Name: 清醒狨猴的脑电图测量:聆听同种发声 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 了解清醒狨猴脑电图测量技术，用于研究非人灵长类动物对同种发声的神经反应机制。该方法通过无创方式记录脑电活动，为跨物种比较听觉皮层反应潜伏期及探索人类语言进化提供了重要的实验框架。

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本研究得到了京都大学 Hakubi 项目、挑战性研究（开拓）基金（编号：22K18644）、科学研究费补助金（C）（编号：22K12745）、科学研究费补助金（B）（编号：21H02851）以及科学研究费补助金（A）（编号：19H01039）的支持。我们感谢 Editage（www.editage.jp）在英文语言润色方面的帮助。

所有实验均经EHUB动物实验委员会批准（编号：2022-003、2023-104），并依照EHUB发布的《实验灵长类动物护理与使用指南》进行。实验共使用九只普通狨猴（Callithrix jacchus，雄性六只，雌性三只，年龄2-12岁，体重330-490 g）。九只狨猴中，四只以配对或家庭方式饲养，五只单独饲养。种群中的狨猴通常在两岁前以家庭为单位共同饲养，之后根据配对是否成功，转移至配对饲养或单独饲养环境。
1. 动物
<ol>
	<li>将狨猴饲养在配备巢箱、木制栖木和其他丰富化装置的单个笼子中。</li>
	<li>保持房间处于12小时光照-12小时黑暗的循环条件下，温度和湿度分别维持在28 ± 2 °C 和 40 ± 20%。</li>
	<li>每天两次，每次喂食14克新世界猴颗粒饲料，并补充阿拉伯胶和黄粉虫等食物。提供饮水 随意.</li>
	<li>在实验室内隔音箱中进行所有实验。</li>
</ol>
2. 仪器（图1B 和材料表）
<ol>
	<li>使用 4 mm 的银电极。电极表面的氯化银（AgCl）涂层可防止极化，确保记录稳定。</li>
	<li>使用放大器记录脑电（EEG）信号。对信号进行 0.016-250 Hz 的带通滤波，并以 1,000 Hz 的频率采样数据。</li>
	<li>将 64 通道电极输入盒连接至放大器，并将其置于受试者前方。</li>
	<li>将扬声器放置在狨猴头部前方 30 cm 处，控制声音强度为 65-75 dB（以耳部位置测量值为准），并通过该扬声器传递听觉刺激。</li>
	<li>将摄像头置于受试者前方，以在脑电记录期间监测其状态。</li>
	<li>灵长类动物固定椅由亚克力板和合成树脂柱构成。实验时，由研究人员扶住动物使其站立于脚板上；随后插入颈圈并固定至颈板，插入腰托并固定至腰板，确保每只狨猴全身均被适度固定。</li>
</ol>
3. 麻醉
<ol>
	<li>通过肌肉注射阿法沙龙（6-8 mg/kg）和阿托品（0.05 mg/kg）对动物进行麻醉。该方案可使麻醉状态维持约20分钟。如果操作时间较长，可追加阿法沙龙剂量以延长麻醉时间。同时在操作前给予止吐药（马罗匹坦 1 mg/kg，皮下注射），以应对阿法沙龙可能引起的恶心副作用。 
	注意：在操作过程中，狨猴必须处于注射或吸入麻醉状态，剃毛结束后应立即让其恢复清醒。</li>
	<li>使用脉搏血氧仪监测生命体征，必要时给予氧气-空气混合气体（O2 0.5 L/min，空气 0.5 L/min）。</li>
	<li>保持室温在27 °C以上，并用保温布包裹狨猴身体，防止低体温。</li>
</ol>
4. 脱毛
<ol>
	<li>使用电动剃须刀剃除整个头部的毛发（包括耳后区域）。</li>
	<li>涂抹适用于敏感皮肤的脱毛膏，5分钟后用湿纱布擦去。</li>
</ol>
5. 掩模制备
<ol>
	<li>预先加工一个热塑性面罩，使其适配猴椅的尺寸。具体而言，在面罩背部突出于椅背垂直长度的部分钻四个螺钉孔，以便将其固定在椅背的颈板上。 
	注意：热塑性面罩是安全的，可用于放射治疗期间固定患者的头部。我们使用了一种专为儿童设计的小型面罩，并将其裁剪至适合狨猴头部的尺寸。该面罩在置于温水中时会软化 75 °C 当从水中取出后，随着温度降低，它会变硬。</li>
	<li>实验时，将动物置于灵长类实验椅中。使用颈部和腰部固定板支撑麻醉后的动物，并将动物及这些固定板牢固地固定在实验椅上。</li>
	<li>将面罩在热水中加热，然后塑形以适配狨猴的头部。从热水中取出面罩后，等待其温度下降（约降至50多摄氏度） °C 范围）以防止烫伤，然后将其置于受试者头部以塑形面罩。</li>
	<li>冷却并硬化后，将面具从动物身上取下，并剪去面具顶部的头部和耳部部分，以暴露电极放置区域。 
	注意：此掩膜制作完成后，可应用于其他个体。</li>
</ol>
6. 椅位与面罩适应（每天30分钟，持续3天）
<ol>
	<li>在清醒条件下，通过将动物放置于椅子上并给予奖励约 30 分钟，使其适应椅子环境。此操作连续重复 3 天。</li>
	<li>使用面罩使动物适应头部固定，持续 2 天。 
	注：此适应过程根据个体状况进行个性化调整。适应完成后，动物在捕捉和安装头罩时可能会短暂抗拒，但一旦坐入椅子并完成头部固定，便会趋于平静。</li>
	<li>在椅子适应过程中，评估以下行为学指标：i）发出焦虑或警觉性叫声，ii）拒绝接受提供的奖励，iii）出现剧烈动作。若观察到上述任一行为，应终止当日实验，以便狨猴逐步适应实验环境。</li>
</ol>
7. 脑电图记录（2 小时/天）
<ol>
	<li>受试者准备
	<ol>
		<li>将转运笼连接至主笼箱的小窗，通常单独将狨猴从主笼箱转移至转运笼中。用布覆盖转运笼，将其转移至实验室内。</li>
		<li>头部固定
		<ol>
			<li>使用防护手套捕捉狨猴，并将其放置于专用椅子中。</li>
			<li>将准备好的面罩置于狨猴头部。将固定在椅子上的螺杆穿过面罩上的孔，并使用拇指螺钉固定。</li>
			<li>在鼻根下方用绑带轻轻固定头部和面罩。 
			注意：只要电极未因移动而脱落，受试者的头部无需完全固定。因此，我们在所有受试者中使用了相同的面罩。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>电极位置的确定
		<ol>
