从血沉棕黄层中分离人外周血单个核细胞 通过 高通量免疫磁珠分离

分离外周血单个核细胞（PBMCs）通常是一个耗时且依赖手工操作的过程。我们发现了一种替代方法，可快速实施并能够处理大量样本。本方案提供了一种自动化高通量的方法，在确保实验一致性的同时，避免技术人员过度疲劳。

我们还详细介绍了在设备停机期间可使用的中等通量自动化兼容方法。这种中等通量方案为其他实验室提供了一种更具成本效益的替代选择。现在，生物样本库可以用相同数量的技术人员处理更多的样本。

这将增加样本采集的数量及其多样性，从而支持未来的研究并改善患者护理。首先，在室温下轻轻倒置10毫升全血试管10次。使用水平转子，在22摄氏度下以800 ×g离心10分钟，离心时开启刹车。

然后将样品放入生物安全柜中，观察是否存在三层明显分离的液体。用字母 A、B 和 C 标记三支 5 毫升聚苯乙烯管。轻轻旋转混匀后，用吸管吸取 1 毫升白膜层液体，转移至标记为 A 的管中。向含有白膜层的 A 管中加入 60 微升 0.1 摩尔的 EDTA。向 A 管中加入 50 微升混合液。用移液器上下吹打至少三次以充分混匀，并在室温下孵育 5 分钟。

随后，向 A 管中加入 890 µL PBS，并通过移液至少吹打混匀三次。接着，将磁珠管涡旋振荡 30 秒。向 A 管中加入 50 µL 磁珠，移液至少三次，充分混匀磁珠。

立即将A管放入磁力架中，室温孵育5分钟。然后小心吸取富集的细胞悬液至B管，收集无或极少红细胞的澄清部分，以获得最佳的外周血单个核细胞（PBMC）回收效果。随后，从磁力架上取下A管并弃去。

接下来，向B管中的细胞悬液加入50 µL磁珠，吹打混匀至少3次。立即将B管放入磁力架中，室温孵育5分钟。小心吸取上清液（富集后的细胞悬液）至C管，仅收集澄清部分。

将管B从磁力架上取下并弃去。立即将管C放入磁力架中，在室温下孵育5分钟。小心地用移液器将富集的细胞悬液转移至已标记的离心管中，并用PBS补至2 mL。

将50微升细胞悬液转移至自动细胞计数仪的样品杯中。加入450微升PBS，进行1:10稀释的细胞计数。首先，将两个14毫升试管标记为A和B，一个15毫升离心管标记为C，另一个15毫升离心管标记为废液管。

离心全血后，收集并取1 mL制备好的白膜层加入A管中。向A管中加入60 µL 0.1 M EDTA。然后将磁珠管涡旋振荡30秒。开启自动化PBMC仪器时，打开仪器前方的电源开关。在仪器的主界面上，选择“Profile”并选择所需的程序。

然后输入起始体积，并对每个样本重复此操作。选择将使用相同试剂盒的所有象限。接下来，按照全自动PBMC仪器屏幕上的指示，将标记好的耗材、滤芯吸头和缓冲液容器装入仪器转盘的每个象限中。

加载完成后，取下耗材和试剂的盖子，并在仪器屏幕上选择运行。运行结束后，选择卸载并从仪器的旋转盘中取出样本。转移500 µL细胞至样品杯中，用于无需稀释的细胞计数。

与手动方法相比，自动化的磁珠法在细胞活力或总细胞数方面均未发现显著差异。手动方法在43分钟内处理了8个样本，而自动化方法共耗时57分钟，其中包括35分钟的无需手动操作的时间。在5天内处理的外周血单个核细胞（PBMCs）平均细胞活力高于90%，在10天内处理的样本则高于75%。

与24小时内处理的样本相比，5天后PBMC的平均得率下降了50%。