Name: 利用微流控电喷雾技术制备具有不同金属离子的交联海藻酸钠微球 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 了解利用微流控电喷雾技术制备锌铜离子交联海藻酸钠微球的方法，用于药物递送和抗菌治疗。该方法可实现可控缓释，具有良好的生物相容性和规模化生产潜力。

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本工作由浙江树人大学科研项目（2023R053 和 2023KJ237）资助。

实验所用血液取自体重为20-25 g、约7周龄的SPF级雌性BALB/c小鼠。所有动物护理和实验程序均经浙江树人学院动物实验伦理委员会批准。
1. 溶液配制
<ol>
	<li>称取海藻酸钠（ALG），加入超纯水中，在50 °C水浴中搅拌溶解，配制成2%的ALG溶液。</li>
	<li>分别用超纯水配制质量分数为5%（或摩尔浓度为0.3 M）的CaCl2、FeCl3、ZnSO4和CuSO4溶液。将每种溶液分别倒入收集皿中。</li>
</ol>
2. 微流控电喷雾装置
<ol>
	<li>取一根玻璃毛细管，将其置于本生灯火焰上加热软化，然后拉伸至不同直径（50 µm–500 µm）。使用玻璃切割器切下细端，并用高质量碳化硅砂纸轻轻打磨尖端开口。清洗后，将毛细管较粗的一端连接至一段长导管，导管另一端连接分配针头和一个5 mL注射器（补充图1）。 
	注意：玻璃管切割处的锐边难以插入软管；因此，应将切口在火焰边缘加热使其边缘圆滑。</li>
	<li>将注射器固定在微流控注射泵上，并将毛细管一端固定于夹持器中。将高压电源的红色高压输出夹连接至注射器的分配针头，并将银色夹子置于收集液中。此装置构成一个简单的微流控电喷雾装置（图1A）。 
	注意：应使毛细管垂直于实验台放置。</li>
</ol>
3. ALG 微球的制备
<ol>
	<li>将含有不同金属离子的独立收集皿直接置于毛细管下方。打开微流控注射泵，选择快速前进以用海藻酸钠（ALG）预润管路，然后设定合适的流速（2 mL/h）。</li>
	<li>打开高压电源开关，旋转旋钮调节至合适的电压（5–7 kV）。</li>
	<li>向每个90 mm的培养皿中加入20 mL溶液，用于收集海藻酸钠微球，从而形成与不同金属离子交联的ALGMS（图1B）。</li>
	<li>在电场和重力作用下，海藻酸钠在不同离子收集溶液中数秒内形成微球。用无菌移液器吸取微球，转移至各自的1.5 mL离心管中，得到Zn2+、Ca2+、Cu2+和Fe3+交联的海藻酸钠水凝胶微球（图1C）。标记Zn-ALGMS、Ca-ALGMS、Cu-ALGMS和Fe-ALGMS离心管。 
	注意：通过调节电压、针尖直径、流速和溶液浓度等参数，可获得不同直径的微球。</li>
	<li>取少量制备好的微球，尽可能均匀地分散于PBS中，置于显微镜下观察成像。</li>
	<li>在同一组微球中随机选取10个观察视野，将待测图像导入ImageJ软件，将图像转换为适当的灰度模式，利用阈值分割技术准确定义目标颗粒的区域，并启动颗粒分析功能，使ImageJ能够识别并测量目标颗粒。获取微球数据后，将数据导入Origin软件进行分析和粒径分布绘图。</li>
</ol>
4. 抗微生物性能测试
<ol>
	<li>使用液体LB（Luria-Bertani）培养基，制备初始细菌浊度为0.2 mcF的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）各5 mL的菌悬液。</li>
	<li>将每种细菌溶液各10 mL分别加入4个独立的15 mL无菌离心管中。然后，向每个离心管中分别加入0.5 mL的Zn-ALGMS、Ca-ALGMS、Cu-ALGMS和Fe-ALGMS ALG，置于37 °C、200 rpm的恒温摇床中振荡培养12小时。对照组加入等量生理盐水。</li>
	<li>用无菌水将每种细菌溶液稀释105倍。取200 µL菌液，用无菌玻璃涂布棒均匀涂布于LB固体培养基表面。</li>
	<li>迅速而均匀地将菌液涂布于平板表面，避免在同一区域来回涂布。随后将平板置于37 °C培养箱中培养12小时，观察各组菌落生长情况。 