			<li>以鼻根点、枕外隆凸和耳垂作为解剖学标志，根据国际10-20系统确定电极的位置32,33,34,35,36,37用卷尺测量正中线上鼻根点（nasion）与枕外隆凸点（inion）之间的距离。将Cz电极位置定义为该距离的中点。以inion-nasion距离的20%作为电极间距，确定其他电极（Fz、Pz、Oz、F3或F4）的位置。使用油性皮下记号笔在头皮上标记电极位置。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>皮肤准备
		<ol>
			<li>用蘸有异丙醇的细棉签擦拭标记区域，以清除头皮上的污垢和皮脂。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电极设置 
	注意：在所有电极位置执行步骤 7.2.1–7.2.3，将电极置于 Fz、Cz、C3、C4、Pz、A1、A2 和 F3（或 F4）。
	<ol>
		<li>使用管子切割器将一段内径为4 mm、外径为7 mm的硅胶管切割成约20 mm长。</li>
		<li>将粘合剂涂抹于切割后管子的边缘，并将其粘附至头皮。</li>
		<li>使用注射器和非尖头注射器针头，将脑电图凝胶注入管内。</li>
		<li>将参考电极连接至Pz，接地电极连接至F3或F4（图1C).</li>
		<li>将电极插入管中，并将电极电缆连接到输入盒。</li>
		<li>启动脑电图记录应用程序以测量电极阻抗，并调整参数以确保所有电极阻抗均低于 5 kΩ。</li>
		<li>将电极电缆捆扎在一起以减少噪声。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在头部固定过程中及任务阶段之间，使用注射器手动给予1-3 mL液体奖励（胶状物或营养液）作为奖励。</li>
	<li>指定 EEG 记录软件中要保存的文件，然后按下 开始录制 按钮。在开始 EEG 记录后立即运行刺激呈现脚本。按下 停止 刺激呈现脚本执行完毕后，按 EEG 记录按钮以结束所有记录。记录完成后，取下电极和头戴式遮罩。</li>
	<li>捕捉动物并将其放回运输笼中。将导管保留在头皮上；所有导管均在约1天后自然脱落。 
	注意：在早期阶段，我们使用丙酮溶解黏合胶以在记录结束后移除套管；然而，曾出现皮肤损伤的情况；因此，后续我们不再移除套管，而是直接将动物放回其饲养笼中。在迄今为止开展的数十次实验中，狨猴对已移除的套管均未表现出任何兴趣，也从未发生误食情况。</li>
	<li>刺激
	<ol>
		<li>在未用于后续脑电图记录的圈养或实验室内狨猴中，录制其自然的简单叫声和复合叫声。提取三种物种特异性的简单叫声和复合叫声（Phee, Tsik-Ek, 和 Tsik-String5 从录制的文件中提取呼叫（calls）。</li>
		<li>除了呼叫刺激外，使用编程软件中的函数生成白噪声，并将其用作刺激。</li>
		<li>使用三个狨猴叫声的听觉文件（16 位，48 kHz）进行本实验。通过自定义脚本控制实验任务。 
		注意：每个区块包含每种刺激50次呼叫，共200次呼叫。每次录音区块持续约10分钟。每位参与者需完成两个区块。呼叫间间隔为3 s。四种音频刺激文件（参见 补充文件 1），该 Phee 呼叫刺激持续约2秒，而其余三个刺激持续约1秒。这是因为单个 Phee 持续呼叫仍是一个长时间的呼叫（图1D).</li>
		<li>在每个声音刺激文件中，右声道包含狨猴叫声或噪声数据，左声道包含刺激起始的触发信号。通过同步设备将此触发信号发送至脑电图记录系统，并将其记录为事件时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 数据分析
注意：使用编程软件和工具箱中编写的原始代码对脑电图（EEG）数据进行后处理，如下所述（补充文件 2）37。
<ol>
	<li>预处理
	<ol>
		<li>重参考至双耳乳突参考。</li>
		<li>使用2 Hz高通滤波。</li>
		<li>以刺激 onset 前100 ms至刺激 onset 后1000 ms进行分段。</li>
		<li>以刺激前100 ms期间的均值进行基线校正，并依据±150 µV的标准排除伪迹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绘制事件相关电位（ERP）
	<ol>
		<li>对每位受试者的全部试验数据进行平均。</li>
		<li>通过对所有受试者的数据求平均，获得群体平均波形。</li>
		<li>为比较不同类型叫声与噪声刺激之间的平均ERP差异，以刺激类型为组间因子，在Cz电极处进行单因素方差分析（ANOVA）。</li>
		<li>采用Tukey法进行事后多重比较分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绘制事件相关谱扰动（ERSP）
	<ol>
		<li>计算ERSP，以可视化在宽频率范围内谱功率随时间变化的平均事件相关改变，使用公式（1）。其中Fk (f,t)表示第k次试验在频率f和时间t处的谱估计值： 
		<img alt="用于光谱数据分析的频率-时间ERSP方程，显示求和公式。" src="/files/ftp_upload/66869/66869eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1">    （1）</li>
		<li>采用正弦小波变换对神经活动进行时频分解，最低频率（10 Hz）处使用3个周期，最高频率（120 Hz）处线性增加至32个周期。</li>
		<li>定义初始与瞬态响应为刺激 onset 后150 ms内、2–30 Hz频段的活动，持续响应则定义为刺激 onset 后151–950 ms、持续800 ms、40–100 Hz频段的活动。</li>
		<li>为检验Fz与Cz电极处不同受试年龄组和叫声类型之间初始响应与持续响应的差异，采用双因素方差分析（ANOVA），以叫声类型为组内因子，年龄为组间因子。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Noninvasive EEG for Comparative Studies of Vocal Perception in Marmosets

