一种用于分析多种细胞类型中核体动态变化的多功能流程

我们的主要研究方向是一种调控人类细胞可塑性和环境适应性的表观遗传机制。目前，我专注于研究核内凝聚物中染色质结构的改变如何触发病理性细胞状态。我认为，研究染色质结构的生物物理特性将开辟一个全新的领域，并为开发新型治疗策略提供独特机遇。

免疫荧光检测对于筛选核内凝聚物中的蛋白质组织具有重要价值。然而，在研究多种条件时，由于参数选择问题以及数据量庞大，图像分析可能具有挑战性。我们提供了一种全面的方法，指导如何正确选择参数，并配备自动化分析流程，以简化整个分析过程。

本方案指导用户完成从样品制备到数据分析的全过程。我们为计算能力和图像分析经验有限的研究人员提供了半自动化的流程设计。该工作流程免费向所有人开放，依托于广泛使用的开源软件（如 Python 中的 Imager）以及基于云端的免费服务 Google Colab。

首先，在计算机上下载并安装最新版本的 Fiji。下载 convert_to_TIFF.py 脚本后，将该脚本拖放到 Fiji 中并运行代码。

浏览至实验存储的路径。转换后的 TIFF 文件将创建在相同的实验文件夹内。点击“Plugins”，然后选择“3D Suite”并打开“3D Manager Options”。

在 3D Manager 窗口中，选中对应于“单位体积平均灰度值”、“像素边界框”、“灰度标准差”、“像素质心”和“单位质心”的复选框。勾选“排除 XY 边缘上的对象”和“排除 Z 边缘上的对象”。然后点击确定。打开人 T 淋巴细胞的荧光图像。按 Control Shift D 键复制蛋白通道，包括图像栈。

勾选超栈复选框。在通道框中指定相应的通道编号，并相应地重命名。要启动 Fiji 宏记录器，请转到插件，然后选择宏并选择记录。

然后，依次点击插件（Plugins）、GDSC、FindFoci 和 FindFoci GUI，以打开 FindFoci 插件。在图像下拉菜单中，选择待分析的图像。将高斯模糊（Gaussian blur）设置为 1.5，背景方法（Background method）设为“均值以上标准差”，背景参数（Background parameter）设为 9，搜索方法（Search method）设为“峰背景的分数”，搜索参数（Search parameter）设为 0.7，峰检测方法（Peak method）设为“相对于背景”，峰参数（Peak parameter）设为 0.2，最小尺寸（Minimum size）设为 5。

将最大峰数量设为较大的数值，以包含图像中的所有焦点。为增强焦点识别效果，将高斯模糊值调整至接近焦点直径的大小，并提高背景参数的数值以设定更严格的阈值。随后降低搜索参数的数值，以包含距离荧光峰值较远的区域，并降低峰参数的数值以实现峰的分离。

运行 FindFoci 并复制记录器窗口中出现的字符串。该字符串包含所选参数，但不包括引号。下载 nuclear_prod_q 后。

py 脚本，将该脚本拖放到 Fiji 中并点击运行以执行代码。在细胞核通道中，输入对应于 dapE 通道的编号。对于细胞核高斯模糊，请输入用于图像分割的模糊处理所需 sigma 值。

然后输入与目标蛋白染色通道相对应的通道编号。在 FindFoci 参数中，粘贴代表所选参数宏记录的字符串。勾选视觉复选框，然后单击“浏览”以选择存储图像的目录。

所有区域框编译完成后，单击“确定”以继续执行。在“ROI 管理器 3D”窗口的 ROI 列表中，选择细胞核通道，然后单击“Live ROI”设为开启。选择属于同一细胞核的 ROI，然后按“合并”。对于不需要的细胞核，按“删除”。

再次点击“实时感兴趣区域”为“开启”，选择全部，并确认所有细胞核均被正确分割。从量化文件夹中，打开包含分析所用参数记录的 TXT 文件。在浏览器中打开 Google Colab。

然后从文件中选择“打开笔记本”，并上传 final_nuclear_protein_metrics.ipymb 脚本。将包含每个图像区域的 CSV 文件的所有文件夹上传至 Google 云端硬盘中指定的文件夹。

在笔记本中，指明存储结果子文件夹的文件夹路径，并运行所有单元格。当代码完成编译后，打开包含所有已汇编数据的最终电子表格文件。