	注意：所有无菌操作均应在酒精灯附近进行。微生物培养容器、接种工具及培养基均需灭菌处理。</li>
</ol>
5. 药物释放测试
<ol>
	<li>为评估不同微球的药物释放能力，采用牛血清白蛋白（BSA）作为负载的模型药物。将每种微球（Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS 和 Fe-ALGMS）各 500 µL 加入 1 mg/mL 的 BSA 悬液中，孵育 24 小时。</li>
	<li>进行药物释放实验时，将每种饱和样品加入 5.0 M 磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4）中，在 37 °C 下以 80 rpm 持续振荡 15 分钟。</li>
	<li>在 1、3、6、12、24、36 和 48 小时时间点，取 100 µL 溶液，并更换等体积的新鲜缓冲液。</li>
	<li>按照试剂盒说明书，使用 BCA 试剂盒在特定时间点测定上清液中的蛋白质浓度。通过酶标仪定量检测释放的药物，获得相应的吸光度值，并根据标准曲线将测定值转换为实际药物浓度。使用以下公式计算药物释放率： 
	药物释放百分比 = （特定时间点释放的药物浓度 / 初始药物浓度）× 100%</li>
	<li>在规定时间间隔，从每个孔中移除等体积的 PBS，并补充等体积的新鲜培养基。</li>
</ol>
6. 溶血试验
<ol>
	<li>将制备好的Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS和Fe-ALGMS置于PBS中，于37 °C孵育24小时，制备孵育溶液。</li>
	<li>通过眼球取血法采集健康 BALB/c 小鼠的全血，收集至含有柠檬酸钠的抗凝管中。充分涡旋混匀后，于 1509 x g 离心 g 15分钟，以获得红细胞。</li>
	<li>用 PBS 洗涤红细胞 2 至 3 次，并用 PBS 配制 10% 的红细胞悬液。</li>
	<li>不同ALGMS的制备：取实验组各500 µL微球，加入1 mL超纯水（ddH₂O）2O）作为阳性对照组，1 mL PBS 溶液作为阴性对照组，每组分别与 20 µL 血细胞溶液混合。</li>
	<li>在37 °C下孵育样品4小时，然后以1509 x g离心 g，15 分钟。将上清液保留备用，并在溶血后拍摄各组红细胞的照片。</li>
	<li>以阳性对照组溶血率为100%，阴性对照组溶血率为0%，测定各组上清液的吸光度值，并按以下公式计算溶血率： 
	溶血率 (%) =（各组上清液的吸光度值 - 
	（蒸馏水单独的吸光度值）/（阳性对照组吸光度值－蒸馏水单独的吸光度值）× 100</li>
</ol>
7. 细胞生物相容性测试
<ol>
	<li>用 PBS 将不同的 ALGMS 清洗 2 次，置于 5 mL 培养皿中静置 15 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将不同的 ALGMS 分别加入含有 10% FBS 的完全培养基（DMEM）中，每份 0.2 mL，于 37 °C 培养 24 小时，过滤溶液以获得浸提液。</li>
	<li>在 24 孔板中将 NIH3T3 细胞培养至约 70% 的细胞密度，用微球浸提液处理 NIH3T3 细胞，再继续用完全培养基培养 24 小时。</li>
	<li>移除细胞培养基，并用 PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>使用 Calcein-AM/PI 检测法评估细胞活力。取 2.5 µL Calcein-AM 溶液（4 mM）和 12.5 µL PI 溶液（2 mM），加入 5 mL 的 1× PBS 中，充分混匀，配制成含 2 µM Calcein-AM 和 5 µM PI 的工作液。</li>
	<li>将工作液以每孔 500 µL 加入已接种细胞的培养板中，于 37 °C 避光孵育 15 分钟，随后在倒置荧光显微镜下观察并拍照。每组设置三个重复。</li>
	<li>根据以下公式计算细胞活力： 
	细胞活力（%）= 活细胞数 /（活细胞数 + 死细胞数）</li>
</ol>