<ol><li>Miller, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marmosets%3A+A+neuroscientific+model+of+human+social+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Marmosets: A neuroscientific model of human social behavior.</a> Neuron. 90 (2), 219-233 (2016).</li>
<li>Okano, H., Hikishima, K., Iriki, A., Sasaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+common+marmoset+as+a+novel+animal+model+system+for+biomedical+and+neuroscience+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Fetal+Neonatal+Med%22%5BJournal%5D)">The common marmoset as a novel animal model system for biomedical and neuroscience research applications.</a> Semin Fetal Neonatal Med. 17 (6), 336-340 (2012).</li>
<li>t'Hart, B. A., Abbott, D. H., Nakamura, K., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marmoset+monkey%3A+a+multi-purpose+preclinical+and+translational+model+of+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">The marmoset monkey: a multi-purpose preclinical and translational model of human biology and disease.</a> Drug Discov Today. 17 (21-22), 1160-1165 (2012).</li>
<li>Bezerra, B. M., Souto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+usage+of+the+vocal+repertoire+of+Callithrix+jacchus%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Primatol%22%5BJournal%5D)">Structure and usage of the vocal repertoire of Callithrix jacchus.</a> Int J Primatol. 29 (3), 671-701 (2008).</li>
<li>Agamaite, J. A., Chang, C. J., Osmanski, M. S., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+acoustic+analysis+of+the+vocal+repertoire+of+the+common+marmoset+%28Callithrix+jacchus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acoust+Soc+Am%22%5BJournal%5D)">A quantitative acoustic analysis of the vocal repertoire of the common marmoset (Callithrix jacchus).</a> J Acoust Soc Am. 138 (5), 2906-2928 (2015).</li>
<li>Pistorio, A. L., Vintch, B., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+analysis+of+vocal+development+in+a+New+World+primate%2C+the+common+marmoset+%28Callithrix+jacchus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acoust+Soc+Am%22%5BJournal%5D)">Acoustic analysis of vocal development in a New World primate, the common marmoset (Callithrix jacchus).</a> J Acoust Soc Am. 120 (3), 1655-1670 (2006).</li>
<li>Grijseels, D. M., Prendergast, B. J., Gorman, J. C., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+vocal+communication+in+marmosets%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N.+Y.+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of vocal communication in marmosets.</a> Ann N. Y. Acad Sci. 1528 (1), 13-28 (2023).</li>
<li>Eliades, S. J., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+of+vocalization+feedback+monitoring+in+primate+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural substrates of vocalization feedback monitoring in primate auditory cortex.</a> Nature. 453 (7198), 1102-1106 (2008).</li>
<li>Eliades, S. J., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+auditory-vocal+interactions+across+multiple+types+of+vocalizations+in+marmoset+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of auditory-vocal interactions across multiple types of vocalizations in marmoset auditory cortex.</a> J Neurophysiol. 109 (6), 1638-1657 (2013).</li>
<li>Eliades, S. J., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+sensory+tuning+to+auditory-vocal+interactions+in+marmoset+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Contributions of sensory tuning to auditory-vocal interactions in marmoset auditory cortex.</a> Hear Res. 348, 98-111 (2017).</li>
<li>Eliades, S. J., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+the+lombard+effect+in+primate+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of the lombard effect in primate auditory cortex.</a> J Neurosci. 32 (31), 10737-10748 (2012).</li>
<li>Tsunada, J., Wang, X., Eliades, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+processes+of+vocal+sensory-motor+interaction+in+primate+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiple processes of vocal sensory-motor interaction in primate auditory cortex.</a> Nat Commun. 15 (1), 3093(2024).</li>
<li>Miller, C. T., Thomas, A. W., Nummela, S. U., de la Mothe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+primate+frontal+cortex+neurons+during+natural+vocal+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Responses of primate frontal cortex neurons during natural vocal communication.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1158-1171 (2015).</li>
<li>Roy, S., Zhao, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+activities+in+premotor+cortex+during+natural+vocal+behaviors+in+a+New+World+Primate%2C+the+common+marmoset+%28Callithrix+jacchus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct neural activities in premotor cortex during natural vocal behaviors in a New World Primate, the common marmoset (Callithrix jacchus).</a> J Neurosci. 36 (48), 12168-12179 (2016).</li>
<li>Wang, X., Merzenich, M. M., Beitel, R., Schreiner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+of+a+species-specific+vocalization+in+the+primary+auditory+cortex+of+the+common+marmoset%3A+temporal+and+spectral+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Representation of a species-specific vocalization in the primary auditory cortex of the common marmoset: temporal and spectral characteristics.</a> J Neurophysiol. 74 (6), 2685-2706 (1995).</li>
<li>Zeng, H. -h, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neuron+populations+for+simple+and+compound+calls+in+the+primary+auditory+cortex+of+awake+marmosets%5BTitle%5D)+AND+%22National+Science+Review%22%5BJournal%5D)">Distinct neuron populations for simple and compound calls in the primary auditory cortex of awake marmosets.</a> National Science Review. 8 (11), nwab126(2021).</li>
<li>Sadagopan, S., Temiz-Karayol, N. Z., Voss, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-field+functional+magnetic+resonance+imaging+of+vocalization+processing+in+marmosets%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High-field functional magnetic resonance imaging of vocalization processing in marmosets.</a> Sci Rep. 5, 10950(2015).</li>
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作者声明无利益冲突。

