Name: 体外胚胎植入模型的建立 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: 了解体外胚胎植入模型的建立方法，用于研究生殖生物学中的胚胎-子宫内膜相互作用。该模型揭示高浓度雌激素会降低植入率，而孕激素可剂量依赖性地缓解此效应，为改善试管婴儿成功率提供新策略。

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本研究得到国家自然科学基金（82171603）、上海市卫生健康委员会基金（202140341）、上海市科学技术委员会（23JC1403803）以及国家卫生健康委员会与上海重点实验室创新促进计划、上海生物制品研究所（RC2023-02）的资助。

小鼠操作和实验研究均依照上海生物医药与医药技术研究院动物委员会批准的方案进行。确保安全操作：在处理化学品或生物材料时，务必穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
1. 小鼠胚胎的获取
注意：本部分描述了获取小鼠胚胎的流程。成年雌性小鼠（6–8 周龄，C57BL/6 与 DBA/2 杂交系）在标准环境条件下饲养，光照周期为 12 小时光照/12 小时黑暗，温度 20–25 °C，湿度 40–60%，并自由提供食物和饮水。 随意摄取.
<ol>
	<li>向雌性小鼠腹腔注射 10 IU 孕马血清促性腺激素（PMSG），42–48 小时后，再注射 10 IU 人绒毛膜促性腺激素（HCG）。</li>
	<li>将每只雌性小鼠与年龄相近的雄性小鼠合笼交配，并于次日早晨检查阴道栓。 
	注意：阴道栓是精液在阴道口凝固后形成的淡黄色栓状物。</li>
	<li>通过吸入 CO2 法处死带有阴道栓的雌性小鼠。</li>
	<li>打开腹部并定位雌性生殖器官；用镊子拉伸输卵管、卵巢及脂肪垫；用剪刀剪下输卵管和卵巢；然后，再剪断输卵管与子宫（图 1）。</li>
	<li>将获取的输卵管转移至预先加入 M2 培养基的 35 mm 培养皿中。 
	注意：M2 培养基应提前在培养箱（37 °C，5% CO2）中预热 30 分钟。</li>
	<li>用 25 G 针头刺破膨大的输卵管壶腹部，释放或挤出卵丘-受精卵复合体（图 2）。</li>
	<li>用镊子将卵丘-受精卵复合体转移至含有 0.5 mg/mL 透明质酸酶的 M2 溶液中，孵育数分钟，直至卵丘细胞解离（图 3）。</li>
	<li>用移卵移液器收集受精卵，并在含有 4 mg/mL BSA 的 M2 培养基中洗涤，以去除残留的透明质酸酶、卵丘细胞及其他杂质。</li>
</ol>
2. 体外 小鼠胚胎培养
注意：本节详细说明了以下过程 体外 将小鼠胚胎从受精卵培养至囊胚。KSOM培养液微滴应提前24小时准备好，以确保温度和气体平衡。
<ol>
	<li>在35 mm培养皿底部制备12个微滴，每滴为20 µL的KSOM培养基。用3–5 mL矿物油覆盖微滴（图4），并将培养皿置于37 °C、5% CO2的培养箱中平衡。</li>
	<li>使用转移移液管将小鼠胚胎从M2培养基转移至KSOM培养基中，进行充分洗涤。 
	注意：此步骤需使用配备37 °C加热台的体视显微镜。尽量缩短胚胎在培养箱外的操作时间。</li>
	<li>将洗涤后的胚胎放入已准备好的KSOM微滴中，在37 °C、5% CO2条件下培养4天。 
	注意：为保证充足的营养，每20 µL微滴中培养5–10个胚胎。</li>
	<li>根据囊胚大小（100–130 µm）、内细胞团（由多个紧密聚集的细胞组成）、滋养层细胞数量（由多个相互黏附且紧密排列的细胞组成的滋养外胚层）以及扩张程度（囊胚腔占据胚胎体积的80–100%）选择发育优势良好的囊胚。</li>
</ol>
3. 子宫内膜细胞的制备
<ol>
	<li>在生物安全柜内，使用移液器吸取1 mL的2%明胶，加入12孔细胞培养板中。轻轻旋转培养板，确保明胶完全覆盖孔底。将培养板置于37 °C培养箱中孵育30分钟。随后吸除多余的明胶，并让孔底彻底干燥。</li>
	<li>包被完成后，将人子宫内膜腺癌细胞（Ishikawa）在DMEM/F12培养基（详见材料表）中培养，培养基中添加1 mM丙酮酸钠、2 mM L-谷氨酰胺、100 µg/mL链霉素和100 IU/mL青霉素。将细胞接种至明胶包被的12孔板中（每孔2 × 105个细胞），并在37 °C培养箱中孵育24小时。</li>
</ol>
4. 胚胎附着
<ol>
	<li>将5-15枚新鲜的囊胚轻轻放入已预先接种Ishikawa细胞的12孔板的每个孔中，用于共培养（图5）。</li>
	<li>培养48小时后，在显微镜下观察胚胎，评估其贴附状态。为观察胚胎贴附情况，迅速移动培养板三次。未贴附的胚胎会在Ishikawa细胞表面呈现漂浮或滚动运动。</li>
	<li>使用公式（1）计算胚胎着床率；以胚胎黏附率表示着床效果。 
	胚胎着床率 = （贴附胚胎数 / 移植胚胎总数）× 100%&#160; &#160; （1）</li>
</ol>