Developing Sodium Alginate Hydrogel Microspheres for Biomedical Use

<ol><li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+recent+advances+of+cellulose-based+intelligent-responsive+hydrogels+as+vehicles+for+controllable+drug+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+BiolMacromol%22%5BJournal%5D)">A review of recent advances of cellulose-based intelligent-responsive hydrogels as vehicles for controllable drug delivery system.</a> Int J BiolMacromol. 264 (2), 130525(2024).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microfluidic+hydrogel+microspheres+for+cell+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct%22%5BJournal%5D)">Injectable microfluidic hydrogel microspheres for cell and drug delivery.</a> Adv Funct. 31 (31), 2103339(2021).</li>
<li>Qiao, S., Chen, W., Zheng, X., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+pH-sensitive+alginate-based+hydrogel+by+microfluidic+technology+for+intestinal+targeting+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Preparation of pH-sensitive alginate-based hydrogel by microfluidic technology for intestinal targeting drug delivery.</a> Int J Biol Macromol. 254 (2), 127649(2024).</li>
<li>Lei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+hydrogel+microspheres+for+protein+capture+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Design%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial hydrogel microspheres for protein capture and wound healing.</a> Mater Design. 215, 110478(2022).</li>
<li>Ju, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zn2%2B+incorporated+composite+polysaccharide+microspheres+for+sustained+growth+factor+release+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Zn2+ incorporated composite polysaccharide microspheres for sustained growth factor release and wound healing.</a> Mater Today Bio. 22, 100739(2023).</li>
<li>El-Sayed, N. S., Hashem, A. H., Khattab, T. A., Kamel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antibacterial+hydrogels+based+on+sodium+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">New antibacterial hydrogels based on sodium alginate.</a> Int. J Biol Macromol. 248, 125872(2023).</li>
<li>Olukman Şahin, M., Şanlı, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+5-fluorouracil+release+properties+investigation+from+pH+sensitive+sodium+alginate+coated+and+uncoated+methyl+cellulose%2Fchitosan+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">In vitro 5-fluorouracil release properties investigation from pH sensitive sodium alginate coated and uncoated methyl cellulose/chitosan microspheres.</a> Int J Biol Macromol. 258 (1), 128895(2024).</li>
<li>Chi, H., Qiu, Y., Ye, X., Shi, J., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+strategy+of+hydrogel+microsphere+and+its+application+in+skin+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Preparation strategy of hydrogel microsphere and its application in skin repair.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1239183(2023).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+dual-adhesive+particles+from+microfluidic+electrospray+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Res%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired dual-adhesive particles from microfluidic electrospray for bone regeneration.</a> Nano Res. 16 (4), 5292-5299 (2022).</li>
<li>Zheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol-encapsulated+microspheres+prepared+by+microfluidic+electrospray+for+alleviating+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Adv%22%5BJournal%5D)">Celastrol-encapsulated microspheres prepared by microfluidic electrospray for alleviating inflammatory pain.</a> Biomater Adv. 149, 213398(2023).</li>
<li>Yang, L., Yang, W., Xu, W., Zhao, Y., Shang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+Janus+microcarriers+with+sequential+actives+release+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eng+J%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired Janus microcarriers with sequential actives release for bone regeneration.</a> Chem Eng J. 476, 146797(2023).</li>
<li>Yang, L., Sun, L., Zhang, H., Bian, F., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-inspired+lubricated+drug+delivery+particles+from+microfluidic+electrospray+for+osteoarthritis+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Ice-inspired lubricated drug delivery particles from microfluidic electrospray for osteoarthritis treatment.</a> ACS Nano. 15 (12), 20600-20606 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-flexible+stretchable+liquid+metal+circuits+with+antimicrobial+properties+through+selective+laser+activation+for+health+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eng+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-flexible stretchable liquid metal circuits with antimicrobial properties through selective laser activation for health monitoring.</a> Chem Eng J. 482, 149173(2024).</li>
<li>Sukhodub, L., Kumeda, M., Sukhodub, L., Bielai, V., Lyndin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+ions+doping+effect+on+the+physicochemical%2C+antimicrobial%2C+and+wound+healing+profiles+of+alginate-based+composite%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Metal ions doping effect on the physicochemical, antimicrobial, and wound healing profiles of alginate-based composite.</a> Carbohydr Polym. 304, 120486(2023).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nat Rev Mater. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Bertsch, P., Diba, M., Mooney, D. J., Leeuwenburgh, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+injectable+hydrogels+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration.</a> Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomass+microcapsules+with+stem+cell+encapsulation+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomicro+Lett%22%5BJournal%5D)">Biomass microcapsules with stem cell encapsulation for bone repair.</a> Nanomicro Lett. 14 (1), 4(2021).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK-Cell-Encapsulated+porous+microspheres+via+microfluidic+electrospray+for+tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater%22%5BJournal%5D)">NK-Cell-Encapsulated porous microspheres via microfluidic electrospray for tumor immunotherapy.</a> ACS Appl Mater. 11 (37), 33716-33724 (2019).</li>
<li>Nan, L., Zhang, H., Weitz, D. A., Shum, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+future+of+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22LOC%22%5BJournal%5D)">Development and future of droplet microfluidics.</a> LOC. 24 (5), 1135-1153 (2024).</li>
</ol>

