酿酒酵母线粒体转化用于研究翻译及呼吸复合物组装

我们的研究探讨了线粒体蛋白质合成的调控机制及其与内膜组装的关联，这对于氧化磷酸化过程至关重要。我们以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为模型，研究线粒体功能的分子机制，利用其在分子和遗传学层面进行深入研究的优越性。在本领域研究中，我们采用了多种技术，如RNA深度测序、多组学技术、冷冻电子显微镜以及高速微弹轰击法转化酵母线粒体等。

我们在理解多种参与线粒体翻译调控以及呼吸链复合物III和IV组装的蛋白质的作用及其作用机制方面做出了重要贡献。这些蛋白质包括MSS51、PET309、PET54、mS38、cvp3、cvp6等。本方案是研究线粒体核糖体如何识别非线粒体mRNA中StAR序列的不可或缺的工具。

它已成为理解线粒体mRNA中特定核苷酸在翻译调控中作用的关键。这些技术能够解决的问题包括以上示例。目前唯一可用的资源是我们的实验方案，它可用于蛋白酶处理线粒体序列以及利用线粒体DNA进行翻译。

对这些线粒体进行高速轰击转化。该方法为研究翻译过程及呼吸复合物的组装提供了宝贵的信息，而这些信息是其他方法无法获得的。首先，在微量离心管中加入1.5毫升70%乙醇和30毫克0.7微米的钨颗粒。

将混合物在13,200 G条件下离心15分钟。向沉淀中加入1.5毫升无菌水，涡旋振荡后再次离心。弃去上清液后，向钨颗粒中加入500微升无菌的50%甘油。

为了包被颗粒，首先将5微克的2微米质粒和15微克含有线粒体序列的细菌质粒加入置于冰上的微量离心管中。向管中加入100微升钨颗粒悬浮液并涡旋振荡。然后加入4微升1摩尔的亚精胺，并再次涡旋振荡。

现在将100微升预冷的2.5摩尔氯化钙加入管中。短暂涡旋混匀后，将悬浮液在冰上孵育10分钟。在4摄氏度下，以13,200 ×g离心30秒，收集钨颗粒。

然后在 -20 °C 的 200 µL 100% 乙醇中洗涤微粒。最后，将钨微粒重新悬浮于 60 至 70 µL 室温的 100% 乙醇中。为准备基因枪材料，将六个已灭菌的微载体托架放置在无菌玻璃板上。

使用一对无菌镊子将宏载体插入六个宏载体支架中的每一个。用移液器吸取 10 微升 DNA 包被的钨微粒，滴加到每个宏载体表面，并用移液器吸头将液体均匀分布在整個表面上。在 2 毫升 YPR 培养基中接种 roh 零酵母受体菌株。

将培养物置于30摄氏度的旋转滚筒中过夜培养。次日，取300微升培养物转移至含有30毫升新鲜YPR培养基的试管中。将培养物置于30摄氏度、200转/分钟的摇床中培养两晚，直至培养物达到饱和状态。

将酵母细胞在室温下以 600 G 离心五分钟。弃去上清液后，用 600 微升 YPD 培养基重悬细胞。然后使用无菌玻璃涂布棒将 100 微升酵母细胞悬液涂布于固体轰击培养基平板上。

接种完所有培养物后，将培养皿在室温下孵育一至三小时，然后进行轰击。首先，向基因枪粒子递送系统的腔室中加入70%乙醇。15分钟后，用干净的纸巾擦去乙醇。

打开氦气瓶阀门，将压力调节至2000磅每平方英寸。接着，使用无菌镊子将爆破片放置在固定帽上，并将固定帽旋紧在加速管上。再用镊子将微载体有涂层的一面朝下放置在微载体 holder 上。

然后将大载物片盖子拧紧在大载物片上方。将微载物片发射系统放置于真空室从底部数起的第五层。随后，将含有roh零突变株菌苔的平板放置于真空室从底部数起的第二层。

将真空放气保持开关置于真空位置。当真空度达到20至21英寸汞柱时，将真空放气保持开关切换至保持位置。按下点火开关以发射钨颗粒。

当压力达到每平方英寸1,300磅时，爆破片将破裂并发出“砰”的声响。爆破片破裂后，立即把真空排气保持开关转至排气位置，以释放火工开关和真空。使用无菌镊子小心移除附着在培养皿表面的爆破片碎片。

然后用培养皿盖盖好。首先，将酵母的基因枪轰击平板在30摄氏度下培养5至7个晚上。将相反交配型的测试菌株接种于2毫升YPD培养基中，过夜培养。

第二天，将150微升测试菌株培养物转移至YPD平板上。用无菌玻璃涂布棒将测试菌株均匀涂布于平板表面，静置使其自然干燥。使用绒布复制垫和复制器印章，在缺失培养基平板上制作转化质粒营养缺陷标记的母板复制平板。

然后将含有测试菌草坪的 YPD 平板进行复制并培养。48 小时后，将含有测试菌的平板复制到选择性培养基上，以检测目的线粒体基因的存在。比较主平板与对应的菌落，以鉴定阳性菌落。

将主平板上的阳性菌落划线接种到第二个选择性缺失培养基平板上。测试菌株菌苔与转化细胞发生交配，导致线粒体融合。从尿嘧啶缺陷型平板上获得了纯化的阳性合成 rho 缺失菌落。

一些阳性合成型 rho⁻ 菌落丢失了线粒体结构。首先，用合成型 rho⁻ 细胞和受体酵母细胞分别接种两支含有 3 毫升 YPD 培养基的试管。次日，将 750 微升供体菌株和 250 微升受体菌株转移至一支无菌微量离心管中。

将混合物在13,200 ×g 条件下离心1分钟后，取一滴细胞沉淀物转移到YPD平板上并进行培养。在光学显微镜下检查培养物中是否存在“schmooze”形态。若观察到“schmooze”，则将少量细胞团重新悬浮于2 mL YPD培养基中。

将培养物置于30摄氏度的旋转轮中孵育两小时。充分涡旋混匀。然后取10微升细胞悬液加入990微升无菌水中进行稀释。

将100微升稀释后的培养物涂布于一种缺陷型培养基上，该培养基仅支持受体菌株的生长。将获得的菌落转接到相应的选择性培养基上进行复制培养。在鉴定出阳性菌落后，将其再次划线接种至相同的选择性培养基上，以纯化携带目标线粒体DNA的单倍体菌株。