Name: 使用分离的工作大鼠心脏模型测试供体心脏保存策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 了解离体工作大鼠心脏模型在测试供体心脏保存策略中的应用。该方法通过测量主动脉流量和心输出量等功能指标，评估硝酸甘油和促红细胞生成素等保存液补充策略的效果，为心脏移植的临床转化提供重要依据。

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本研究所述工作已获得澳大利亚国家卫生与医学研究委员会、圣文森特诊所基金会以及新南威尔士州卫生心血管研究能力高级研究员拨款向 P.S Macdonald 提供的资助。

所有动物均按照澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（National Health and Medical Research Council, Australia）的指导原则接受人道护理。所有动物实验程序均经加文医学研究所动物伦理委员会（Garvan Institute of Medical Research, 澳大利亚悉尼）批准。
1. 克雷布斯-亨塞莱特（KH）缓冲液的制备
<ol>
	<li>配制2 L含有2.36 M NaCl、0.094 M KCl、0.024 M MgSO4、0.024 M KH2PO4的20x KH缓冲液母液。分装至50 mL离心管中，于-20 °C保存。</li>
	<li>实验前，准备两个2 L的锥形瓶，分别装有1x KH缓冲液，每瓶包含1900 mL去离子水、100 mL 20x储存液KH缓冲液、4.20 g NaHCO3（25 mM）和3.96 g葡萄糖（11 mM）。
	<ol>
		<li>将缓冲液锥形瓶置于37 °C水浴中，通过气石（带滑入式进气滤器）以碳酰气（95%氧气，5%二氧化碳，流速设定为2 L/min）通气5分钟，然后加入2.8 mL 1 M CaCl2（1.4 mM）。实验开始前继续持续鼓泡至少1小时。&#160;使用气石有助于缓冲液均匀充氧。</li>
		<li>取少量缓冲液（约50 mL）放入金属圆盘中，置于-20 °C冷却，形成一层冰冻缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 灌注回路的准备
<ol>
	<li>确保所有管路和玻璃器皿清洁，无可见的微生物生长或污染。</li>
	<li>根据 1 cm H2O 相当于 1.36 mmHg 的换算关系，调节玻璃腔室的高度以达到所需的灌注压力：Langendorff 灌注端至心脏 100 cm（约 75 mmHg），预负荷工作侧至心脏 15 cm（约 11 mmHg），心脏至后负荷腔室 100 cm（约 75 mmHg）。</li>
	<li>在心脏灌注开始前至少 10 分钟启动循环热水，对整个管路系统进行预热。</li>
	<li>将微纤维滤膜（1.2 µm）放入滤器支架中，并牢固固定。</li>
	<li>用 KH 缓冲液预充管路系统，确保排尽所有空气，并使用流量控制夹调节 Langendorff 侧的流速（图 1A，B），使其约为 50 mL/min。较低的流速有助于主动脉插管操作，并防止在结扎前心脏移位。通过 T 型管连接口将温度计置入管路中，监测缓冲液温度，维持在约 37 °C。</li>
</ol>
3. 设置 Lab Chart（数据分析）软件
<ol>
	<li>在打开数据分析软件之前，确保 Powerlab（数据采集系统）和流量计已开启并连接到计算机。</li>
	<li>新建一个文件。</li>
	<li>通过选择 设置 下拉菜单并点击 通道设置 来配置数据采集。选择 主动脉压力、主动脉血流 和 心率（图 2A）。</li>
	<li>按照 图 2B 所示的参数设置每个通道。</li>
</ol>
4. 大鼠心脏分离的动物准备
注意：以下概述了用于冷静态保存的非DBD和非DCD大鼠心脏的离体与灌注方法。无论采用何种捐献方式，将心脏连接至灌注回路的操作步骤均大致相似。DBD与DCD大鼠心脏捐献方案的主要差异出现在动物麻醉生效后至心脏从动物体内被切除的这段时间内。
<ol>
	<li>称量动物体重，确保其体重 &#62;330 g。雄性大鼠的理想体重范围为 330–420 g。</li>
	<li>腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）。根据足底反射（趾捏反射）和眨眼反射的消失，确认达到充分的外科麻醉深度。</li>
	<li>将动物置于仰卧位，用胶带固定四肢。通过鼻罩向动物供给氧气。</li>
	<li>在解剖操作台处准备好盛有冰泥的KH缓冲液金属容器以及另一个装有冰的小型金属容器。将一块7.5 cm × 7.5 cm的纱布浸入KH缓冲液中，并放置于装有冰的容器上。</li>
	<li>确认达到充分的外科麻醉深度后，剃除手术切口部位的皮肤毛发，并使用碘伏或70%酒精等无菌溶液清洁皮肤。在腹部做一侧向切口（剖腹手术），将胃和肠推向一侧，以暴露左侧肾静脉。注射1500 IU肝素，并对注射部位施加压力直至出血停止。给予1–2分钟时间使肝素循环分布，然后再进行心脏获取操作。</li>
	<li>通过剪开两侧肋骨并横切膈肌来打开胸腔。在沿降主动脉剪切时，小心握住并提起心肺组织块，同时确保主动脉弓完整保留。这将保留足够长度的主动脉以供插管使用。</li>
	<li>在麻醉状态下，通过摘除心脏和肺使大鼠安乐死。将心肺组织块浸入KH缓冲液冰泥中，使心脏停搏。</li>
</ol>
5. 将心脏插管连接至离体工作心脏灌注系统
<ol>
	<li>将心肺组织块转移至置于冰上的纱布。剥离主动脉周围的多余脂肪，修剪主动脉至保留3-5 mm长度以用于插管，并在肺动脉处做一个约1-2 mm的小切口，以提供冠状静脉流出液的通路。</li>
	<li>将修剪后的心肺组织块（仍置于冰上）直接放置于插管下方。通过调节Langendorff侧的流量控制夹来调整流速，以便进行主动脉插管。小心地将主动脉套入左侧插管，用黑色夹子固定，并用2-0丝线结扎。</li>