无任何利益冲突需要披露。

在本实验方案中，我们介绍了一种基于微流控电喷雾技术制备海藻酸盐微球（ALGMS）的方法。该方法操作简便，可制备出大量形态均匀、圆整度高且直径可控的微球。该技术为研究人员提供了便利，有助于推动水凝胶微球的研究与应用。此外，通过与不同金属离子交联，提高了ALGMS的稳定性和生物活性。在抗菌实验中，Cu-ALGMS和Zn-ALGMS均表现出显著的抑菌效果。
水凝胶微球是一类具有优异可塑性的柔性微结构，通过特定的材料选择和结构设计可实现有效的药物递送。海藻酸盐是一种在温和条件下即可发生凝胶化的天然多糖，具有良好的生物相容性、可生物降解性且无毒。微米级海藻酸钠微球已广泛应用于生物化学与生物医学领域，包括药物研究、药物递送及组织工程。在药物递送应用中，海藻酸钠微球的一个关键优势在于其能够实现药物的持续释放，从而在较长时间内维持活性药物成分的高浓度14。我们的持续释药实验表明，具有不同离子交联方式的海藻酸钠微球（ALGMS）均具备持续释药能力，可用于药物递送应用。
水凝胶微球的常见制备方法包括批量乳化法、机械粉碎法、光刻法、微流控乳化法和电喷法8,15。批量乳化法和机械破碎法的优点在于制备方法简单且产出效率高，但难以控制单个水凝胶微球的形态。光刻法通过将光聚焦于掩模版或模具上引发交联固化，从而形成水凝胶微球，但该方法的生产效率易受掩模版、光源和模具的影响。此外，微流控乳化法能够更好地控制水凝胶微球的成型过程，并可制备出具有特定形状的微球，但其生产效率较低16。与上述方法相比，微流控电喷法可制备出粒径均匀、形态规则且粒径可调的水凝胶微球17。本方案中的关键步骤是微球的制备，微球的尺寸和形态可能因玻璃管的平整度、电压值以及流速的不同而发生变化18。然而，采用微流控电喷技术制备微球仍存在一些局限性，例如微通道易堵塞、产量有限、材料兼容性受限、工艺放大困难，以及过程控制与监测难度较大，这在一定程度上限制了其广泛应用19。
综上所述，微流控电喷雾技术是一种成熟的微球制备方法，具有一 步合成的优势。通过优化流道尺寸参数并控制材料浓度和流速，可轻松获得各种形貌和尺寸的微球。值得注意的是，该过程仅涉及水相，无需额外添加表面活性剂，因此环境友好且操作简便，避免了复杂的洗涤步骤。该方法为利用类似于海藻酸盐凝胶化过程的水凝胶材料制备微球提供了一种策略。

药物递送系统是生物组织工程领域的一个研究热点，旨在提高药物递送的效率和疗效，同时减少不良反应和副作用1。在众多递送系统中，水凝胶微球因其良好的生物相容性、可调控的机械性能以及功能可塑性，成为最常用的药物负载与递送载体之一2。水凝胶微球可用于药物的缓释和控释，对药物具有良好的保护作用，能够避免或最小化药物在其他组织中的非特异性效应，并实现向特定组织结构的靶向递送3。因此，水凝胶微球已成为一种新型高效的药物递送系统，相关研究正逐步兴起4。
水凝胶微球通常由可生物降解的材料合成，包括多糖、蛋白质和天然聚合物5。其中，海藻酸钠（ALG）是一种从海洋褐藻中提取的生物相容性好、可生物降解的多糖6。其分子链上含有游离的羟基和羧基，可与大多数二价或多价阳离子交联，形成具有三维网络结构的不溶于水的水凝胶5。ALG形成的水凝胶微球在中性和碱性溶液中可转变为带负电荷的聚电解质。负电荷之间的排斥作用导致微球溶胀，从而释放出包封的活性成分或药物。这些特性使得ALG微球被视为有前景的药物载体，广泛应用于药物负载与可控释放7。
制备水凝胶微球的方法有多种。传统的海藻酸盐微球（ALGMS）制备方法通常包括溶胶-凝胶法或乳液-溶胶法。这些方法通过沉淀、共沉淀以及凝胶化反应等步骤，获得目标微球8。近年来，随着微流控技术的不断发展，微流控电喷雾法逐渐成为一种高效且精确的微球制备方法9。该方法利用微流控技术将聚合物溶液通过微细喷嘴进行电喷雾，在后续的固化或交联过程中形成微米级液滴和微球10。与传统方法相比，微流控电喷雾可通过调节溶液流速、电压和喷嘴尺寸等参数，精确控制微球的粒径和形貌11。同时，该方法可实现微球的高速连续制备，提高制备效率，并保持温和的反应条件。此外，ALGMS还可被设计为具有多种功能，例如负载控释药物或催化剂，从而便于其在多个领域的应用。
本文介绍了一种利用微流控电喷雾法制备海藻酸盐（ALG）微球的实验方案。该过程包括将ALG溶液通过微流控装置并施加电喷雾，生成的液滴被收集于含有不同金属离子（Ca2+、Cu2+、Zn2+和Fe3+）的溶液中，以引发交联反应。该反应可提高微球的稳定性和黏附性，并赋予其不同的功能特性。该方法操作简便，所合成的微球在形态上表现出良好的粒径均一性。此外，我们还研究了其抗菌性能、缓释药物能力以及生物相容性。本方案将有助于后续的药物开发与生产。

