Name: 通过高通量免疫磁珠分离从血沉棕黄层中分离人外周血单核细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 学习使用高通量免疫磁珠分离技术从血沉棕黄层中分离人外周血单核细胞。该自动化方法可提高生物样本库处理效率，保持细胞活力超过90%，同时减少技术人员工作负担并增加样本多样性。

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新南威尔士州卫生系统生物样本库衷心感谢新南威尔士州卫生病理学中心、新南威尔士州健康与医学研究办公室以及悉尼地方卫生区的支持。此外，作者衷心感谢Omico及由新南威尔士州卫生系统生物样本库支持的其他研究项目，允许发表其内部生成的数据，并将未使用的样本用于科研目的。作者感谢詹妮弗·布赖恩教授（新南威尔士州卫生病理学中心，悉尼大学）在关键领导力和讨论方面提供的支持。图1 使用BioRender.com制作。

质量控制用血液标本及内部生成的数据（如细胞计数、存活率以及处理时标本的&#160;保存时间）来自新南威尔士州卫生系统生物样本库（Royal Prince Alfred Hospital）经伦理批准的知情同意研究项目（HREC 批准号：2019/ETH06776）。采集于 EDTA 采血管中的已处理（即去除了血浆）、未经筛查且去标识化的成人人源血液样本被用于实验。这些质量控制用血液标本均在采集后 72 小时内完成处理，并用于比较密度梯度法与磁珠法分离 PBMC 的实验。代表性结果中所用的密度梯度分离方法详见补充文件 1。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。
1. 全血制备
<ol>
	<li>在室温下轻轻倒置10 mL全血试管（涂有乙二胺四乙酸[EDTA]、酸-柠檬酸盐-右旋糖[ACD]或锂肝素）10次。</li>
	<li>可选：&#160;若需保存全血，请分装至冻存管中，于-80 °C保存。</li>
	<li>使用摆桶转子，以800 x g 在22 °C离心10分钟，开启刹车（加速度/减速度均为9）。</li>
</ol>
2. 白细胞层收集
<ol>
	<li>离心后，将样品置于生物安全柜中，并检查是否出现三层明显分离的液层（如图所示） 图1). 
	注意：红细胞位于离心管下部的深红色层中。红细胞层上方有一层白色不透明层，称为白膜层，含有白细胞和血小板。上层黄色液体为血浆。</li>
	<li>可选：若需保存血浆，可将血浆分装至冻存管中，于 -80 °C 保存。</li>
	<li>从10 mL血液管中用移液器吸取1 mL血沉棕黄层（起始材料），分别转移至步骤3.1和步骤4.1中为手动方法和自动方法指定并标记的离心管中。用移液器吸头轻轻搅动血沉棕黄层（白色不透明层），并通过抽吸收集该层。 
	注意：采样时血浆和红细胞少于100 µL亦可接受。若为同一受试者采集多管血液，可将白膜层合并；但此操作可能影响血小板浓度13.</li>
	<li>对于手动处理，请转至第 2 节&#160;3. 如需自动化处理，请进入第4节。</li>
	<li>可选：若需保存红细胞，可将红细胞分装至冻存管中，于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
3. 外周血单个核细胞纯化——手动方法
注意：单个操作员可使用一个磁力架处理最多 8 个样品。
<ol>
	<li>用字母 A-C 标记 3 个 5 mL 聚苯乙烯管。 
	注意：若处理多个样本，请使用顺序编号，例如 1A、1B、1C、2A、2B、2C。</li>
	<li>加入60 µL 0.1 M EDTA（终浓度为6 mM，pH 8.0，参见 补充文件 2 将配方所需试剂加入步骤 2.3 中已转移了血沉棕黄层的 A 管中。</li>
	<li>加入50 µL的&#160;鸡尾酒混合管（参见 材料表将溶液加入A管中，用移液器吹打至少3次以混匀，室温孵育5分钟。</li>
	<li>向A管中加入890 µL PBS，用移液器吹打至少3次以混匀。</li>
	<li>涡旋混合&#160;磁珠管（参见&#160;材料表)&#160;30 秒。</li>
	<li>向A管中加入50 µL磁珠，用移液器吹打混匀至少3次。</li>
	<li>立即将A管放入磁力架中，在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>小心地将富集后的细胞悬液用移液管转移至B管中，收集无或极少（&#60;100 µL 红细胞以获得最佳的外周血单个核细胞回收率。 
	注意：请勿扰动吸附在磁铁上的磁珠。建议使用移液管进行转移。</li>
	<li>从磁力架上取下A管并弃去。</li>
	<li>向B管中的细胞悬液中加入50 µL磁珠，通过移液器上下吹打至少3次以充分混匀。</li>