关于麻醉的注意事项 
曾尝试使用氯胺酮和赛拉嗪，尽管这些药物具有镇痛作用，因此适用于长时间且疼痛的操作，但狨猴在未吸入氧气的情况下往往会出现血氧水平下降44。简而言之，阿法沙龙可能最适合用于剃毛或制备面罩等无痛操作。此外，对于仅需10-15分钟的剃毛操作，吸入麻醉最为合适。由于异氟烷作用时间短且浓度较低（约1%），在插管过程中未使用该药物。
脑电图测量的优势 
头皮脑电图（EEG）是一种通过皮肤、颅骨和皮下组织记录大脑活动的方法，其空间分辨率低于针对单个神经元或具有更高空间分辨率的颅内电极的记录方法。尽管存在这些缺点，在非人灵长类动物中进行头皮脑电图测量仍具有多项优势。首先，该方法为非侵入性，不会对动物造成损伤。例如，对于通过极为复杂的基因工程手段构建的珍贵疾病动物模型，研究者可能希望测量其脑活动。在这种情况下，可安全使用该技术进行脑活动测量，而无需外科手术干预。事实上，该方法使我们能够在长时间内对同一受试个体进行无损伤的神经数据采集。此外，与侵入性神经生理学方法相比，该方法更简便且耗时更少，因而更容易增加受试个体数量。其次，利用该技术从非人灵长类动物获得的脑电图数据，可与采用相同行为范式获取的人类脑电图数据直接比较。这一优势使我们能够从进化角度考察认知相关的神经活动。第三，我们的记录方法允许在清醒状态下的灵长类动物中进行记录。麻醉剂会显著抑制皮层活动，尽管其抑制效应的程度和模式因药物种类而异。该方法可在无药物影响的情况下记录清醒状态下的脑活动。此外，通过给予作用于中枢神经系统的药物并观察脑活动的变化，该技术也可应用于涉及神经机制的研究实验中。
功能性脑成像是一种用于探索人类和非人灵长类动物发声处理相关脑机制的另一种非侵入性方法。近年来的技术进步使得功能性磁共振成像（fMRI）能够在清醒状态下的动物中应用。功能性脑成像的优势在于能够以高空间分辨率实现全脑范围的探索。然而，该设备的安装和维护成本昂贵。相比之下，脑电图（EEG）具有高时间分辨率的优势，能够揭示更具动态性的频率特异性脑活动。此外，该设备成本相对较低，便携性高，可由单名实验人员操作。同时，各种刺激和设备也易于引入实验中。充分利用这些方法的优势，并整合不同技术所得的研究结果，将有助于更深入地理解狨猴发声感知所涉及的神经机制。
与人类或猕猴数据的比较 
在脑电图（EEG）中，大脑产生的信号必须穿过硬脑膜、皮下组织和颅骨后才能在头皮上被记录到。这些组织起到低通滤波器的作用。特别是与α波和β波频段成分相比，高频成分（如尖波）会显著衰减。因此，与皮层脑电图（ECoG）不同，某些脑活动成分无法在头皮上检测到。这是头皮脑电图的一个局限性。狨猴的颅骨、皮下组织和硬脑膜比猕猴和人类更薄，同时头部尺寸也更小。因此，在比较人类和猕猴的研究结果时必须谨慎。例如，源于深部脑区（如脑干）的信号由于衰减率较低且信号源与电极之间的距离相对较近，可以在头皮上记录到相对较大的信号。
此外，狨猴的大脑沟回极少，甚至几乎没有浅表的脑沟。这使得它们与人类明显不同，人类具有大量的脑沟，大脑皮层向内折叠形成脑回。人类、猕猴和狨猴之间的大脑沟回数量和深度存在差异。电信号垂直于皮层产生，并通过放置在脑回表面的电极进行记录，此处锥体神经元的顶端树突——即脑电图（EEG）信号的主要来源——与电极方向垂直。而在脑沟区域，由于信号相对于脑表面呈水平方向产生，其强度会减弱，并被投射到较远的电极上。因此，在比较人类与猕猴及狨猴的研究结果时，必须考虑脑电图记录的位置以及相应区域的解剖结构。