<table><tbody><tr><td>120目筛网</td><td>Solarbio,中国</td><td>YA0946</td><td></td></tr><tr><td>酒精灯</td><td>Solarbio,中国</td><td>YA2320</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c小鼠</td><td>吴康生物科技,中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双辛可宁酸检测试剂</td><td>迈伦生物,中国</td><td>MA0082</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>乐邦,中国</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&amp;nbsp;粉末</td><td>阿拉丁,中国</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM/PI</td><td>百奥锐,中国</td><td>BL130A</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>康宁,美国</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&amp;nbsp;粉末</td><td>金鑫越化工,中国</td><td>7758-99-8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>吉百利,中国</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&amp;nbsp;粉末</td><td>阿拉丁,中国</td><td>7705-08-0</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>哈卡塔,中国</td><td>HN-FBS</td><td></td></tr><tr><td>玻璃试管</td><td>赛多利斯,德国</td><td>CC0028</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Evidentscientific,日本</td><td>BX53(LED)</td><td></td></tr><tr><td>微流控注射泵</td><td>龙泵,英国</td><td>LSP01-3A</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3</td><td>海吉科,中国</td><td>TCM-C752</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>赛默飞,美国</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>赛默飞,美国</td><td>3002</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>赛默飞,美国</td><td>Axia ChemiSEM</td><td></td></tr><tr><td>海藻酸钠粉末&amp;nbsp;</td><td>北化百灵,中国</td><td>Y13095</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4粉末</td><td>金鑫越化工,中国</td><td>7733-02-0</td><td></td></tr></tbody></table>

利用微流控电喷雾技术制备含不同金属离子的交联海藻酸钠微球

Preparation of Cross-Linked Sodium Alginate Microspheres with Different Metal Ions Using the Microfluidic Electrospray Technology

微球是微米级颗粒，可通过物理包埋或在聚合物表面及内部吸附的方式负载药物，并实现药物的缓慢释放。在生物医学领域，由于水凝胶微球能够减少给药频率、降低副作用并提高患者的依从性，其作为药物载体的应用已得到广泛研究。海藻酸钠（ALG）是一种天然线性多糖，具有三种主链糖苷键结构。该聚合物的每个单元上均含有两个辅助羟基，具备醇羟基的化学特性。合成的ALG单元可与金属离子发生化学交联反应，形成聚合物堆叠的交联网络结构，最终生成水凝胶。利用ALG的离子交联特性，可通过简单工艺制备水凝胶微球。本研究采用微流控电沉积策略制备了基于ALG的水凝胶微球（ALGMS）。由于对微流控电喷雾流的精确控制，所制备的水凝胶微球尺寸均匀、分散性良好。通过结合微流控技术与高电场的微流控电喷雾方法，制备了由不同金属离子交联的ALGMS，并对其抗菌性能、缓释药物能力及生物相容性进行了研究。该技术在先进药物研发与生产中具有良好的应用前景。

