从小鼠脑和颅骨中分离免疫细胞

我们的研究聚焦于缺血性脑卒中和心脏骤停引起的脑缺血后复杂的免疫反应。脑缺血会激活脑内常驻的免疫细胞，并导致外周免疫细胞的浸润。然而，目前对这些免疫细胞的理解仍然有限。

我们的目标是剖析缺血后大脑细胞的免疫状态起源及其功能作用。近期研究揭示了颅骨在脑损伤后免疫反应中的意外作用。因此，在脑缺血后分析脑组织和颅骨骨髓中免疫细胞的变化显得尤为重要。

为此，一个关键步骤是获取足够数量的高质量免疫细胞以进行后续分析。我们的方案使研究人员能够快速从脑组织和颅骨骨髓中获得大量可用的免疫细胞。脑组织免疫细胞分离方案在整个过程中采用低温机械解离方法，可更好地保持转录组和蛋白质组谱的完整性。

颅骨骨髓提取方案简单且有效，适用于从颅骨中提取骨髓细胞。我们将继续深入研究脑缺血对脑组织及颅骨中免疫细胞的影响。鉴于神经炎症在缺血后脑损伤的病理生理过程中起关键作用，本研究有望为缺血性卒中或心脏骤停后的脑保护发现新的治疗靶点。

为了从分离的小鼠脑组织中获得单细胞悬液，将脑组织置于预冷的15毫升玻璃Dounce匀浆器中，加入适量冰冷的Hanks平衡盐溶液（HBSS）缓冲液。使用松散的Dounce研杵在冰上轻轻缓慢地研磨脑组织，约100至120次。将所得的脑组织悬液通过70微米细胞筛滤入50毫升离心管中。

用五毫升 HBSS 冲洗下管，并进行过滤以最大化细胞收集。将过滤后的组织悬液在 4 摄氏度下以 550 G 离心 6 分钟。使用真空抽吸器移除上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 毫升 30% 等渗密度梯度溶液中。将细胞悬液转移至 15 毫升离心管中。

加入适量30%密度梯度溶液，轻轻倒置离心管以确保充分混匀。立即在4°C条件下，以840 ×g离心20分钟，加速度和刹车均设为3档。离心结束后，轻柔地从离心机中取出离心管，避免振荡，使用连接真空系统的1毫升吸头小心吸除上层髓鞘层，随后吸除上清液，保留1至2毫升液体，再用至少10毫升冷的HBSS重悬细胞沉淀。

在4°C条件下，以550 ×g离心6分钟。用至少7毫升冷的HBSS洗涤一次，在尽可能去除上清液后再次离心，将细胞重悬于100至200微升流式细胞术缓冲液中，用于流式细胞术分析。为从小鼠颅骨制备骨髓单细胞悬液，在解剖显微镜下，使用钝头镊子小心地从分离的颅骨上剥离硬脑膜。

将颅骨置于盛有预冷 PBS 的培养皿中，冰上保存，使用 1 毫升移液器冲洗颅骨，确保去除其表面的血渍残留物，然后将颅骨转移至另一盛有足量新鲜冷 PBS 的培养皿中，液面需完全浸没颅骨。在冷 PBS 中，使用无菌剪刀将颅骨剪切成约 3 毫米 × 3 毫米的组织碎片。使用 18 号针头在 500 微升微量离心管底部戳一个孔。

将此管插入含有20微升冷PBS的1.5毫升微量离心管中。然后将颅骨碎片转移至500微升离心管中。在4°C条件下，以10,000 ×g离心30秒。

将收集的胫骨骨髓细胞重悬于500微升红细胞裂解缓冲液中，室温孵育30秒，然后将悬液转移至含有4毫升冷PBS的15毫升离心管中，在4摄氏度下以400 ×g离心6分钟。再用5毫升冷PBS洗涤一次。最后，将细胞沉淀重悬于适当的缓冲液中。