灵长类动物利用物种特异性的发声来传递重要的生物学信息，例如发声者的情绪状态或维持社会联系的意图、捕食者的出现或其他危险情况。对具有丰富发声行为的非人灵长类动物在感知发声时所涉及的神经机制进行研究，可能为我们提供关键线索，以更好地理解人类语言的进化起源。
普通狨猴是原产于南美洲的小型灵长类动物。近年来，由于其繁殖能力强、体型小易于操作，以及转基因技术的发展，狨猴与猕猴一样被越来越多地用作模式动物1,2,3。除了作为疾病模型的应用价值外，群体内丰富的声音交流是该物种另一显著特征4,5,6,7。狨猴在森林中经常通过发声信号与不可见的同种个体进行交流。通过研究狨猴发声感知和产生过程中涉及的脑活动，我们可以了解它们在大脑中如何处理自身或同种个体叫声的听觉信息，并确定参与其中的神经回路。先前的研究已证实，初级听觉皮层8,9,10,11,12和前额叶皮层13,14参与了狨猴的发声产生过程。此外，初级听觉皮层中的听觉-发声相互作用可调节这些神经元的兴奋和抑制反应8,10。这些研究通过侵入性记录方法提供了单个神经元水平上的详细神经活动数据。已有大量研究进一步探讨了与狨猴发声产生相关的神经活动；然而，关于发声感知的神经机制仍知之甚少15,16。
多项非侵入性脑成像研究已阐明了狨猴发声处理的神经机制17,18,19；这些方法具有高空间分辨率的优势，然而，扫描过程中保持动物处于清醒状态需要先进的技术。然而，最近Jafari等人利用功能磁共振成像（fMRI）在清醒的狨猴中识别出参与发声感知的额颞区19。几乎所有旨在阐明人类发声感知与产生相关脑功能的实验均采用非侵入性方法进行，例如头皮脑电图（EEG）、脑磁图（MEG）20,21和fMRI22,23,24。大量人类研究已使用EEG探讨与发声感知相关的脑活动。其中大多数研究集中于情绪信息25,26,27以及情绪词汇的显著性28，结果揭示了发声感知过程中事件相关电位的变化29。人类颅内电皮层记录（ECoG）及使用植入式电极进行的单神经元记录仅在少数接受神经外科治疗的患者中开展过有限的实验30,31。
从进化角度比较人类与猴子，对于理解人类在发声感知和产生方面所发展出的独特神经机制具有重要意义。为了直接比较狨猴等发声丰富的非人灵长类动物与人类在言语感知和发声过程中涉及的神经机制，采用相同的方法在两个物种之间进行数据比较至关重要。功能磁共振成像（fMRI）能够实现全脑成像，且具有高空间分辨率，其优势在于可记录垂直于颅骨或脑深部区域的活动，而这些区域使用脑电图（EEG）或脑磁图（MEG）难以记录。然而，MRI设备的安装和维护成本高昂，且由于设备本身的特性，对可呈现的刺激存在诸多限制。相比之下，脑电图（EEG）、事件相关电位（ERPs）和脑磁图（MEG）具有高时间分辨率，适用于分析时间序列的语音处理过程。特别是EEG，具有便携性强、可在多种实验环境中使用、相对成本较低以及仅需单人操作等优势。
由于已在人类中获得了大量脑电图（EEG）数据，因此需要采用非侵入性范式来对非人灵长类动物进行EEG测量。我们的研究团队为猕猴和狨猴开发了一种利用管道的独特非侵入性EEG记录方法32。本文报道了关于非人灵长类动物听觉处理的若干新发现33,34,35,36,37。为了表征狨猴对物种特异性发声的脑活动反应，我们构建了一个实验系统，通过放置在头皮上的电极非侵入性地记录脑活动。本研究描述了狨猴的EEG测量方法。

<table><tbody><tr><td>阿法沙龙</td><td>明治动物健康</td><td>Alfaxan</td><td></td></tr><tr><td>放大器</td><td>Brain Products</td><td>BrainAmp</td><td></td></tr><tr><td>阿托品</td><td>Fuso Pharmaceutical Industries</td><td>硫酸阿托品注射液</td><td></td></tr><tr><td>音频编辑器</td><td>Adobe</td><td>Adobe Audition</td><td></td></tr><tr><td>数据处理软件</td><td>MathWorks</td><td>MATLAB</td><td>版本 R2023a</td></tr><tr><td>数据处理工具箱</td><td>加利福尼亚大学圣迭戈分校</td><td>EEGLAB</td><td></td></tr><tr><td>数据处理工具箱</td><td>加利福尼亚大学戴维斯分校</td><td>ERPLAB</td><td></td></tr><tr><td>电动剃须刀</td><td>Panasonic</td><td>ER803PPA</td><td></td></tr><tr><td>电极</td><td>独特的医疗</td><td>UL-3010</td><td>AgCl 涂层（定制）</td></tr><tr><td>电极凝胶</td><td>Neurospec AG</td><td>V16 SuperVisc</td><td></td></tr><tr><td>电极输入盒</td><td>Brain Products</td><td>EIB64-DUO</td><td>64ch</td></tr><tr><td>胶水</td><td>3M</td><td>Scotch 7005S</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Kracie</td><td>适用于敏感肌肤的脱毛膏</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Bussan Animal Health</td><td>异氟烷</td><td></td></tr><tr><td>液态口香糖</td><td>San-ei Yakuhin Boeki</td><td>阿拉伯语字幕 SS</td><td>阿拉伯胶 + 水</td></tr><tr><td>液体营养</td><td>雀巢&amp;eacute; 健康科学公司</td><td>Isocal 1.0 Junior</td><td>聚合物分子式</td></tr><tr><td>马罗匹坦</td><td>硕腾&amp;nbsp;</td><td>Cerenia注射液</td><td></td></tr><tr><td>监控摄像头</td><td>英特尔</td><td>RealSense LiDAR相机L515</td><td></td></tr><tr><td>猴粮颗粒</td><td>东方酵母</td><td>SPS</td><td></td></tr><tr><td>灵长类实验椅</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>订单已生成</td><td></td></tr><tr><td>脉搏血氧仪</td><td>Covident</td><td>Nellcor</td><td>PM10N</td></tr><tr><td>皮肤准备面膏&amp;nbsp;</td><td>曼嫩多夫研究所&amp;uuml;物理学与医学</td><td>NeuPrep</td><td></td></tr><tr><td>硅胶管</td><td>AsONE</td><td>&amp;Phi;4 × 7 毫米</td><td></td></tr><tr><td>发言人</td><td>Fostex</td><td>PM0.3</td><td></td></tr><tr><td>同步装置</td><td>脑电图视野</td><td>StimTrak</td><td></td></tr><tr><td>热塑性面罩</td><td>CIVCO</td><td>MTAPU 型一次性热塑性膜片口罩 2.4 mm</td><td></td></tr></tbody></table>

