析，我们在多个患者中定位到肿瘤区域内共有的细胞群体，并通过比较这些群体，鉴定出多个关键基因，这些基因可能成为预防肺转移的有价值治疗靶点。

由于难以在处理硬组织（如骨骼）以进行切片的同时，保持高质量的RNA和组织形态完整性，因此对这类组织进行空间转录组学分析一直极具挑战性。本方案填补了这一技术空白，使研究人员能够成功地将空间转录组学分析应用于此类组织。首先，用70%乙醇喷洒小鼠皮肤。

然后使用无菌解剖剪剪开皮肤，暴露腿部肌肉。沿腿部切开肌肉以清晰观察骨骼，并小心去除骨骼，避免损伤。立即将骨骼放入含有4%多聚甲醛的离心管中，并将离心管置于冰上。

收集所有骨样本后，将试管置于冷室中的摇床上，4摄氏度条件下至少孵育24小时。固定完成后，从摇床上取出骨组织，用1×PBS缓冲液洗涤两次，每次三分钟。然后使用无菌解剖剪去除附着在骨上的任何残留肌肉组织。

用 1× PBS 再次清洗骨组织 3 分钟。将骨组织放入新的容器中，容器内含有 pH 8 的 20% EDTA，于室温下在 140 转/分钟的摇床上孵育 30 分钟。然后更换为新鲜的 20% EDTA 溶液，再以相同条件振荡 30 分钟。

最后一次 EDTA 处理后，加入新鲜的 EDTA，将容器置于4°C的摇床上，孵育过夜。接着，从 EDTA 容器中取出样本，用1×PBS 洗涤两次，以去除 EDTA 残留物。将骨组织放入70%乙醇中，启动脱水过程，并在140 RPM 条件下孵育15分钟。

然后弃去70%乙醇溶液，加入90%乙醇溶液，在140 RPM条件下孵育15分钟。接着，将脱水后的骨组织置于盛有二甲苯的新容器中，开始透明处理。

在 140 RPM 条件下孵育 20 分钟。将用过的二甲苯更换为新鲜二甲苯，再孵育 20 分钟。接着，将透明处理后的骨样本放入包埋盒中，开始石蜡浸渗。

在 60 摄氏度下孵育 30 分钟。弃去用过的石蜡。加入新的石蜡，再孵育 30 分钟。

然后更换石蜡，并再孵育45分钟。将骨骼以所需的方向小心地置于模具中。在冷表面上使石蜡固化。

将组织块置于 4°C 保存，直至切片。接下来，准备切片所需的设备。使用去污染溶液喷洒所有工作表面和仪器，以去除 RN 酶。

同时，准备一个装有双蒸水的水浴，温度设为42摄氏度。用70%乙醇清洁切片刀以去除油渍，然后进行去污染处理以去除RNase。将刀片固定在切片机上，并确保刀片间隙角设置为10度。

用去污溶液喷洒镊子、刷子和探针，并将其存放于一个冰桶中。在另一个冰桶中加入重蒸水以制备冰浴。将FFPE组织块置于切片机上，开始切片过程。

将切片机设置为修片或设定14微米的切片厚度。开始修片，并持续修片直至组织可见。将FFPE包埋块置于冰浴中进行水化。

将水合样本固定在切片机的样品夹中，与刀片对齐，并将切片厚度设置为五微米。开始切片组织。

使用预冷的镊子和刷子收集切好的组织，将其放入42摄氏度的水浴中。将组织置于玻片上，在42摄氏度下孵育三小时。将玻片在室温下的烘箱中过夜干燥。

将制备好的载玻片存放在室温下的载玻片盒中。通过此方法，从对侧股骨制备了脱钙的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）骨样本。通过比较未脱钙的股骨与脱钙3小时和24小时的股骨，优化了脱钙的时间进程。

苏木精和伊红染色显示，较短的脱钙时间会导致切片出现裂纹和损伤，而24小时的脱钙过程则能获得更优的组织学质量。通过RNA片段分布值DV200评估RNA质量发现，脱钙样本的DV200值保持在50%以上，适用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）或空间转录组学等分析。然而，过长的孵育时间会导致RNA完整性下降，因此不推荐使用。