	<li>立即将B管放入磁力架中，在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>小心地将富集后的细胞悬液用移液管转移至C管中，仅收集澄清的部分。 
	注意：请勿扰动吸附在磁铁上的磁珠。建议使用移液管进行转移。</li>
	<li>从磁力架上取下B管并弃去。</li>
	<li>立即将C管放入磁力架中，在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>用移液器小心地将富集的细胞悬液转移至已标记的离心管中，并用 PBS 定容至 2 mL。</li>
	<li>将50 µL细胞悬液转移至自动细胞计数仪的样品杯中。如需进行1:10稀释的细胞计数，加入450 µL PBS。继续进行第5节的细胞计数步骤。</li>
</ol>
4. PBMC 纯化——自动化方法
注意：一台自动化PBMC仪器最多可处理4个样本。&#160;单个操作员可并行运行多台仪器。
<ol>
	<li>标记2个14 mL离心管分别为A和B，1个50 mL离心管为C，以及1个50 mL离心管为 &#34;废弃物&#34;. 
	注意：每使用一次自动化PBMC仪器，仅需一个废液容器。若处理多个样本，请采用顺序编号，例如1A、1B、1C、2A、2B、2C。</li>
	<li>向步骤 2.3 中已转移了血沉棕黄层的 A 管中加入 60 µL 0.1 M EDTA（终浓度为 6 mM）。</li>
	<li>涡旋磁珠管（参见&#160;材料表)&#160;30 秒。</li>
	<li>打开仪器正面的电源开关，启动全自动PBMC仪器。</li>
	<li>在自动化PBMC仪器的主屏幕上，选择 简介 并选择所需的实验方案。 
	注意： EasySep 直接人外周血单个核细胞分离试剂盒 19654 - 血沉棕黄层 选择了该PBMC分离的方案简介。请参阅方案报告中制造商提供的该简介的标准操作流程14.</li>
	<li>输入起始体积（吸入试管A的血沉棕黄层的量），并对每个样本重复此操作。</li>
	<li>选择将使用相同试剂盒的所有象限。 
	注意：如果多个象限使用相同的实验方案，自动化PBMC仪器将建议对所有象限使用相同的试剂盒14.</li>
	<li>将标记好的耗材、带滤芯吸头和缓冲液容器装入仪器的转盘中。含有磁珠管和混合液管的试剂盒应放入第一象限。 
	注意：仪器将提示用户是否希望对所有象限使用1个试剂盒。选择“是”，并使用该试剂盒选中所有象限。</li>
	<li>加载完成后，取下耗材和试剂的盖子，并在仪器屏幕上选择运行。</li>
	<li>当运行结束后，选择 卸载 从仪器的转盘中取出样本（含有标记为C管的PBMC悬液）。将磁珠管、混合液管和缓冲液容器置于4 °C保存。弃去标记为A、B及废液的管子（见步骤4.1）以及滤芯吸头。 
	注意：采用自动化方法时无需用PBS补充体积，因为PBMC悬液最终体积为7 mL。</li>
	<li>将500 µL细胞转移至样品杯中，用于未稀释的细胞计数。继续进行第5节的细胞计数操作。</li>
</ol>
5. 细胞计数
<ol>
	<li>按照制造商说明书，使用台盼蓝染色排斥法进行细胞计数和活力检测15。 
	注意：在作者的内部操作流程中，使用自动细胞计数仪进行细胞分析，并采用以下设置以获取外周血单个核细胞（PBMC）。 
	稀释倍数 = 10（适用于细胞悬液体积较小时的手动操作）或 1（适用于自动操作） 
	细胞类型：PBMC 
	浓度范围 = 5 × 104 至 1 × 107 个细胞/mL 
	大小范围（直径）= 8 µm 至 50 µm 
	图像数量 = 50</li>
</ol>
6. 冷冻保存准备
<ol>
	<li>将样本管放入离心机（使用摆桶转子），在22 °C条件下以300 x g离心8分钟，刹车设置为开启（加速度/减速度均为9）。</li>
	<li>离心结束后，将样本放回生物安全柜中。</li>
	<li>使用移液器小心吸除上清液。可保留少量上清液与PBMC沉淀一起，以避免扰动沉淀。</li>
	<li>用3 mL预冷的冷冻保存液重悬沉淀，缓慢轻柔地吹打混匀，直至悬液均匀。 
	注意：冷冻保存液的体积可根据所需的最终PBMC浓度进行调整。</li>
	<li>将重悬后的PBMC悬液分装&#160;1 mL至预先编号的冻存管中，并置于程序降温盒中，在-80 °C条件下至少冷冻4小时。 
	注意：每支冻存管中分装的PBMC体积可根据研究者的偏好进行调整。</li>
	<li>冻存管在-80 °C条件下保存至少4小时后，将其转移至液氮气相储存罐&#160;中进行长期保存。</li>
</ol>
7. 统计数据分析
<ol>
	<li>代表性结果数据使用 补充文件 3 中指定的统计与绘图软件进行分析。</li>
</ol>