清醒狨猴聆听同种声音时的脑电图测量

Electroencephalography Measurements in Awake Marmosets Listening to Conspecific Vocalizations

声音交流在灵长类动物的社会互动中起着至关重要的作用，尤其关系到生存与社会结构。人类已发展出一种独特且高度复杂的以语言形式呈现的声音交流策略。为了研究人类语言的演化过程，有必要探究人类声音处理背后的神经机制，同时通过与非人灵长类动物的脑机制进行比较，理解脑机制的演化路径。本文中，我们建立了一种非侵入性测量清醒状态非人灵长类动物脑电图（EEG）的方法。该记录方法可在不伤害动物的前提下实现长期研究，更重要的是，使我们能够直接比较非人灵长类动物与人类的脑电图数据，从而为人类语言的演化提供新的见解。在本研究中，我们采用头皮脑电图记录方法，探究狨猴对物种特异性发声刺激的脑活动反应。本研究利用头皮脑电图技术捕捉狨猴在声音感知过程中广泛的神经表征，为现有知识体系填补了重要空白。

首先，我们绘制了狨猴对每种听觉刺激的平均事件相关电位（ERPs）（图2）。在噪声条件下，听觉诱发电位（AEP）尤为显著，反映了刺激的清晰起始（见图1D）。为了比较不同类型叫声与噪声刺激之间平均ERPs的差异，我们在Cz通道的反应中以刺激类型为被试间因素进行了单因素方差分析（ANOVA）。结果发现，刺激类型对刺激起始后13–18 ms、28–36 ms以及45–88 ms时段的Cz活动具有显著的主效应（p &lt; 0.05）。采用Tukey法进行事后多重比较分析显示，噪声与其他叫声之间存在差异（p &lt; 0.05），但不同类型狨猴叫声之间无显著差异。该结果表明，仅从事件相关电位中无法观察到不同叫声类型引起的脑活动差异。
接下来，我们对每位受试者进行了时频分析。 图3 展示了时频图的一个示例 Tsik-string 受试者R（老年）获得的呼叫， 图 3A）以及受试者Y（较年轻， 图3B). 我们发现，事件相关谱功率在刺激呈现后立即在约20–50 Hz的较低频率范围内增加。这些反应在Cz导联处尤为显著。相比之下，与基线期相比，刺激呈现后伽马频段功率（高于30 Hz）下降，且这种下降持续约1秒。在8岁以上的年长个体中未观察到事件相关功率的下降。在这些例子中，年长个体在头顶区域（Cz）对叫声刺激表现出更强的初始反应，而年幼个体则在叫声呈现期间表现出γ频段活动的持续性降低。结果表明，受试者的年龄不同，其初始反应和持续性反应存在差异。
最后，我们研究了受试者年龄与事件相关谱扰动（ERSP）功率在初始瞬态反应（图4A）和持续反应（图4B）中的关系。采用双因素方差分析（ANOVA），以刺激类型作为组内因素，年龄作为组间因素，以确定听觉刺激类型和受试者年龄对脑电活动的贡献。在Fz导联的初始瞬态反应中，刺激类型（F (3,24) = 9.020, p &lt; 0.001）和年龄（F (8,24) = 3.934, p = 0.004）均表现出显著的主效应。然而，刺激类型与年龄之间无显著交互作用（p = 0.144）。在Cz导联的瞬态反应中，刺激类型存在显著主效应（F (3,24) = 8.533, p &lt; 0.001），但年龄效应不显著（F (8,24) = 2.215, p = 0.073），且无显著交互作用（p = 0.228）。对于持续反应，在Fz导联上，刺激类型和年龄均表现出显著主效应（F (3,24) = 9.020, p &lt; 0.001；F (8,24) = 3.934, p = 0.004），但未观察到显著交互作用（P = 0.144）。Cz导联的持续反应显示出刺激类型的显著主效应（F (3,24) = 8.533, p &lt; 0.001），但年龄主效应不显著（F(8,24) = 2.215, p = 0.073），也无显著交互作用（p = 0.228）。这些结果表明，在中额区（Fz），对叫声和噪声刺激的初始瞬态反应随年龄增长变化显著，而较年轻年龄组的持续反应受到抑制。这可能反映了额叶区域的功能成熟过程。
先前的神经生理学研究报道了绒猴发声期间初级听觉皮层中的神经元反应9,38此外，超过一半的这些神经元在发声期间表现出持续的抑制性反应9,38此外，先前在非人灵长类动物和人类中开展的电生理学研究显示，局部场电位（LFP）和ECoG中的高频γ波段活动与神经元的放电率具有良好的相关性39,40,41,42头皮脑电图（EEG）是局部场电位（LFP）在1 cm²面积上的时空平滑化整合版本。2 或更多43尽管脑电图（EEG）的高伽马成分与放电率的相关性低于局部场电位（LFP）和皮层脑电图（ECoG），但被认为可编码数厘米范围内的整合输出信号。因此，我们在实验中观察到Cz位点伽马频段功率的持续下降，可能反映了在发声过程中活动受到抑制的神经元集群的活动，这种现象在听觉皮层中已有发现。相比之下，以往的电生理学研究报道，在发声过程中，额叶皮层（主要位于前运动皮层）中有更多的神经元表现出兴奋性反应。13有趣的是，在我们的实验中，即使将Fz电极置于额区，仍观察到持续的抑制性活动，尽管在语音感知与语音产生之间观察到了不同的神经机制。最近一项fMRI研究进一步在额叶皮层中鉴定出多个亚区，包括前扣带皮层和前运动皮层，这些区域作为“发声区”，会对狨猴物种特异性的叫声产生反应19我们的结果反映了这些区域的整体脑活动。
在本实验中，我们仅使用了中线位置的探索电极（Fz、Cz、Pz 和 Oz），因此无法讨论听觉处理过程中大脑右侧与左侧 EEG 活动之间的任何差异。未来我们需要进一步研究与声音处理相关的神经活动的偏侧性。
既往研究报道，局部场电位（LFP）和皮层脑电图（ECoG）中的低频γ活动由锥体细胞的突触输入产生。因此，高频γ活动反映更接近神经元输出的信号成分，而低频γ活动则反映更接近输入的信号成分39。在本研究中，我们观察到暴露于叫声刺激后，β频段和低γ频段出现瞬时活动。这些反应可能反映了传入大脑皮层的感觉输入信号。本方法的优势在于能够以高时间分辨率捕捉来自不同神经元群体的脑活动动态变化。据我们所知，这是首次揭示狨猴在感知物种特异性发声过程中头皮脑电图（EEG）信号变化的研究。本研究结果通过记录广泛脑区的活动，为神经表征的整合机制提供了新的见解。