不同金属离子交联的ALGMS的表征 
Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS和Fe-ALGMS的光学形貌如图2所示，表现出良好的球形度、光滑的表面、均匀的粒径分布（补充图2）以及优异的单分散性。我们进一步采用扫描电子显微镜（SEM）和能谱分析（EDS）进行微观表征。如图3所示，微球整体呈球形，具有明确的圆整度。Zn-ALGMS的表面分布不均，显得更粗糙，并伴有大量褶皱。我们通过能谱分析测定凝胶中参与交联反应的金属离子含量分布。值得注意的是，通过调节收集距离、凝胶浓度和电场电压等参数，可调控微球的尺寸12。在本方案中，通过调整微流控装置的参数和液体浓度，可根据具体需求轻松获得不同尺寸的微粒。
抗菌性能的评估 
我们采用平板法评估了不同微球的抗菌能力，如图4所示。不同微球对E. coli和S. aureus均表现出抗菌活性，其中Cu-ALGMS和Zn-ALGMS显示出最强的抗菌性能。这种增强的效果可归因于金属（特别是铜（Cu）和锌（Zn））本身的抗菌活性13。Sukhodub等人证明，Fe3+、Zn2+、Ca2+和Cu2+与壳聚糖具有协同抗菌作用，而不含壳聚糖的样品则未表现出此类活性，从而验证了所形成复合物的协同抗菌效应14。本研究结果与此一致，Cu-ALGMS和Zn-ALGMS在治疗细菌感染性疾病方面优于其他水凝胶微球。
药物释放特性的评估 
以牛血清白蛋白（BSA）为模型药物，评估不同金属基海藻酸盐水凝胶微球的药物释放情况，结果显示其释放曲线存在差异（补充图3）。离子型材料相较于其他材料表现出更优的缓释能力。Fe2+的药物释放速率相对较快，而Ca2+和Zn2+的药物释放速率则相对较慢。这些结果突显了不同离子对药物释放影响的差异性。我们推测，Fe2+可能以某种方式与药物发生相互作用或结合，从而更易于释放；而Ca2+和Zn2+则可能与药物结合更为紧密，或存在其他限制释放速率的因素。水凝胶微球的这种持续药物释放行为可能与金属离子和海藻酸盐多糖之间的交联强度有关。此外，不同金属对BSA吸附能力的差异也可能导致了药物缓释性能的差异。
生物相容性评估 
良好的生物相容性是药物递送载体在临床应用中的先决条件。因此，我们采用微球对血液相容性进行了评价 体外 溶血试验。我们使用纯水作为阳性对照，PBS溶液作为阴性对照。实验结果如图所示 补充图4，结果显示悬浮液中的红细胞在接触不同微球后仍保持完整，表明微球引起的溶血程度极低。细胞生物相容性结果表明，微球对细胞活性无明显影响补充图5这些结果表明，微球具有良好的血细胞相容性。
<img alt="液-液相分离装置；毛细管滴落实验，溶剂混合结果分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：海藻酸盐水凝胶微球的制备。（A）微流控电喷雾技术的安装示意图。（B）微流控电喷雾过程的实时图像。（C）制备完成的含 Ca2+、Cu2+、Zn2+ 和 Fe3+ 的海藻酸盐水凝胶微球。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="Zn、Ca、Cu、Fe-ALGMS的显微图像；微胶囊结构；材料科学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：海藻酸盐水凝胶微球的显微图像。 在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中 Ca-ALGMS (A)、Cu-ALGMS (B)、Zn-ALGMS (C) 和 Fe-ALGMS (D) 的显微图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微球的SEM-EDS分析；元素分布图；Zn、Ca、Cu、Fe分布图；研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：扫描电子显微镜与能量色散X射线光谱分析。 图像展示了（A）Ca-ALGMS、（B）Cu-ALGMS、（C）Zn-ALGMS 和（D）Fe-ALGMS 的表征结果，其中 i 和 ii 为扫描电镜数据，iii–v 为光谱数据。图像 iii–v 显示了EDS元素分布图，EDS通过选择样品表面某一区域进行扫描，以获取整个区域的元素分布信息。该图谱扫描模式常用于材料的成分分析、相区分析以及粒径分布研究，其中每种元素以不同颜色表示，如图所示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌生长抑制实验；大肠杆菌和金黄色葡萄球菌处理的培养皿及图表结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66871/66871fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4. 微球的抗菌性能。（A） 各组的抗菌性能通过细菌涂布法进行检测。（B, C） 各组细菌涂布平板计数结果的定量分析。对照组样品显示在未添加任何物质的LB培养基上生长的菌落。其他组细菌的相对菌落数以对照组的克隆数为100%作为基准进行计算。误差线：标准差，n = 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/66871fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：通过一根长橡胶管将玻璃管连接至注射器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：颗粒大小。 (A) Zn-ALGMS，(B) Ca-ALGMS，(C) Cu-ALGMS，（D铁-ALGMS。所有样品均使用5%的摩尔浓度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充图3：药物释放。 Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS 和 Fe-ALGMS 在 PBS（pH 7.4）中的药物释放曲线。误差棒：标准偏差，n = 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%203_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图4：Ca-ALGMS、Cu-ALGMS、Zn-ALGMS和Fe-ALGMS的溶血实验。PC（阳性对照）：ddH2O；NC（阴性对照）：PBS。误差线表示标准差，n = 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%204_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图5：不同离子交联的微球的细胞毒性。 对Zn-ALGMS、Ca-ALGMS、Cu-ALGMS和Fe-ALGMS的生物相容性进行了评估。采用Calcein-AM/PI染色法进行检测，本结果中随机选取了5个视野。使用ImageJ分析死细胞（红色）与活细胞的比例，以获得相对细胞活力。1. PC，阳性对照；2. NC，阴性对照；3. Zn-ALGMS；4. Ca-ALGMS；5. Cu-ALGMS；6. Fe-ALGMS。误差线：标准差，n = 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66871/Supplementary%20figure%205_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了利用微流控装置制备由不同金属离子交联的海藻酸钠微球，用于药物载体设计。同时研究了这些微球的抗菌性能和缓释药物特性。