High-Throughput PBMC Isolation Using Immunomagnetic Beads

<ol><li>Alexovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+mononuclear+cells%3A+A+review+of+recent+proteomic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood mononuclear cells: A review of recent proteomic applications.</a> Proteomics. 22 (15-16), e2200026(2022).</li>
<li>Zhang, M., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multi-differentiation+potential+of+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (6), 48(2012).</li>
<li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Lett. 33 (5), 376-384 (2012).</li>
<li>Kleeberger, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+recovery+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+cryopreserved+for+up+to+12+years+in+a+multicenter+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Viability and recovery of peripheral blood mononuclear cells cryopreserved for up to 12 years in a multicenter study.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (1), 14-19 (1999).</li>
<li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+%28PBMC%29+by+density+gradient+centrifugation+on+percoll%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li>
<li>Fuss, I. J., Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Curr Protoc Immunol. 7, 711-718 (2009).</li>
<li>Gautam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+gene+expression+profiles+of+whole+blood+and+peripheral+blood+mononuclear+cells+using+multiple+collection+and+processing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Investigating gene expression profiles of whole blood and peripheral blood mononuclear cells using multiple collection and processing methods.</a> PLoS One. 14 (12), e0225137(2019).</li>
<li>Hamot, G., Ammerlaan, W., Mathay, C., Kofanova, O., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+validation+for+automated+isolation+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Method validation for automated isolation of viable peripheral blood mononuclear cells.</a> Biopreserv Biobank. 13 (3), 152-163 (2015).</li>
<li>Coppola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+viable+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+biobanking+using+a+robotized+liquid+handling+workstation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Purification of viable peripheral blood mononuclear cells for biobanking using a robotized liquid handling workstation.</a> J Transl Med. 17 (1), 371(2019).</li>
<li> Stemcell Technologies. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vol.+27156%5BTitle%5D)+AND+%22STEMCELL+TECHNOLOGIES%22%5BJournal%5D)">Vol. 27156.</a> STEMCELL TECHNOLOGIES. , 1-4 (2020).</li>
<li>Hornschuh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+magnetic+sorting+preserves+the+functionality+of+ex+vivo+cultivated+non-adherent+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Negative magnetic sorting preserves the functionality of ex vivo cultivated non-adherent human monocytes.</a> Biology (Basel). 11 (11), 1583(2022).</li>
<li>Bhattacharjee, J., Das, B., Mishra, A., Sahay, P., Upadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+isolated+by+positive+and+negative+magnetic+sorting+techniques+show+different+molecular+characteristics+and+immunophenotypic+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Monocytes isolated by positive and negative magnetic sorting techniques show different molecular characteristics and immunophenotypic behaviour.</a> F1000Res. 6, 2045(2017).</li>
<li>Ohlsson, S., Diedrich, B., Uhlin, M., Sandgren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+processing+for+pathogen+inactivation+of+double-dose+buffy-coat+platelet+concentrates%3A+Maintained+in+vitro+quality+over+7-day+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Vox+Sang%22%5BJournal%5D)">Optimized processing for pathogen inactivation of double-dose buffy-coat platelet concentrates: Maintained in vitro quality over 7-day storage.</a> Vox Sang. 113 (7), 611-621 (2018).</li>
<li>Easysep direct human PBMC isolation kit for processing 100 mL buffy coat. Stemcell Technologies. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html">https://www.stemcell.com/products/brands/easysep-cell-separation.html</a> (2022).</li>
<li>Vi-cell XR cell viability analyzer instructions for use. Beckman Coulter. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf">https://mbcbiolabs.com/wp-content/uploads/2022/08/Beckman-Coulter-ViCell-Manual.pdf</a> (2017).</li>
<li>Fuchs, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+biobanking%3A+Employing+a+robotic+system+for+automated+mononuclear+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Next-generation biobanking: Employing a robotic system for automated mononuclear cell isolation.</a> Biopreserv Biobank. 21 (1), 106-110 (2023).</li>
<li>Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology%2C+white+blood+cell%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls+Publishing%22%5BJournal%5D)">Histology, white blood cell.</a> StatPearls Publishing. , (2024).</li>
<li>Mathay, C., Ammerlaan, W., Betsou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+buffy+coat+extract+on%3A+Methodology%2C+feasibility%2C+optimization%2C+and+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreserv+Biobank%22%5BJournal%5D)">Automatic buffy coat extract on: Methodology, feasibility, optimization, and validation study.</a> Biopreserv Biobank. 10 (6), 543-547 (2012).</li>
<li>Golke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delays+during+PBMC+isolation+have+a+moderate+effect+on+yield%2C+but+severly+compromise+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Delays during PBMC isolation have a moderate effect on yield, but severly compromise cell viability.</a> Clin Chem Lab Med. 60 (5), 701-706 (2022).</li>
<li>Yi, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+delayed+PBMC+processing+on+functional+and+genomic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of delayed PBMC processing on functional and genomic assays.</a> J Immunol Methods. 519, 113514(2023).</li>
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<li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+%28PBMC%29+functional+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Curr Pathobiol Rep. 7 (2), 17-27 (2019).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