	<li>通过完全打开流量控制夹来增加Langendorff灌注的流量。打开后负荷夹。确保Langendorff灌注腔内有持续流动。使用软件开始监测心脏活动。 
	注意：若流量计显示的主动脉流量值&#60;10 mL/min，应确认肺动脉切口是否足够大。主动脉流量过低也可能提示主动脉插管插入过深。</li>
	<li>调整心肺组织块位置，使肺的前表面朝向操作者。用2-0丝线结扎左肺叶，并切除多余的左肺组织。用一根2-0丝线一次性结扎其余肺叶并切除肺组织。旋转心脏，使结扎的肺叶朝向背部。</li>
	<li>使用小型Vannas剪刀，剪除左心耳约2-3 mm边缘，确保形成通向心房的小开口。小心地将左心耳套入左侧插管，用黑色夹子固定，并用2-0丝线结扎。图3A展示了两个插管的放置位置。</li>
	<li>调整心脏腔室的水夹套，使心脏位于腔室中心。</li>
	<li>将压力传感器与空气相通，在软件中选择主动脉压力下拉菜单&#62; Bridge Amp &#62; Zero，对压力传感器调零。点击确定。</li>
	<li>以Langendorff模式灌注心脏10分钟。确保Langendorff主动脉流量维持在10-20 mL/min之间（理想值为20 mL/min）。</li>
	<li>在切换至工作模式前，确保将Langendorff KH缓冲液储液瓶中的通气石（滑入式进气滤器）转移至工作模式KH缓冲液储液瓶中。</li>
	<li>通过关闭通向主动脉插管的大夹子，并打开通向左心耳的流路，将心脏切换至工作模式。打开通向工作灌注液的三通阀。将共用回流管（将KH缓冲液返回储液瓶）从Langendorff储液瓶转移至工作模式储液瓶。</li>
	<li>以工作模式灌注心脏15分钟。理想情况下，15分钟灌注结束时主动脉流量应&#62;30 mL/min。待心脏状态稳定后，开始在数据分析软件中记录数据。</li>
	<li>在灌注1分钟、5分钟、10分钟和15分钟时测量冠状静脉流出液（冠状流量）。 
	注意：冠状流量应维持在10-20 mL/min之间。若冠状流量超过22 mL/min，通常提示存在未结扎的肺血管漏液。心率应维持在200-300 bpm之间。冠状静脉流出液可收集用于后续组织损伤标志物分析（如肌钙蛋白I、乳酸脱氢酶释放量）。</li>
</ol>
6. 心脏冷静态保存期间停跳液的灌注
<ol>
	<li>将指定的心脏保存液（可添加或不添加补充成分）50 mL注入停搏液腔（置于60 cm高度，以产生约40 mmHg的灌注压力）。</li>
	<li>降低水浴夹套，并关闭工作模式侧的三通阀。</li>
	<li>关闭夹子，停止向左心房插管的液体流动。</li>
	<li>打开主动脉插管的液体通路。</li>
	<li>关闭Langendorff侧和后负荷侧的夹子。</li>
	<li>打开停搏液管路的夹子，从压力管路中冲洗出15 mL停搏液。&#160;关闭压力&#160;管路上的阀门。</li>
	<li>使停搏液经由主动脉插管灌注心脏，并收集冠状窦流出液。持续灌注停搏液3分钟，并记录所给予的停搏液体积。</li>
	<li>在软件中停止数据记录，并保存文件。</li>
	<li>3分钟后，关闭停搏液管路的夹子以及通向主动脉插管的小型蓝色夹子。</li>
	<li>在主动脉插管上放置一个血管夹，同时在左侧插管上放置第二个血管夹。将心脏-插管组件从回路中断开，并放入盛有停搏液的烧杯中，置于冰盒内（图3B，C）。</li>
	<li>将心脏置于冰箱中保存6小时（或按所需冷保存时间）。</li>
</ol>
7. 冷静态保存后心脏再灌注
<ol>
	<li>按照第1节制备KH缓冲液。</li>
	<li>按照第2节启动灌流回路。</li>
	<li>打开基线灌流保存的文件。</li>
	<li>小心地将心脏-套管组件从冰盒中取出，并固定到灌流回路上。在重新连接主动脉套管前，使用装有KH缓冲液的钝头18 G注射器排出套管内的空气。先连接主动脉套管，打开Langendorff侧的管夹，并确保后负荷管路的管夹处于打开状态。</li>
	<li>重新连接左心房套管，连接至灌流回路前确保套管内无空气。在切换至工作模式前，保持工作侧管夹关闭。</li>
	<li>以Langendorff模式灌流心脏15分钟。在Langendorff再灌流开始时，务必开始记录数据。</li>
	<li>在切换至工作模式前，将两个通气石放入KH缓冲液中，打开工作侧三通阀，并将共用回流管转移至工作模式储液器。</li>
	<li>关闭白色Langendorff管夹，打开白色工作侧管夹，继续灌流心脏30分钟。在指定时间点测量并收集冠状窦流出液，用于后续分析（如心肌损伤标志物）。务必停止并重新开始软件记录以创建新数据段（或添加注释）。</li>
	<li>在工作模式再灌流约15分钟时，关闭三通阀。</li>
	<li>再灌流结束后，保存数据文件，停止回路中的灌流，并拆下心脏组件。采集左心室组织样本，用于组织学处理和/或快速冷冻保存以备后续研究（如用于Western blot的蛋白提取）。</li>
	<li>从滤器支架上取下滤膜，排空回路中的缓冲液，并用5 L蒸馏水冲洗两次。 
	注意：虽然非必需，但将大量蒸馏水预先在水浴中预热有助于操作。</li>
</ol>
8. 功能恢复的分析
<ol>
	<li>打开 LabChart 文件。</li>
	<li>选中至少 30 秒的记录区域，然后点击 Command &#62; Add data selection OR Multiple add to data。这会将所需参数添加到软件内的 DataPad 文件中。</li>
	<li>选择 Window 下拉菜单 &#62; DataPad。</li>
	<li>从 DataPad 中选中并复制恢复值至电子表格，用于功能恢复分析。将功能恢复计算为其相应基线值的百分比1,6,7。</li>
</ol>

Optimization of Donor Heart Preservation Using a Working Rat Heart Perfusion Model

