阐明小麦细胞壁防御机制中针对麦长管蚜（Diuraphis noxia）侵害的β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶的理化特性

本研究旨在阐明过氧化物酶和β-1,10-葡聚糖酶在俄罗斯麦蚜侵染期间被诱导产生的生化功能。我所提到的这些酶是近期研究中引人关注的新发现，因为它们在俄罗斯麦蚜与植物互作过程中能够修饰植物细胞壁。正因如此，这些酶可抑制害虫在抗性品系中的取食行为。

本研究属于育种前计划的一部分，表明生物化学在植物效应中具有重要作用。目前生产上面临的主要挑战是俄罗斯麦蚜生物型的演化问题。

目前我们已发现俄罗斯麦蚜一至五共五个生物型。其中五型生物型的致病性最强，因为它能够克服商业小麦品种中由 Dn 基因提供的全部抗性。因此，这意味着我们需要制定综合策略，结合生物化学、育种和杀虫剂手段，以保护小麦。

我们发现这种酶属于过氧化物酶。将IWF从细胞基质中提取出来对我们而言至关重要，这样我们才能观察到β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶与细胞壁相连或结合于细胞壁，并在细胞中发挥功能。具体如下：过氧化物酶介导木质素与碳水化合物之间的交联，而β-1,3-葡聚糖酶则调控胼胝质的沉积，从而使植物具有更强的抗性。

我们实验室开发的方法可用于从细胞壁的质外体区域提取β-1,3-葡聚糖酶以及过氧化物酶。该方法可应用于植物生长发育以及植物与病虫害互作相关领域的研究。此外，还可进一步研究IWF，以发现可能影响血液易感性的新型缺陷蛋白。

首先，用蒸馏水将小麦叶片片段冲洗两次，以去除切口处可能存在的细胞质污染。将叶片片段插入含有提取缓冲液的厚壁玻璃管中。使用水流抽气泵。

抽真空浸润5分钟，使叶片充分吸收提取缓冲液。将叶片从玻璃管中取出，用纸巾吸干。将干燥的叶片垂直插入已装有带孔圆盘的预冷离心管中。

在4 °C条件下，以500 ×g离心叶片10分钟。使用100 µL移液器将上清液转移至预冷的1.5 mL微量离心管中。将收集的上清液于-20 °C保存，直至使用。

首先，将所需的实验材料放置在工作平台上。使用研钵和研杵在液氮中将小麦叶片残渣研磨成细粉。取约 200 毫克的粉末状叶片组织，转移至含有 4 毫升提取缓冲液的研钵中。

将混合物置于冰上孵育3分钟，然后在4°C条件下以10,000 G离心15分钟。收集含有总蛋白提取物的上清液至新的微量离心管中。取200微升酶提取液和300微升溶于50毫摩尔柠檬酸钠缓冲液中的底物，加入1.5毫升离心管中。

将反应混合物置于干燥加热金属块中，在 37 摄氏度下孵育 24 小时。第二天，在 100 摄氏度下加热反应管 5 分钟以终止反应。然后在 4 摄氏度下以 10,000 G 离心 10 分钟。

取300微升上清液与600微升3,5-二硝基水杨酸加入一个新的1.5毫升离心管中，混匀后在100摄氏度下煮沸5分钟。冷却至室温后，用分光光度计在540纳米处测定吸光度。

利用葡萄糖标准曲线测定酶活性。然后使用给定公式将酶活性转换为比活性，单位为每小时每毫克蛋白质产生的葡萄糖微摩尔数。向Q vet中加入30微升酶提取液、30微升1%过氧化氢和970微升5毫摩尔的乙二醇。

使用分光光度计的动力学模式，监测在 470 纳米处吸光度的变化。确定曲线呈线性部分的斜率，并将其用作吸光度值。计算平均吸光度，然后利用乙二醇的摩尔消光系数计算过氧化物酶活性，并以每分钟每毫克蛋白质所生成的四乙二醇微摩尔数（μmol/min/mg 蛋白质）表示酶活性。

向1.5毫升微量离心管中加入200微升酶提取物和300微升底物。将反应混合物在25和40摄氏度下孵育8小时。孵育结束后，在4摄氏度下以10,000 ×g离心β-1,3-葡聚糖和MLG的反应混合物10分钟。

取300微升上清液与600微升三硝基水杨酸试剂加入新的1.5毫升离心管中混匀，然后在100摄氏度下煮沸5分钟。对于β-1,4-葡聚糖，在终止反应后，加入800微升无水乙醇稀释混合物，并在4摄氏度下以10,000 ×g离心10分钟。

然后将上清液转移至定量管中。使用分光光度计在590纳米波长处测定吸光度，并计算β-1,3-葡聚糖酶在β-1,4-葡聚糖上的活性。将5毫升酶提取液转移至10千道尔顿的浓缩膜过滤器中。

在4 °C条件下，以15,000 G离心提取物30分钟。取20 µL上清液，分别与40 µL Le Minor戊糖、Le Minor四糖、Le Minor三糖和Le Minor生物素在40 °C孵育16小时。孵育结束后，将混合物在100 °C煮沸5分钟以终止反应。

在硅胶板上对应的标记点处，将反应混合物重复点样三至五次，每次3微升。将硅胶板带有样品点的一面朝下，轻轻放入含有流动相的薄层色谱展开槽底部。约两小时后，将硅胶板轻轻浸入显色溶液中，持续五秒。

将平板在室温下干燥，然后在100摄氏度加热7至10分钟，或直至出现蓝紫色斑点。在受WASA 2侵染且对GALA DNA 5具有抗性的样品中，β-1,3-葡聚糖酶（MLG特异性β-葡聚糖酶）和过氧化物酶的比活性升高，表明这些酶参与了防御反应。β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶均表现出相似的最适pH条件，其中MLG特异性β-葡聚糖酶在碱性pH条件下比β-1,3-葡聚糖酶更稳定。

热稳定性实验确认β-1,3-葡聚糖酶在高达50°C时仍具有耐受性。该β-1,3-葡聚糖酶对Le Minor寡糖的作用模式表明，其对感染GALA DNA1和GALA DNA5的较长寡糖具有更高的水解能力。