人外周血单个核细胞（PBMCs）是多种检测中常用的多功能细胞类型；然而，其分离通量在包括生物样本库在内的许多实验室中常常受限。16此前，新南威尔士州卫生 statewide 生物样本库采用密度梯度法分离外周血单个核细胞（PBMCs）。为提高处理通量，曾探索将密度梯度分离法实现自动化，但实施过程中发现了若干障碍，包括（i）实现完全自动化所需的带离心单元的液体处理设备成本较高，&#160;添加&#160;需要高效过滤器（HEPA）单元以生产无菌产品、（ii）经过编程培训的人员，以及（iii）协议测试所需的时间。因此，本研究探索了替代方法，并确定了一种可购得的商用人外周血单个核细胞（PBMC）试剂盒，可用于手动和自动化处理。由于处理所需设备可置于标准（长度1.2 m）生物安全柜内，因而可确保无菌性。本文详细描述了对制造商推荐方案所进行的修改14，以在不牺牲质量的前提下提高效率并降低试剂成本。此外，制造商的方案已扩展，详细说明了将原始血样管中的全血（步骤1.2）、血浆（步骤2.2）和红细胞（步骤2.5）分装保存以用于未来研究的生物样本库操作步骤，以及细胞计数和冷冻保存步骤。
本研究比较了三种PBMC分离方案：密度梯度离心法、手动磁珠法和自动化磁珠法。对生产商提供的手动磁珠法操作流程进行了若干改进，包括在PBMC分离前省去稀释血沉棕黄层（buffy coat）的步骤，以及取消离心过程中必须中断（break OFF）的要求，从而使研究人员能够采用一种灵活、经济且高通量的PBMC分离方案。首先，使用八份配对的全血样本分别通过密度梯度离心法和手动磁珠法分离PBMC，以进行比较。重要的是，两种方法在细胞亚群分布、细胞活力以及PBMC回收率方面均无显著差异，如图2A-F、图3A和补充图1所示。在代表性数据中，使用台盼蓝排斥法测得的细胞数量在密度梯度离心法中较高，但在使用血液细胞分析仪时则未观察到该差异。细胞计数仪所设定的PBMC细胞类型直径范围为8–50 µm，因此在使用台盼蓝排斥法时，计数结果将包括PBMC以及粒细胞（直径约为12–15 µm）17。尽管血液细胞计数仪比台盼蓝排斥法具有更高的特异性，但部分回收率计算结果超过100%，反映了仪器本身的误差范围（见补充图1）。因此，建议研究人员在比较不同PBMC分离方案的得率时，联合使用多种细胞计数方法，因为大多数技术无法同时提供高特异性和高灵敏度的差异计数。此外，本研究未开展实验以比较两种方法所得PBMC的功能活性，这是本分析的局限性之一。
接下来，比较了手动和自动化的磁珠法，对8份配对样本的PBMC得率和活力进行分析，未发现显著差异（图 4A，B）。由于两种方法使用了相同的抗体分离试剂盒，因此未对细胞群进行单独比较。重要的是，采用自动化方案后，处理8个样本的动手操作时间从43分钟缩短至22分钟&#160;(图4C）。尽管自动化可确保通量、防止技术人员疲劳以及样本处理的一致性，但其试剂与耗材成本显著更高，约为手动磁珠法的3至4倍。此成本数据是在对厂商方案进行修改后得出的，即使用1 mL的血沉棕黄层（来自10 mL全血）而非推荐的2–5 mL（来自10 mL或更大体积的全血）。若预算有限，选择手动方法可使处理时间减少约25%，同时使试剂和耗材成本与密度梯度分离法相当。建议&#160;每次每名技术人员处理的样本数不超过8个，以确保在5分钟孵育期内样本加入时间充分错开（约每样本30秒）（步骤3.7、3.11和3.14）。
在手动和自动珠基方法中，去除血沉棕黄层是确保外周血单个核细胞（PBMC）有效分离的关键步骤。需要注意的是，本方案使用血沉棕黄层而非全血，因为试剂体积是&#160;基于起始材料的体积来确定的10。完全去除整个血沉棕黄层在技术上具有挑战性。最初该方法描述去除0.5 mL血沉棕黄层，但后来增加至1 mL以提高回收率。为确保血沉棕黄层回收充分且一致，在方案文档和培训中详细说明此过程至关重要。建议在吸取血沉棕黄层时轻轻旋转移液器吸头，同时注意避免吸入下层过多的红细胞（步骤2.3）。必须避免抗体混合物（用于结合非目标细胞，如粒细胞和红细胞）饱和，否则会影响细胞得率和纯度10。为尽量减少血沉棕黄层提取过程中混入的红细胞，移液器吸头应置于血浆层与血沉棕黄层之间。血沉棕黄层体积可超过1 mL；但必须如上所述谨慎操作，确保收集体积中红细胞含量不超过10%。或者，也可使用自动化液体处理设备以实现血沉棕黄层的稳定收集18。然而，考虑到设备成本，大多数实验室可能难以承担校准和排查液体处理仪器方案所需的专门工时。
鉴于新南威尔士州卫生系统生物样本库计划在未来3年内处理23,000份外周血单个核细胞（PBMC），自动化磁珠法技术的过渡与应用至关重要。本文证明，自采集后9天内，均可从ACD管中分离获得PBMC，且平均活力 &#62;70%。虽然采集后24小时内的得率最佳，但在实际操作中，样本可能需要运输，因此在此时间范围内处理并不总是可行。研究表明，采用手动或自动化磁珠法分离的PBMC，其得率可能达到 &#62;3 × 105 每毫升全血中的细胞数，在采集后4天内分离时 &#62;1 × 105 每毫升全血中的细胞数在采集后10天内分离时为低&#160;超过5天的样本数量被视为本分析的局限性。此外，由于无法获得相关信息，数据未按参与者的年龄、性别和临床病史进行分组。尽管需要进行比较分析以评估两种方法在处理时间延迟方面的影响，但已有文献报道，采用密度梯度法分离PBMC时若存在时间延迟，会降低细胞质量，并显著增加红细胞污染。19,20此外，若处理延迟，粒细胞比例会增加，因此，相似样本的 &#34;年龄&#34; 应分组以进行下游分析20,21,22值得注意的是，本实验使用含酸性枸橼酸葡萄糖（即枸橼酸三钠、枸橼酸和葡萄糖）抗凝的血液进行；然而，若使用其他抗凝剂，细胞类型的得率和/或比例可能会有所不同23因此，建议研究人员根据预期的下游PBMC分析选择合适的抗凝剂。
综上所述，本文详细介绍了一种使用磁珠分离外周血单个核细胞（PBMC）的方案，该方案可适应高通量工作流程，满足规模化需求的同时不损害细胞活力。手动和自动化方法均可通过调整起始体积和重悬体积来优化，以获得特定的细胞浓度。新南威尔士州卫生系统生物样本库已从原先每月提取约60份PBMC（采用传统的密度梯度离心法）转变为每月提取约300份PBMC（采用这种兼容自动化的磁珠法）。作者下一步的目标是利用自动化平台将PBMC处理量提升至每月1200份，并进一步比较磁珠法（包括手动和自动化）与密度梯度法所分离的PBMC，以推动该技术在其他实验室的推广应用，尤其侧重于生物样本库领域。