<ol><li>Kwan, J. C., Gao, L., Macdonald, P. S., Hicks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardio-protective+signalling+by+glyceryl+trinitrate+and+cariporide+in+a+model+of+donor+heart+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung+Circ%22%5BJournal%5D)">Cardio-protective signalling by glyceryl trinitrate and cariporide in a model of donor heart preservation.</a> Heart Lung Circ. 24 (3), 306-318 (2015).</li>
<li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+preservation+of+the+rat+heart+after+prolonged+hypothermic+ischemia+with+erythropoietin-supplemented+Celsior+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Enhanced preservation of the rat heart after prolonged hypothermic ischemia with erythropoietin-supplemented Celsior solution.</a> J Heart Lung Transplant. 32 (6), 633-640 (2013).</li>
<li>Chew, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcomes+of+donation+after+circulatory+death+heart+transplantation+in+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Outcomes of donation after circulatory death heart transplantation in Australia.</a> J Am Coll Cardiol. 73 (12), 1447-1459 (2019).</li>
<li>Dhital, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+heart+transplantation+with+distant+procurement+and+ex-vivo+preservation+of+donor+hearts+after+circulatory+death%3A+a+case+series%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series.</a> Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).</li>
<li>Joshi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+from+DCD+donors+in+Australia%3A+Lessons+learned+from+the+first+74+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation from DCD donors in Australia: Lessons learned from the first 74 cases.</a> Transplantation. 107 (2), 361-371 (2023).</li>
<li>Villanueva, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+recovery+after+dantrolene-supplementation+of+cold+stored+hearts+using+an+ex+vivo+isolated+working+rat+heart+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional recovery after dantrolene-supplementation of cold stored hearts using an ex vivo isolated working rat heart model.</a> PLoS One. 13 (10), e205850(2018).</li>
<li>Villanueva, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardioprotective+potential+of+the+sodium-glucose+cotransporter+2+inhibitor+empagliflozin+in+donor+heart+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">The cardioprotective potential of the sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor empagliflozin in donor heart preservation.</a> J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1151-1153 (2020).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+the+STAT3+pathway+in+the+cardioprotective+efficacy+of+zoniporide+in+a+model+of+myocardial+preservation+-+the+rat+isolated+working+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Critical role of the STAT3 pathway in the cardioprotective efficacy of zoniporide in a model of myocardial preservation - the rat isolated working heart.</a> Br J Pharmacol. 162 (3), 633-647 (2011).</li>