Evaluating Embryo Adhesion in an In Vitro Co-Culture Model with Ishikawa Cells

<ol><li>Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+study+of+human+embryo+implantation%3A+choice+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines.</a> Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).</li>
<li>Li, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+efficient+method+to+quantify+embryo+attachment+to+endometrial+epithelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).</li>
<li>Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+trophoblast+to+uterine+epithelium+as+related+to+the+state+of+trophoblast+differentiation%3A+in+vitro+studies+using+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines.</a> Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).</li>
<li>Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+in+vitro+model+of+human+embryo+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">A high-throughput in vitro model of human embryo attachment.</a> Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).</li>
<li>Karvas, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-derived+trophoblast+organoids+model+human+placental+development+and+susceptibility+to+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens.</a> Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).</li>
<li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+landscape+of+3D-cultured+human+pre-gastrulation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos.</a> Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).</li>
<li>Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+implantation+in+the+laboratory%3A+an+update+on+current+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques.</a> Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).</li>
<li>Berneau, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+osteopontin+in+an+in+vitro+model+of+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation.</a> Cells. 8 (5), 432(2019).</li>
<li>Jiang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+HOXA10+sumoylation+inhibits+embryo+implantation+in+women+with+recurrent+implantation+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discov%22%5BJournal%5D)">Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure.</a> Cell Death Discov. 3, 17057(2017).</li>
<li>Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteopontin-integrin+%CE%B1v%CE%B23+interaction+at+implantation%3A+functional+analysis+using+three+different+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models.</a> Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).</li>
<li>Duan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+exposure+to+supraphysiological+estradiol+during+ovarian+stimulation+increased+the+risk+of+adverse+perinatal+outcomes+after+frozen-thawed+embryo+transfer%3A+a+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Orig+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study.</a> J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+%CE%B21+and+%CE%B23+are+biomarkers+of+uterine+condition+for+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer.</a> J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgelin+2+is+required+for+embryo+implantation+by+promoting+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization.</a> FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).</li>
<li>Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+1+increases+apical+fibronectin+in+blastocysts+to+increase+blastocyst+attachment+to+endometrial+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro.</a> Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).</li>
<li>Kang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-145+suppresses+embryo-epithelial+juxtacrine+communication+at+implantation+by+modulating+maternal+IGF1R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R.</a> J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).</li>
<li>Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ulipristal+acetate+on+human+embryo+attachment+and+endometrial+cell+gene+expression+in+an+in+vitro+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system.</a> Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+human+endometrium+for+studying+trophoblast-endometrium+interaction+during+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation.</a> Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).</li>
<li>Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+human+endometrium%3A+evolution+and+application+for+women%27s+health%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health.</a> Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).</li>
<li>Ahn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microengineered+vascularised+endometrium-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip.</a> Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).</li>
<li>Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mechanical+forces+change+the+human+endometrium+during+the+menstrual+cycle+in+preparation+for+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation.</a> Cells. 10 (8), 2008(2021).</li>
</ol>

