基于质外体提取的方法以提高植物来源重组蛋白的纯度

我们研究了如何从植物细胞中提取重组蛋白。更准确地说，我们探讨了当应用于重组蛋白时，胞间连丝蛋白提取方法是否可行。该提取方法检测分泌到胞间连丝中的蛋白质，因此具有更高的均一性。

无需进行细胞破碎，从而减少了细胞内蛋白的干扰以及后续细胞纯化成本。我们将重点探讨如何提高重组蛋白在植物地上部分质外体空间的分泌量，以进一步提升质外体蛋白提取方法的效率。为观察农杆菌浸润48小时后绿色荧光蛋白（GFP）在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中的亚细胞定位，选择一片平坦的叶片，使用打孔器制作一个直径六毫米的孔洞。

在载玻片上滴加30%蔗糖溶液。将叶片样品背面朝上放置，并盖上盖玻片。在农杆菌浸润后第三天，采集表达重组GFP的完整新鲜N. benthamiana叶片，并称重。

用预冷的灭菌双蒸水冲洗叶片，以去除杂质。将20克叶片背面朝下浸入1,000毫升广口烧杯中的500毫升预冷的100毫摩尔磷酸缓冲液中。用100目尼龙细网纱和一块塑料板覆盖叶片。

将烧杯连接至真空泵，施加0.8兆帕的真空压力持续1分钟，然后迅速恢复至大气压。将叶片从缓冲液中取出，并用吸水纸轻轻吸干。

将叶片卷起，并用网状纱线包裹。为了收集质外体洗涤液（AWF），将卷好的叶片尖端朝上放入50毫升离心管中，并用管盖固定网状纱线。在4摄氏度下，以500 ×g离心5分钟。

去除叶片，并用移液器收集AWF。将镍-Sepharose Excel树脂按1:1,000的比例（相对于蛋白提取物体积）加入离心管中。依次用双蒸水和磷酸盐缓冲液分别洗涤镍树脂，每次使用树脂体积10倍的洗涤液，各洗涤三次。

将蛋白提取物与镍树脂在4 °C下孵育两小时以确保充分结合，然后在4 °C下以500 ×g离心五分钟，去除上清液中的未结合蛋白。用磷酸盐缓冲液洗涤树脂三次，每次缓冲液体积为树脂体积的20倍。最后一次洗涤后，加入树脂体积10倍的250 mmol/L咪唑溶液，以洗脱GFP-His。

将混合物在 4 摄氏度下以 500 G 离心五分钟，并收集上清液。Western 印迹分析证实了 30 千道尔顿重组蛋白 GFP-His 在 N. benthamiana 中的瞬时表达。荧光显微镜观察显示 GFP-His 存在于质外体中。

通过真空渗透离心法提取的AWF蛋白也含有GFP His。在测试的八种提取溶液中，磷酸盐缓冲液提取出的AWF和GFP His含量最高。比较不同pH值的磷酸盐缓冲液发现，在中性至弱碱性条件下，AWF和GFP His的提取效果更佳。

此外，100 毫摩尔磷酸盐缓冲液在回收 AWF 和 GFP His 方面表现出最高效率。使用 100 毫摩尔磷酸盐缓冲液，每克鲜叶可从质外体回收 495 微克总 AWF 蛋白。提取的 AWF 中含有 10 微克 GFP His，约占总可溶性蛋白中 GFP His 的 18%。

经过镍亲和层析后，从AWF提取物中获得的GFP His纯度达到84.3%，显著高于通过总可溶性蛋白提取获得的44.9%纯度。