<li>Cropper, J. R., Hicks, M., Ryan, J. B., Macdonald, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardioprotection+by+cariporide+after+prolonged+hypothermic+storage+of+the+isolated+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Cardioprotection by cariporide after prolonged hypothermic storage of the isolated working rat heart.</a> J Heart Lung Transplant. 22 (8), 929-936 (2003).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+functional+recovery+of+the+heart+donated+after+circulatory+death+determination+with+antemortem+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Enhanced functional recovery of the heart donated after circulatory death determination with antemortem heparin.</a> J Heart Lung Transplant. 39 (6), 607-609 (2020).</li>
<li>Villanueva, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+increasing+donor+age+on+myocardial+ischemic+tolerance+in+a+rodent+model+of+donation+after+circulatory+death%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Direct%22%5BJournal%5D)">The effect of increasing donor age on myocardial ischemic tolerance in a rodent model of donation after circulatory death.</a> Transplant Direct. 7 (6), e699(2021).</li>
<li>Kumarasinghe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+heart+function+from+older+donors+using+pharmacologic+conditioning+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Improved heart function from older donors using pharmacologic conditioning strategies.</a> J Heart Lung Transplant. 35 (5), 636-646 (2016).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

鉴于心脏基础功能的敏感性，必须注意保持灌注装置的清洁，并使用兼容的组件。例如，必须使用正确的PVC管路。某些管路材料（如硅胶）可能导致主动脉流量和收缩力降低，这可能是由于氧气通过管路流失所致。尽管市面上已有独立的离体工作大鼠心脏灌注回路，但大多数此类系统主要用于兰格多夫（Langendorff）灌注。通常，在兰格多夫灌注模型中，可通过将球囊导管插入左心室来获取左心室舒张末期压力（LVDP）的功能测量值。然而，在兰格多夫灌注系统中无法直接测量原始主动脉流量和心输出量。离体工作大鼠心脏（IWRH）方案的一个主要优势在于，无需对心脏进行额外干预（如插入球囊导管），即可获得主动脉流量和心输出量的功能测量数据。目前存在商用的大鼠工作心脏灌注系统，尽管这些系统可根据具体研究需求进行定制，但通常成本较高。
在灌注过程中，为确保啮齿类动物心脏的最佳基础功能，实验方案中存在若干关键步骤。KHB缓冲液的储备溶液配制时间不得超过4周。灌注管路在预充时必须完全排除任何气泡。插管左心耳时需格外小心。过度操作组织可能增加撕裂风险，同时也可能加重心脏的功能性应激反应。
IWRH 灌注回路的性能质量通常可通过心脏获得的基线读数来确定（AF &#62; 30 mL/min，CF 约为 20 mL/min）。在 CSS 模型中，可通过将心脏停搏并保存在添加了 1 µmol/L 锌尼普利（zoniporide）和 0.1 mg/mL 硝酸甘油（glyceryl trinitrate）的 Celsior 保存液中，进一步进行质量控制检测。使用添加硝酸甘油和锌尼普利的 Celsior 溶液进行停搏，可确保 Langendorff 再灌注后立即恢复，并在 6 小时冷保存后实现 40–60% 的最终功能恢复。如果对灌注装置的性能是否良好存在疑问，该质量控制补充方案可用于测试验证。