微球是微米级颗粒，可通过物理包封或表面及内部吸附的方式负载药物，并实现缓慢释放。

氢微球具有良好的相容性、设计灵活性和高度可定制性，在治疗性药物递送和组织工程修复构建等生物医学领域具有广泛的应用前景。在本研究中，我们采用一种简单的微流控装置制备了氢微球。近期，我们尝试使用载有某些中药小分子的氢微球来促进整体愈合。在本研究中，我们发现锌离子和铜离子交联的海藻酸钠微球具有良好的抗菌性能，因此铜交联海藻酸钠微球（copper ALGMS）和锌交联海藻酸钠微球（zinc ALGMS）适用于细菌感染性疾病的治疗。首先，在50摄氏度的水浴中将海藻酸钠（ALG）与超纯水混合。分别用超纯水配制5%的氯化钙、氯化铁、硫酸锌和硫酸铜质量分数溶液。将每种溶液分别倒入收集皿中。将玻璃毛细管置于喷灯火焰上加热软化，并拉制成不同直径的毛细管。使用玻璃切割器切去毛细管的细小部分，并用碳化硅砂纸轻轻打磨尖端开口。将毛细管的粗端连接到一段长导管，另一端连接至分液针头和一个5毫升注射器。将注射器固定在微流控注射泵上，并将毛细管的一端固定在夹持器中。将高压电源的红色高压端夹子连接到注射器的喷液针上，并将银夹子置于收集液中。此配置构成一个简单的微流控电喷雾装置。将含有不同金属离子的收集皿直接放置在毛细管下方。打开微流控注射泵，选择快速前进模式，用海藻酸钠（ALG）溶液预润管路，并将流速设定为每小时2毫升。打开高压电源开关，调节旋钮将电压设置为5至7千伏。收集由不同金属离子交联的海藻酸钠（ALG）微球。海藻酸钠水凝胶微球形成后，将其转移至已标记的1.5毫升离心管中。海藻酸钠微球的显微图像显示其具有良好的球形度、光滑的表面以及均匀的粒径分布。扫描电子显微镜结果显示，微球整体呈球形，圆整度良好。首先，制备锌、钙、铜和铁藻酸盐水凝胶微球。进行抗菌性能测试时，将两种细菌溶液各10毫升加入15毫升无菌离心管中。然后在恒温摇床中用0.5毫升水凝胶微球与菌液共同孵育。用无菌水将每种细菌溶液稀释十的五次方倍。使用无菌玻璃珠，将200 µL细菌溶液均匀涂布于LB固体培养基上。将培养皿置于37°C培养箱中培养12小时，以观察菌落形成情况。向每500微升微球中加入1毫克/毫升的牛血清白蛋白（BSA）悬浮液，并孵育24小时。将每份饱和样品加入1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，在37摄氏度下振荡15分钟，持续以每分钟80转的速度摇动。分装后，在1、3、6、12、24、36和48小时用新鲜培养基替换原有培养基。在特定时间点定量上清液中的蛋白质浓度。将制备好的ALG微球加入PBS中，在37摄氏度下孵育24小时。使用含柠檬酸钠的抗凝管采集健康小鼠的全血。涡旋混匀后，以1,500转/分钟离心15分钟，以获得红细胞。冲洗细胞后，用PBS配制10%红细胞悬液，并向微球实验组和对照组各加入20微升红细胞悬液。将样品在37摄氏度孵育4小时，然后以1,500 RPM离心15分钟。将上清液留置备用后，拍摄各组红细胞溶血后的照片。最后，测定各组上清液的吸光度值，并利用公式计算溶血率。不同的微球对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表现出抗菌活性，其中铜和锌掺杂的海藻酸盐微球展现出最强的抗菌性能。药物释放实验表明，铁微球的释放速率相对较快，高于其他三种离子。生物相容性评估显示，悬浮液中的红细胞在接触不同微球后仍保持完整，表明微球引起的溶血作用极小。