外周血单个核细胞（PBMC）分离是一种将淋巴细胞和单核细胞从全血其他成分中分离出来的技术。PBMC 是一种多功能细胞类型，可用于多种应用，包括但不限于免疫治疗、疫苗开发、靶点或生物标志物鉴定以及抗体/小分子药物研发1,2。这些细胞可从健康个体或患病个体中分离获得，既可立即用于后续实验，也可冻存以供未来研究使用3。在某些情况下，下游应用目的明确；而在另一些情况下（如在生物样本库中常见的情形），PBMC 被分离并储存，以备将来未指定的用途4。
密度梯度离心法是自全血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）5,6,7 的传统技术，其原理是在离心过程中依据细胞密度差异实现不同细胞类型的分离。尽管该方法可能存在一些操作上的差异，但通常做法是将全血用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后，加在特制或标准离心管中的密度梯度介质上方，然后进行离心。离心后形成四个明显分层：最上层为富含血小板的血浆层，其下为位于密度梯度介质上方的薄层PBMC，最底层则由红细胞（RBCs）和粒细胞组成。尽管该方法曾被称为“金标准”8，但在放大应用方面存在局限性，例如处理时间较长、离心机容量有限、难以分装其他血液成分（如血浆和红细胞），以及自动化操作困难。虽然该方法可以实现自动化9，但需要对液体处理系统进行复杂的编程（若要完全自动化还需配备离心模块），且整个过程仍耗时较长。
此后，将介绍一种替代性工作流程，该流程采用免疫磁珠分离技术，可使用八孔磁架进行手动操作，或使用仪器实现全自动处理。该方法利用一种抗体混合物，将其加入细胞中，可特异性结合不需要的细胞群体，此处即血小板、粒细胞和红细胞。这些不需要的细胞群体随后通过磁性分离被去除，留下单核细胞和淋巴细胞群体存在于阴性组分中，可直接用于后续实验10。这种阴性筛选方法比阳性筛选方法更快速，因为阳性筛选需要额外步骤去除PBMC上的抗体与磁珠复合物。此外，阴性筛选还具有优势，已有文献描述其可更好地保持细胞功能11,12。