作者声明不存在经济或其他利益冲突。

所提出方法的简便性与快速性 体外 用于胚胎植入研究的模型在早期药物筛选及其他科研应用中具有显著优势。Ishikawa 细胞系操作简便且通量高，使其成为大规模筛选的理想选择，尤其适用于药物发现的早期阶段。Liang13 发现TAGLN2基因敲低会降低滋养层细胞的侵袭能力。绿色14 证明胰岛素样生长因子可基于小鼠胚胎-衣原体细胞系统提高小鼠囊胚的黏附能力。该模型不仅可用于快速评估候选药物，还有助于研究其他在胚胎着床过程中发挥作用的分子，如细胞因子和转录因子15,16鉴于胚胎植入在生殖生物学中的重要意义，该模型有望推动我们对其潜在机制的理解，并为开发新型治疗手段提供可能。
尽管目前 体外 尽管该模型为研究胚胎着床提供了有价值的工具，但必须认识到其局限性。作为一种二维培养系统，它缺乏三维环境的复杂性 体内 环境17，这会显著影响细胞间的相互作用和信号通路。因此，尽管该模型可为各种分子对胚胎黏附的影响提供初步见解，但应将其视为一种筛选工具，而非替代方案 体内 研究。未来的研究方向可能包括开发更具生理相关性的三维培养系统，以更好地模拟子宫内膜复杂的微环境18，从而实现对药物反应和分子机制更准确的预测。此外，探索将该模型与其他先进技术（如微流控技术和器官芯片系统）相结合也具有重要意义。19,20 以进一步增强其生理相关性和预测能力。
在辅助生殖治疗过程中，超排卵旨在增加卵巢中卵子的产量，从而提高妊娠几率。然而，该操作可能导致雌激素水平显著升高，超过正常的生理阈值。雌激素是女性生殖过程中一种关键激素，可促进子宫内膜增殖，为胚胎着床创造有利环境；此外，它还调节包括孕酮在内的其他生殖激素的平衡。通过体外模型研究，我们的结果表明：虽然雌激素浓度的适度升高最初可提高胚胎着床率，但当其水平超出生理范围时，会显著抑制这一过程。值得注意的是，补充孕酮可有效逆转这种抑制作用。这些发现提示，在超排卵期间异常升高的雌激素水平可能是导致临床上新鲜胚胎移植着床率低于冻融胚胎移植的原因之一。此外，移植后补充孕酮有望提高胚胎着床成功率。
我们建立了一种简单、经济且可靠的胚胎植入检测方法。小鼠胚胎在发育至囊胚阶段后 体外 培养物与Ishikawa细胞共培养。该实验设计可用于研究多种分子（如细胞因子、药物和转录因子）在胚胎着床早期阶段的作用与功能。尽管Ishikawa细胞等已建立的细胞系在与人或小鼠胚胎联合使用时可能无法提供最接近生理条件的模型系统，但其良好的适应性和高通量特性使其成为早期大规模药物筛选的理想工具。虽然二维 体外 我们建立的培养模型虽需进一步优化，但为理想的子宫内膜建模奠定了基础。