关于利用循环死亡后捐献获取的啮齿类动物心脏的方法已有先前描述10,11。简言之，大鼠经麻醉后，对其颈动脉进行插管并获取压力读数。通过颈动脉插管注入肝素（500 IU）。结扎气管以启动生命支持撤除。当达到所需的热缺血时间后，可将心脏切除并连接至灌注回路。为向DCD心脏灌注保存液，通过回路中的压力管路以约20 mL/min的速度将60 mL保存液经主动脉冲洗。结扎肺血管，剥离肺组织，插入左心插管，再通过压力管路冲洗40 mL保存液。随后按照上述方案对心脏进行灌注。功能恢复以功能性血流动力学的原始数值表示，统计分析通过将这些数值与假手术组心脏（无DCD处理，但在灌注装置上进行冲洗）的数值进行比较而完成。
关于使用脑死亡后获取的啮齿类动物心脏的方法已有先前描述12。简而言之，动物接受麻醉、气管插管和通气，并按照DCD啮齿类动物方案进行血流动力学监测。在颞顶骨部位钻孔，将一根3F取栓导管置于硬脑膜下。假手术对照组动物仅钻孔，不插入导管。随后在2分钟内向球囊注入0.3 mL水使其膨胀，并维持膨胀状态1小时。经过1小时的血流动力学观察后，取出心脏并连接至离体工作心脏灌注系统，记录基线数据，给予心脏停搏液，随后按上述方法进行低温保存。
使用IWRH灌注回路的主要局限性在于无法使用基于血液的灌注液在系统中循环。由于无法获取足量的啮齿类动物血液加入灌注液中，因此基于血液的灌注不可行。可能需要开展其他替代模型研究，例如啮齿类异位心脏移植或大型动物原位心脏移植实验，以评估基于血液的灌注的影响。然而，这些替代方法需要具备显微外科技术经验，以及大型动物手术设施，并需要有经验的麻醉师、灌注师和心胸外科医生参与。

心脏移植的成功在很大程度上受到供体心脏保存方法的影响。供体心脏在器官获取、运输和移植过程中会经历缺血性损伤。通过选择合适的供体心脏保存策略，可以减轻供体器官所受的缺血性损害。冷静态保存（CSS）目前仍是供体心脏保存最可行且最常用的方法；然而，CSS并不一定适用于所有类型的心脏捐献途径。例如，通过循环死亡后捐献（DCD）途径获取的心脏需使用常温机械灌注进行维持和活力评估，而通过脑死亡后捐献（DBD）途径获取的心脏则可采用CSS或低温机械灌注进行保存。另一个影响保存策略选择的重要因素是心脏在器官获取和运输过程中所经历的热缺血时间（对于DCD）或冷缺血时间（对于DBD）的长短。
许多中心采用额外的药物补充方法来增强心脏保存液的效果，以提高心脏对缺血的耐受性并改善移植后的心脏功能。本实验室的啮齿类动物研究表明，在心脏停搏液中添加促红细胞生成素（erythropoietin）和硝酸甘油（glyceryl trinitrate）可显著改善供体心脏在长时间低温保存后的 cardiac functional recovery1,2。这些研究随后推进至猪的供体心脏保存实验，为将促红细胞生成素和硝酸甘油加入通过常温机械灌注（normothermic machine perfusion）途径获取的DCD供心的心脏停搏液中提供了临床前基础3,4,5。目前，澳大利亚的移植单位在临床DBD心脏获取过程中结合冷静态保存（CSS）时，也已常规使用促红细胞生成素和硝酸甘油的补充方案。下文所述的离体工作大鼠心脏（IWRH）灌注方案的总体目标是在实验室环境中评估供体心脏保存策略，并检验其在再灌注后维持供体心脏功能的有效性。本实验室已使用该离体工作大鼠心脏方案超过二十年，实践证明其在筛选可能改善供体心脏保存效果的补充剂和/或策略方面极为有效2,7,8,9。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 无色 Eppendorff 管，每盒 1000 个</td><td>Bio Strategy Pty Ltd</td><td>0030.125.150</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管（S）套/25 个聚丙烯箱/500 个</td><td>Sigma-aldrich Pty Ltd</td><td>CLS430791-500ea</td><td></td></tr><tr><td>血压换能器/电缆套件</td><td>ADInstruments</td><td>MLT1199</td><td>数据采集</td></tr><tr><td>桥式放大器</td><td>ADInstruments</td><td>FE221</td><td>数据采集</td></tr><tr><td>Carbogen 555G2</td><td>BOC</td><td>BOC002</td><td></td></tr><tr><td>Checktemp1 温度计</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI98509</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>夹钳，夹持直径 1/4-7/16 英寸，12 个/包</td><td>Thomas Scientific</td><td>2848Y40</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>带延长杆中号夹钳</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847T08</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>带延长杆小号夹钳</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847T02</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>血管夹，60 g 压力</td><td>Coherent Scientific</td><td>14121</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>封闭式连接器</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847E25</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>Covidien