<img alt="灵长类动物脑电图记录装置；用于发声分析的示意图、音频波形图和频谱图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66869/66869fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：实验装置。（A）记录过程中受试动物的示例图像。狨猴被固定在椅子上，头部通过面罩固定于椅子。嘴巴保持张开，以利于呼吸和摄取奖励性液体，电极连接于头顶。（B）设备：声音刺激通过扬声器呈现，同时安装了放大器、电极输入盒和监控摄像头。（C）电极位置：根据国际10-20系统，电极置于Fz、Cz、Pz、Oz、A1和A2位置。我们使用枕外隆突、鼻根以及双侧耳前点作为解剖学标志来确定电极位置。C3或C4电极用作接地电极。（D）所有音频刺激的声图（左图）和频谱图（右图）。Phee叫声是一种持续时间少于2秒的单一长叫声。Tsik-Ek叫声由一个Tsik叫声后接一个Ek叫声组成，两部分复合叫声的呈现间隔约为1秒。Tsik-string叫声是重复的Tsik5叫声，在刺激中约1秒内呈现了四个Tsik叫声。作为非叫声刺激，我们使用了一个自定义脚本生成的持续约1秒的白噪声信号。声音起始潜伏期通过数字音频编辑器进行目视检查。红色箭头指示各潜伏期：Phee叫声为49 ms，Tsik-Ek叫声为35 ms，Tsik-string叫声为16 ms，白噪声为0 ms。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66869/66869fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示phee叫声和Tsik-Ek叫声反应的脑电图电位图；脑电波数据分析示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66869/66869fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：对事件相关电位的总平均 Phee, Tsik-Ek, 和 Tsik-string 叫声与噪声 （n = 9）活动与每次叫声或白噪声的起始时间对齐。黑色水平箭头表示刺激呈现的时间段。 费 持续时间约为2秒，休息时间为1秒。Cz处的红色水平线表示听觉刺激之间存在显著差异的时间段。这些差异均出现在 噪声 以及其他叫声，且这些叫声之间没有差异。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66869/66869fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="比较 Fz 和 Cz 通道对 Tsik-strings 呼叫的听觉反应的频谱图示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66869/66869fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：叫声的时间-频率图谱示例。（A）受试者 R（145 月龄）对 Tsik-string 呼叫 的 ERSP 图谱；（B）受试者 Y（23 月龄）对相同 Tsik-string 呼叫 的 EPSP 图谱。左右图板分别显示来自 Fz 和 Cz 电极记录的数据。红色垂直线表示听觉文件开始的时间，而非叫声开始的时间。缩写：EPSP = 事件相关谱扰动。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66869/66869fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="瞬态和持续性听觉反应图；ERSP（dB）与年龄的关系；Fz、Cz通道，数据点" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66869/66869fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：受试者平均事件相关功率与年龄之间的关系。（A）α波段和β波段的平均事件相关功率与受试者年龄之间的关系。平均ERSP功率计算自每个刺激开始后1-150 ms时间段内8-29 Hz的信号，并与基线期（刺激开始前-200至0 ms）进行比较。左图和右图分别显示来自Fz和Cz电极记录的数据。（B）γ波段的平均事件相关功率与受试者年龄之间的关系。平均ERSP功率计算自每个刺激开始后151-950 ms时间段内30-100 Hz的信号，并与基线期（刺激开始前-200至0 ms）进行比较。因此，负的ERSP值表示与刺激呈现前相比功率降低。缩写：ERSP = 事件相关谱扰动。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66869/66869fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件 1：包含实验中使用的四个音频文件的压缩包。 PH.wav 文件包含一个长的 Phee 叫声刺激；TE.wav 包含两个间隔出现的 Tsik-Ek 叫声；MB.wav 包含一个由四个连续 Tsik 组成的 Tsik-串鸣 叫声刺激（也称为警戒鸣叫）；NO.wav 包含程序生成的白高斯噪声。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66869/66869_audiofilesv2.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：包含后处理代码的压缩文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66869/post-processing.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