胚胎植入是成功妊娠的初始步骤，对于理解其生物学基础以及应对不孕症的挑战至关重要。然而，由于伦理限制，获取人类临床胚胎样本面临重大困难，这阻碍了对早期妊娠期间人类胚胎与子宫内膜之间复杂相互作用的研究1。深入理解这些复杂机制对于推动基础生物学研究、药物发现以及生殖健康的发展具有重要意义。
既往的体外模型采用黏附模型，将单层人子宫内膜上皮细胞（RL95-2）2 与胚胎替代物（如BeWo、JAr或Jeg-33绒毛膜癌细胞）共培养。然而，类球体大小的选择至关重要，其直径范围为70–100 µm，过大或过小的细胞聚集体均可能影响实验的准确性。值得注意的是，每次制备的类球体中仅有25%符合适宜尺寸的标准4，且与胚泡的生理条件存在显著差异。
此外，子宫内膜和胚泡的三维（3D）培养系统提供了更接近生理条件的环境5，但该系统需要较高的技术熟练度，细胞生长缓慢，资源和维护成本高，标准化困难，且可重复性较低6。
在本实验方案中，我们介绍一种经济高效且快速的体外胚胎着床模型，该模型可在大多数实验室中建立并应用。本方法的总体目标是提供一个可靠且可重复的平台，用于在受控环境中研究胚胎与子宫内膜之间的相互作用。通过模拟胚胎着床的关键事件 体外该模型旨在弥合动物模型与临床环境之间的差距，从而实现更精确和有针对性的研究。
与胚胎替代物相比，使用小鼠囊胚能够更真实地模拟体内胚胎着床过程7。此外，源自人子宫内膜腺癌的Ishikawa细胞系具有腺上皮和子宫腔上皮的混合特性1，能够表达与正常子宫内膜相似的酶、结构蛋白和功能性类固醇受体，从而为胚胎着床提供一个生理上更相关的基质。该共培养系统操作简便、快速，适用于高通量筛选和药物测试8,9,10。通过提供一个稳定且可重复的实验平台，该方法有助于深入理解胚胎着床机制及其对人类健康的影响。

<table><tbody><tr><td>17-&amp;beta;-雌二醇</td><td>SIGMA</td><td>3301</td><td>活性最强的哺乳动物雌激素</td></tr><tr><td>BD Falcon</td><td>BD</td><td>353001</td><td>细菌培养用平皿，35 × 10 mm，带紧密盖，晶体级 virgin 聚苯乙烯，无菌</td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>ESCO</td><td>class &lt;img alt=&quot;方程 1&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/66873/66873eq01.jpg&quot; style=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;BSC</td><td>无菌操作，制备培养皿，试剂分装等</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo</td><td>8000DH</td><td>胚胎培养</td></tr><tr><td>培养板</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>1133032</td><td>DMEM/F12 (1x)，液体，1:1，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES 缓冲液</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td>胎牛血清，经鉴定，源自澳大利亚</td></tr><tr><td>明胶</td><td>SIGMA</td><td>G9391</td><td>B型，粉末，BioReagent，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>HCG</td><td>南京艾贝</td><td>M2520</td><td>灭菌试剂，腹腔注射，50 IU/mL</td></tr><tr><td>透明质酸酶&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>V900833</td><td>试剂级，粉末&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-D</td><td>(1x)，粉末，不含酚红，5 × 10 mL</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>L-谷氨酰胺-200 mM (100x)，液体</td></tr><tr><td>M2</td><td>Merck</td><td>MR-015-D</td><td>EmbryoMax M2 培养基 (1x)，液体，含酚红</td></tr><tr><td>矿物油&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>M8410</td><td>矿物油适用于多种分子生物学应用中作为覆盖层，以控制蒸发和交叉污染</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素，液体</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>含青霉素（碱）10,000 单位和链霉素（碱）10,000 单位，使用青霉素 G（钠盐）和硫酸链霉素溶于 0.85% 生理盐水中</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>南京艾贝</td><td>M2620</td><td>灭菌试剂，腹腔注射，50 IU/mL</td></tr><tr><td>孕酮</td><td>SIGMA</td><td>5341</td><td>在月经周期后半段由黄体分泌的类固醇激素</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>丙酮酸钠通常作为除葡萄糖外的碳源添加至细胞培养基中</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td>用于胚胎回收及胚胎发育观察</td></tr></tbody></table>