<table><tbody><tr><td>细胞冻存液 CS10，100 mL（CRYOSTOR）</td><td>StemCell&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Technologies</td><td>07930</td><td></td></tr><tr><td>II级生物安全柜</td><td>Thermo Scientififc&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>51033311</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell 1 mL FX</td><td>BioTools</td><td>BCS-407P</td><td>这是用于控制降温速率的冻存容器。</td></tr><tr><td>蒸馏水&amp;nbsp;</td><td>Bacto Laboratories</td><td>561832</td><td></td></tr><tr><td>DxH 500 血液分析仪&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B40601</td><td>被称为外部自动细胞计数仪。</td></tr><tr><td>EasyEights&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; EasySep&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 磁铁</td><td>StemCell&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Technologies</td><td>18103</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Direct Human PBMC Isolation Kit</td><td>StemCell&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Technologies</td><td>19654</td><td>试剂盒包含磁珠管和预混液管</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma-Aldrich Pty Ltd</td><td>E6758-500G</td><td>从EDTA盐配制0.1 M EDTA溶液的说明见补充文件2。</td></tr><tr><td>Lymphoprep&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 密度梯度介质</td><td>StemCell&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Technologies</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge ST4 Plus 离心机</td><td>Thermo Scientififc&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>THR75009903</td><td></td></tr><tr><td>Orion Star A211 pH计电极</td><td>Thermo Scientififc&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>STARA2110</td><td></td></tr><tr><td>Orion&amp;trade; ROSS Ultra&amp;trade; Glass Triode&amp;trade; pH/ATC 复合电极</td><td>Thermo Scientififc&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;</td><td>8302BNURCA</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），溶液，1X，500 mL</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RoboSep&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Buffer 1X</td><td>StemCell&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Technologies</td><td>20104</td><td>用于统计分析的软件。</td></tr><tr><td>RoboSep&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;-S</td><td>StemCell&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Technologies</td><td>21000</td><td>全自动细胞分选仪器。</td></tr><tr><td>RoboSep&amp;trade; 滤芯吸头</td><td>StemCell&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Technologies</td><td>20125</td><td></td></tr><tr><td>SepMate&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;-50 (IVD) 管</td><td>StemCell&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Technologies</td><td>85460</td><td>IVD - 体外诊断。也称为 SepMate&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;-50 管</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR 细胞分析仪</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td></td><td>内部自动细胞计数仪。该仪器已停产，自2022年12月31日起不再销售。替代仪器为 ViCell BLU 细胞活力分析仪（产品编号：C19196）。</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR 四联装试剂盒</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>383722</td><td></td></tr></tbody></table>

从血沉棕黄层中分离人外周血单个核细胞 通过 高通量免疫磁珠分离

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells from Buffy Coats via High Throughput Immunomagnetic Bead Separation

外周血单个核细胞（PBMCs）是一类包含单核细胞和淋巴细胞的异质性细胞群体。冷冻保存的PBMCs在长期储存中具有稳定的存活率，使其成为多种下游研究应用的理想细胞类型，包括流式细胞术、免疫测定和基因组测序。通常，PBMCs的分离 通过&#160;然而，密度梯度离心法是一种通量较低的工作流程，难以扩大规模且成本较高。本文介绍了一种基于磁珠的高通量外周血单个核细胞（PBMC）分离方法，操作快速简便。通过比较密度梯度分离法与该磁珠法所获得的PBMC在总细胞浓度、活力及细胞群体分布方面的差异，发现两种方法在细胞活力和细胞类型比例上具有可比性。分离得到的PBMC在采血后9天内活力仍保持在70%以上，但与采血后24小时内处理的样本相比，5天后细胞得率下降一半。综上所述，本文描述了一种采用磁珠法的PBMC分离流程，适用于高通量工作模式，并证明手动和自动化磁珠法均可提高处理能力，且可根据不同预算提供灵活选择。