为了研究语言的演化，将人类与非人灵长类动物的大脑机制进行比较具有重要意义。我们开发了一种非侵入性测量清醒动物脑电图（EEG）的方法。该方法使我们能够在不伤害动物的前提下，长期直接比较人类与动物之间的脑电图数据。

声音交流在灵长类动物的社会互动中起着至关重要的作用，特别是在生存和社会组织方面。人类已经发展出一种……

我们希望了解丰富的语音交流行为在小型灵长类动物大脑中如何表征语音信息。未来，我们还希望阐明精神分裂症等精神疾病如何改变这种表征方式。我们对四种灵长类动物进行了非侵入性脑电图（EEG）比较，发现人类听觉皮层对声音的反应潜伏期比其他灵长类动物更长。这将对复杂声音（如叫声和语音）的感知产生重大影响。目前很少有实验方法能够直接比较从人类和动物获得的大脑活动。我们希望通过非侵入性测量方法，直接比较人类与动物的大脑活动，或直接比较不同动物物种之间的数据，以量化人类语言进化的过程。我们希望通过本方案解决这一挑战。

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清醒狨猴的脑电图测量:聆听同种发声 

我们介绍了用于构建电极的方法，可在清醒小鼠中同时记录细胞外神经活动，并在记录位点附近释放多种神经活性物质。该技术能够对目标神经元的潜在局部突触输入进行详细分析。...

清醒小鼠神经元活动的细胞外记录与神经活性物质的微电泳给药相结合

我们开发了一种用于普通狨猴的全皮层脑皮层电图阵列，该阵列连续覆盖了从枕极到颞极和额极的皮层几乎整个外侧表面。本方案描述了将该阵列慢性植入狨猴脑硬膜外腔的操作步骤。...

全皮层脑皮层电图阵列在普通狨猴中的慢性植入

脑干诱发电位测听是临床神经生理学中的重要工具。如今，脑干诱发电位测听也广泛应用于基础科学研究和涉及药理学及遗传学动物模型的临床前研究中。本文详细描述了如何在小鼠中成功记录和分析听觉脑干反应。...

小鼠脑干诱发电位听觉测试中的数据采集与分析

本研究提供了一种立体定向神经外科植入手术的操作方案 在普通狨猴中使用微电极阵列。该方法可专门用于自由活动动物的电生理记录，但也可轻松适用于该物种的其他类似神经外科干预操作（例如，用于给药的套管或用于脑刺激的电极）。...

用于在普通狨猴（Callithrix jacchus）中植入微电极阵列的立体定位手术

本文介绍了一种在动物培养箱中人工饲养婴猴的方法。该方法显著提高了婴猴的存活率，为研究具有相似遗传背景但在不同产后环境中饲养的婴猴的发育过程提供了可能。...

婴猴手养方法

定制的微型驱动装置可实现使用线性硅阵列对皮层记录位点进行亚毫米级精确定位。...

普通狨猴皮层分层活动的电生理学

在动物研究中，药物自我给药和超声波发声（USV）常被用作行为评估手段，但很少联合使用。本文旨在阐述在药物自我给药过程中记录超声波发声的优势，以评估个体对药物体验的情感反应。...

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高密度阵列脑电图正越来越多地被用于研究婴儿和成人的社会认知功能。本文介绍了一种已建立的方法学，该方法相较于传统的婴儿和成人脑电图研究方法具有显著改进。...

使用高密度阵列脑电图（dEEG）研究婴儿与成人的社会认知能力

嗓音障碍在衰老和帕金森病中具有显著致残性。大鼠的超声发声也受这些状况影响，可用于研究此类嗓音障碍、其神经基础，以及行为干预下功能恢复的性质。...

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由于婴儿无法用语言描述其感受，对婴儿疼痛的评估和治疗十分困难。在本视频中，我们介绍可用于定量测量婴儿神经系统对有害刺激反应的电生理学方法及分析技术。...

人类婴儿伤害性感受的电生理测量与分析

了解清醒狨猴脑电图测量技术，用于研究非人灵长类动物对同种发声的神经反应机制。该方法通过无创方式记录脑电活动，为跨物种比较听觉皮层反应潜伏期及探索人类语言进化提供了重要的实验框架。

清醒狨猴聆听同种声音时的脑电图测量

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