体外胚胎植入模型的建立

Establishment of an Embryo Implantation Model In Vitro

胚胎植入是成功妊娠建立的第一步。体外胚胎植入模型对于基础生物学研究、药物开发和筛选至关重要。本文介绍了一种简单、快速且高效的体外胚胎植入模型。在本实验方案中，我们首先介绍小鼠囊胚的获取以及人子宫内膜腺癌细胞（Ishikawa）&#160;的准备，随后介绍小鼠胚胎与Ishikawa细胞的共培养方法。最后，我们基于该模型研究了不同浓度的17-β-雌二醇（E2）和孕酮（P4）对胚胎黏附率的影响。研究结果表明，高浓度E2显著降低胚胎黏附率，而添加孕酮可恢复黏附率。该模型为评估和筛选参与黏附过程的分子（如细胞因子、药物以及调控植入和子宫内膜容受性的转录因子）提供了一个简单且快速的平台。

在辅助生殖技术过程中，控制性卵巢超促排卵（COH）是一个关键步骤，可使患者的雌激素水平较自然周期升高10-20倍以上11。鉴于这一背景，我们提出问题：高血清雌激素浓度是否会影响新鲜胚胎移植过程中的胚胎着床。基于该胚胎着床模型，我们研究了不同浓度的E2和P4对胚胎着床率的影响12。在饥饿处理后，Ishikawa细胞分别与E2（0、0.1、1、10和100 nM）或E2与P4的组合（0-0、100-0、100-10和100-100 nM）共同孵育48小时。随后将细胞转移至明胶包被的12孔板中，每孔加入5-15个囊胚。每个实验组设置3个重复，48小时后测定胚胎着床率。
结果表明，接近生理浓度的E2 (10 nM) 与 0 nM E 相比提高了胚胎着床率2然而，E的超高水平2 （100 nM）显著降低了胚胎着床率。添加孕酮可剂量依赖性地缓解超高水平雌激素的负面影响2 在植入过程中（图6）。根据这一点 体外 模型，我们阐述了非生理性超高浓度雌激素对胚胎着床的负面影响，并进一步介绍了该模型在科学研究中的应用。
<img alt="小鼠解剖过程、生殖解剖结构、子宫和输卵管示意图，用于生物学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：小鼠输卵管的切除。用镊子拉伸输卵管、卵巢及脂肪垫，先用剪刀切断输卵管和卵巢，再将输卵管从子宫上分离切除。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠胚胎发育示意图；胚胎及操作流程示意图；发育生物学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：受精卵获取。 使用镊子刺破输卵管的膨大壶腹部，以释放卵丘-受精卵复合体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞簇形成的显微镜图像的细胞聚集过程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：通过透明质酸酶消化分离裸合子。 使用镊子将卵丘-合子复合体小心转移至含有 0.5 mg/mL 透明质酸酶的 M2 溶液中，静置数分钟，直至卵丘细胞从合子上脱落。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于静态平衡实验的含矿物油微滴的培养皿示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4: 体外 小鼠胚胎培养 准备12滴KSOM培养基微滴，每滴体积为 20 µL. 用 3–5 mL 矿物油覆盖微滴。将小鼠胚胎从 M2 培养基转移至 KSOM 微滴的上半部分进行充分洗涤，然后将洗涤后的胚胎置于微滴下半部分，并在以下条件下孵育： 37 °C 含5% CO2 4天。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞形态的显微镜图像，突出显示用于生物学分析的细胞结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：胚胎植入。 将5-15个新鲜的囊胚轻轻放入含有Ishikawa细胞的12孔板的每个孔中进行共培养。培养48小时后，迅速移动培养板3次。未贴附的胚胎将在Ishikawa细胞表面表现出漂浮或滚动运动。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="雌激素（E2）和孕激素（P4）处理对黏附率的影响图表；统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66873/66873fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：超高浓度雌激素对胚胎着床率的影响。 星号表示具有统计学显著性差异，P &lt; 0.05。缩写：E2 = 雌二醇；P4 = 孕激素。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66873/66873fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了建立简单高效胚胎移植的方法 体外 用于评估影响胚胎着床过程相关分子的模型。