使用磁珠法或密度梯度分离法分离外周血单个核细胞（PBMC）时，检测了分离前（即全血中）和分离后淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的比例。两种方法均显著富集了淋巴细胞和单核细胞的比例图2A，B此外，通过磁珠法分离的PBMC中，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞（即粒细胞）的比例显著降低（图2C-F)。密度梯度法与磁珠法在淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及粒细胞的比例上均无显著差异（图2）。此外，还计算了上述细胞类型的回收率（见 补充图1）。两种方法的平均细胞活力均超过95%，且差异无统计学意义（图3A）。使用设定的尺寸范围（直径）对PBMC进行计数 8 µm 到 50 µm，其中密度梯度分离法获得的总细胞数大约高出两倍（图3B). 
接下来，将自动化珠粒法与手动方法进行了比较。在细胞活力方面未发现显著差异（图 4A）或总细胞计数（图 4B）使用手动或自动方法。比较了处理这8个样本所需的时间，包括无需人工干预的无人操作时间。处理8个样本的总时间为43分钟 对比. 57 分钟用于手动操作 与自动方法。自动方法包括35分钟的免手动操作处理（图4C).
基于磁珠法的PBMC分离流程（含全血与血浆分装）在9个月内进行了试点，共从未经筛选的人类血液中分离出1410份PBMC样本，其中前820名受试者使用手动平台，随后590名受试者采用自动化方法。根据研究接受标准，样本处理在采集当天或采集后最多10天内进行，处理延迟主要归因于样本运输时间。无论是手动还是自动化方法，采集后24小时内处理的PBMC均表现出最高的活力与回收率图5）。平均细胞活力为 &gt;5天内处理的PBMCs为90% &gt;10天内处理的PBMCs为70%图5A). 与24小时内处理的样本相比，5天后PBMC的平均得率下降了50%（图5B).
<img alt="血液样本处理示意图：离心、细胞分离、用于活力研究的低温储存。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：基于磁珠的外周血单个核细胞（PBMC）从血沉棕黄层分离方案的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞分离方法比较；折线图 A-F 显示淋巴细胞、单核细胞、粒细胞数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2密度梯度法和磁珠法分离PBMC前后全血中淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及粒细胞的比例 淋巴细胞百分比（A），单核细胞（B），中性粒细胞（C），嗜酸性粒细胞（D），嗜碱性粒细胞（E）和粒细胞（F在PBMC分离前的配对全血样本（方块）及分离后的PBMC中 通过 密度梯度法（空心圆）或磁珠法（实心圆） (n = 8). ns = 无显著性差异，且 *p &lt; 由单因素方差分析（A 和 B）或弗里德曼检验确定的 0.05C-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞活力检测数据；台盼蓝排斥法；密度梯度法与磁珠法比较图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3通过密度梯度法和磁珠法分离PBMC的活力与总细胞数。 (A) 密度梯度法处理样本的平均（± 标准差）细胞活力（方块，深色柱状图） 与基于珠的（圆形，空心条形）方法用于8对样本。ns = 配对检验无显著性差异 t检验. (B密度梯度法处理样本的总细胞数（方块，深色柱） 与基于珠的（圆形，空心柱状）方法，用于8对样本。*p &lt; 使用配对法确定的0.05 t检验. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞活力、总细胞数、处理时间；比较图表；手动法与自动法对比" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4手动与自动化珠基方法的比较 (A) 采用手动法处理的样本细胞活力均值（± 标准差）（方块，深色柱状图） 与. 8对样本的自动化（圆形，空心条）珠式检测方法。ns = Mann-Whitney检验无显著性差异。（B) 使用手动方法处理的样本总细胞数（方块） 与. 8对样本的自动化（圆形）磁珠法。ns = 配对样本检验无显著性差异 t检验. (C8个样本的手动处理时间 与自动方法，包括手动操作时间（浅色柱）和非手动操作时间（深色柱）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞活力与得率比较；柱状图；处理天数；手动法与自动化方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66887/66887fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5根据样本采集至PBMC保存之间的时间，比较通过手动或自动化方式使用磁珠法分离PBMC的细胞活力和得率。 (A) 采用手动方法处理的受试者样本的平均（± 95% 置信区间）细胞活力（深色柱） 与. 自动化（开放通道）珠粒法。详细列出参与者数量的表格。ns = 无显著性差异。na = 不适用。*p &lt; 0.05，经Tukey多重比较检验。 (B) 使用手动法处理的受试者样本总细胞数（深色柱） 与. 自动化（开放通道）珠粒法。详细列出参与者数量的表格。ns = 无显著性差异。na = 不适用。*p &lt; 通过Tukey多重比较检验，显著性水平为0.05。由于重复次数少于3次，自动化第10天组无相应数值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/66887fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充图1：采用密度梯度法和磁珠法分离后不同细胞百分比回收率的图示。该百分比通过全血样本在分离前和分离后细胞悬液中的绝对细胞计数计算得出，分别使用密度梯度法（方块，深色柱）和磁珠法（圆形，空白柱）进行分离（n = 8）。ns = 无显著性差异，*p &lt; 0.05，由非配对t检验确定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件1：密度梯度实验方案。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%201_editedv2.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：PBS 中 0.1 M EDTA（pH 8.0）的配制。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%202_editedv2.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件3：生成代表性数据所执行的详细步骤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66887/Supplementary%20File%203_editedv2.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案详细介绍了用于生物样本库建设及其他用途的、与高通量自动化兼容的人类外周血单个核细胞分离方法。