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科研

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Bioengineering

生物工程

利用微流控电喷雾技术制备具有不同金属离子的交联海藻酸钠微球

在以下章节中，我们概述了用于生物医学应用的海藻酸盐微球的制备方法。我们重点介绍一种用于制备多层海藻酸盐微球的技术，该技术可同时包封细胞和蛋白质，有望用于治疗1型糖尿病。...

用于生物医学应用的海藻酸盐微球的制备

本方案结合静电纺丝与微球技术，构建可引导神经元生长的组织工程支架。将神经生长因子包裹于PLGA微球中，并将其静电纺丝至透明质酸（HA）纤维支架内。通过在支架上接种原代鸡背根神经节并培养4-6天，检测蛋白质的生物活性。...

电纺将生长因子释放微球融入纤维支架

本文介绍了一种用于包封消耗脂肪以产生热量的分解代谢细胞的实验方案，这些细胞存在于腹腔内脂肪组织中，并可在肥胖小鼠中增加能量消耗。...

包封产热型前脂肪细胞并移植至脂肪组织库

我们建立了一种利用同轴喷嘴将多能干细胞（PS细胞）包封于海藻酸盐水凝胶微胶囊中的方法。该方法可防止细胞过度聚集，并降低悬浮培养过程中细胞所受的剪切应力。该技术适用于多能干细胞的大规模生产以及干细胞微环境的研究。...

使用同轴喷嘴进行多能干细胞的海藻酸盐封装

介绍了用于制备具有微结构凹面孔隙的聚二甲基硅氧烷微球的实验步骤。特别强调了水相中电解质的浓度及其种类的影响。...

微泡法制备凹孔状PDMS微珠

我们提出一种简便的方法，用于制备一种可生物降解、基于明胶且具有磁热响应性的药物释放平台。该平台通过将超顺磁性氧化铁纳米颗粒和聚（N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酰胺）引入由京尼平交联的球形明胶微网络中，并结合交变磁场应用系统而实现。...

响应交变磁场的杂化明胶微凝胶用于可控药物释放

一种由含海藻酸盐微粒的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-接枝-硫酸软骨素（PNIPAAm-g-CS）组成的可注射组织工程支架被制备出来。其黏附强度、溶胀性能及 体外...

用于组织工程的含海藻酸盐微粒的热致凝胶化聚(N-异丙基丙烯酰胺)-接枝-硫酸软骨素复合材料的合成

由肝素和鱼精蛋白制备的自组装聚电解质复合物（PEC）被沉积在海藻酸盐微珠上，用于包埋并调控成骨生长因子的释放。该递送策略可在脊柱融合应用中使BMP-2的剂量减少20倍。本文阐述了PECs的制备方法及其优势。...

用于递送肝素结合域成骨生长因子的聚电解质复合物

本研究描述了一种制备胶束纳米晶体的方法，这类材料是新兴的重要纳米生物材料。该方法结合了自上而下的电喷雾技术、自下而上的自组装过程以及基于溶剂的结构调控。该制备方法具有高度连续性，可生产高质量产物，并具备低成本的结构控制手段。...

结合电喷雾、自组装和基于溶剂的结构调控技术制备球形与蠕虫状胶束纳米晶体

本方案通过海藻酸盐的快速物理凝胶化来包封细胞，从而实现细胞的固定化。所获得的微珠能够随时间可控且持续地分泌β-淀粉样蛋白，可用于研究分泌型β-淀粉样蛋白在体外和体内模型中的作用。...

用于阿尔茨海默病建模的β-淀粉样蛋白分泌海藻酸盐微珠的制备

了解利用微流控电喷雾技术制备锌铜离子交联海藻酸钠微球的方法，用于药物递送和抗菌治疗。该方法可实现可控缓释，具有良好的生物相容性和规模化生产潜力。

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