胚胎植入是成功妊娠建立的第一步。用于胚胎植入的体外模型对于基础研究……

胚胎植入。成功妊娠的初始步骤对于理解其生物学基础以及应对不孕症的挑战至关重要。本研究旨在建立一个稳定的平台，用于在受控条件下分析胚胎与子宫内膜之间的相互作用。基于该体外模型，我们发现超高浓度的雌激素会显著降低胚胎着床率，而补充孕酮则能够以剂量依赖的方式缓解这些负面影响。本研究为在体外受精过程中进行控制性卵巢刺激时提高新鲜胚胎移植的妊娠率提供了新的见解和治疗策略。与三维培养系统相比，该体外模型提供了一个简单、快速且成本效益高的平台，可在大多数实验室中建立，并具有高度的可重复性和可靠性，因而在生殖生物学领域的研究与开发中具有显著优势。首先，取一只6至8周龄的雌性小鼠，在间隔42至48小时的条件下依次注射PMSG和HCG。将该雌性小鼠与年龄相近的雄性小鼠合笼交配。处死雌性小鼠后，打开腹腔并找到其生殖器官。用镊子拉伸输卵管、卵巢和脂肪垫。用剪刀剪下输卵管和卵巢，随后剪下子宫。将获得的输卵管转移至预先加入M2培养基的35毫米培养皿中。穿刺输卵管膨大的壶腹部，以释放或夹出卵丘-合子复合物。用镊子将该复合物转移至含有0.5毫克/毫升透明质酸酶的M2溶液中，孵育数分钟。用卵子转移移液管收集合子，并在含有BSA的M2培养基中洗涤，以去除残留的透明质酸酶、卵丘细胞及杂质。首先，从新交配的雌性小鼠中获取胚胎。在35毫米培养皿底部制备12个微滴的钾离子优化单纯培养基（potassium simplex optimized medium）。用3至5毫升矿物油覆盖微滴，并将培养皿置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中平衡。使用移液管将小鼠胚胎从 M2 培养基转移至 KSOM 培养基中。将洗涤后的胚胎置于预先准备好的 KSOM 微滴中，并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养四天。根据囊胚的大小、内细胞团、滋养层细胞数量以及扩张程度，筛选出优质的囊胚。向12孔培养板中加入1毫升2%明胶，于37摄氏度孵育30分钟。随后吸除多余明胶，并让培养板底部完全干燥。将人子宫内膜腺癌细胞或Ishikawa细胞接种至经明胶包被的12孔板中，并将培养板孵育24小时。将5至15个新鲜的囊胚轻轻放入含有细胞的12孔板的每个孔中。48小时后，在显微镜下观察胚胎，通过移动培养板三次来评估其附着状态。未附着的胚胎会漂浮或在细胞表面滚动。最后，计算在不同雌激素浓度下胚胎的着床率。结果表明，与不含17β-雌二醇的对照组相比，接近生理浓度的17β-雌二醇可提高胚胎着床率；然而，约100纳米摩尔的超高浓度17β-雌二醇则显著降低了胚胎着床率。

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Christopher Hughes：血管生成研究的体外模型（访谈）

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体外胚胎植入模型的建立

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