外周血单个核细胞（PBMCs）是一类包含单核细胞和淋巴细胞的异质性细胞群体。冻存的PBMCs在……中具有稳定的存活率。

分离外周血单个核细胞（PBMCs）通常是一个耗时且依赖手工操作的过程。我们发现了一种替代方法，可快速实施并能够处理大量样本。本方案提供了一种自动化高通量的方法，在确保实验一致性的同时，避免技术人员过度疲劳。我们还详细介绍了在设备停机期间可使用的中等通量自动化兼容方法。这种中等通量方案为其他实验室提供了一种更具成本效益的替代选择。现在，生物样本库可以用相同数量的技术人员处理更多的样本。这将增加样本采集的数量及其多样性，从而支持未来的研究并改善患者护理。首先，在室温下轻轻倒置10毫升全血试管10次。使用水平转子，在22摄氏度下以800 ×g离心10分钟，离心时开启刹车。然后将样品放入生物安全柜中，观察是否存在三层明显分离的液体。用字母 A、B 和 C 标记三支 5 毫升聚苯乙烯管。轻轻旋转混匀后，用吸管吸取 1 毫升白膜层液体，转移至标记为 A 的管中。向含有白膜层的 A 管中加入 60 微升 0.1 摩尔的 EDTA。向 A 管中加入 50 微升混合液。用移液器上下吹打至少三次以充分混匀，并在室温下孵育 5 分钟。随后，向 A 管中加入 890 µL PBS，并通过移液至少吹打混匀三次。接着，将磁珠管涡旋振荡 30 秒。向 A 管中加入 50 µL 磁珠，移液至少三次，充分混匀磁珠。立即将A管放入磁力架中，室温孵育5分钟。然后小心吸取富集的细胞悬液至B管，收集无或极少红细胞的澄清部分，以获得最佳的外周血单个核细胞（PBMC）回收效果。随后，从磁力架上取下A管并弃去。接下来，向B管中的细胞悬液加入50 µL磁珠，吹打混匀至少3次。立即将B管放入磁力架中，室温孵育5分钟。小心吸取上清液（富集后的细胞悬液）至C管，仅收集澄清部分。将管B从磁力架上取下并弃去。立即将管C放入磁力架中，在室温下孵育5分钟。小心地用移液器将富集的细胞悬液转移至已标记的离心管中，并用PBS补至2 mL。将50微升细胞悬液转移至自动细胞计数仪的样品杯中。加入450微升PBS，进行1:10稀释的细胞计数。首先，将两个14毫升试管标记为A和B，一个15毫升离心管标记为C，另一个15毫升离心管标记为废液管。离心全血后，收集并取1 mL制备好的白膜层加入A管中。向A管中加入60 µL 0.1 M EDTA。然后将磁珠管涡旋振荡30秒。开启自动化PBMC仪器时，打开仪器前方的电源开关。在仪器的主界面上，选择“Profile”并选择所需的程序。然后输入起始体积，并对每个样本重复此操作。选择将使用相同试剂盒的所有象限。接下来，按照全自动PBMC仪器屏幕上的指示，将标记好的耗材、滤芯吸头和缓冲液容器装入仪器转盘的每个象限中。加载完成后，取下耗材和试剂的盖子，并在仪器屏幕上选择运行。运行结束后，选择卸载并从仪器的旋转盘中取出样本。转移500 µL细胞至样品杯中，用于无需稀释的细胞计数。与手动方法相比，自动化的磁珠法在细胞活力或总细胞数方面均未发现显著差异。手动方法在43分钟内处理了8个样本，而自动化方法共耗时57分钟，其中包括35分钟的无需手动操作的时间。在5天内处理的外周血单个核细胞（PBMCs）平均细胞活力高于90%，在10天内处理的样本则高于75%。与24小时内处理的样本相比，5天后PBMC的平均得率下降了50%。

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科研

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Biology

生物学

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