Sofsilk 2-0 黑色预剪 45 cm，每盒 24 根</td><td>Specialist Medical Supplies</td><td>S195</td><td>手术耗材</td></tr><tr><td>定制 250 mL 夹套式脱气装置</td><td>Custom Blown Glassware Pty Ltd</td><td>N/A</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>定制 750 mL 储液罐</td><td>Custom Blown Glassware Pty Ltd</td><td>N/A</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖无水物 SigmaUltra</td><td>Sigma-aldrich Pty Ltd</td><td>G7528-1Kg</td><td>用于配制 Krebs 缓冲液</td></tr><tr><td>双通道控制台</td><td>ADInstruments</td><td>TS402</td><td>数据采集</td></tr><tr><td>2 L 锥形瓶&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微孔滤膜，GF/C 型玻璃纤维，47 mm，100 片</td><td>Bio-strategy Pty Ltd</td><td>1822047</td><td></td></tr><tr><td>镊子，15 cm，0.3 mm，弯型</td><td>Coherent Scientific</td><td>14114</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>四爪夹钳，臂长 9 mm × 115 mm，用于夹持直径 2–70 mm 的物体，表面覆乙烯基</td><td>Met-App Australia Pty Ltd</td><td>1352</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>加热循环器，数字固态控制（1020 瓦/240 伏）</td><td>Thermoline Scientific</td><td>TU3</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>肝素 5000 U/5 mL，每盒 50 支，Pfizer 02112115</td><td>Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd</td><td>1258693</td><td>药品</td></tr><tr><td>Ilium Xylazil 20 注射液 50 mL</td><td>Cenvet Australia Pty Ltd</td><td>X5010</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>约翰·霍普金斯 Bulldog 夹</td><td>Coherent Scientific&amp;nbsp;</td><td>CS-WPI-14117</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮 100 mg/50 mL</td><td>Provet (NSW) Pty Ltd</td><td>KETAI1</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁 AR 级 500 g Chemsupply</td><td>Bio Strategy Pty Ltd</td><td>MA048-500g</td><td>用于配制 Krebs 缓冲液</td></tr><tr><td>公/母铰接式适配器</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847V08</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 易装泵头，用于精密管路，PPS 材质，CRS 转子</td><td>John Morris</td><td>1015164</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>梅岑鲍姆剪刀，11.5 cm 弯型</td><td>Coherent Scientific</td><td>WPI-501748</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>梅岑鲍姆剪刀，14.5 cm 直型</td><td>Coherent Scientific</td><td>WPI-501252</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>双头泵用不锈钢安装硬件</td><td>John Morris</td><td>1014414</td><td>泵头安装螺丝</td></tr><tr><td>开口式连接器</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847E05</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>样品处理</td></tr><tr><td>氯化钾（AnalaR NORMAPUR）500 g</td><td>VWR Chemicals&amp;nbsp;</td><td>26764.26</td><td>用于配制 Krebs 缓冲液</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Pty Ltd</td><td>P5379-500g</td><td>用于配制 Krebs 缓冲液</td></tr><tr><td>Powerlab 2/26，双通道记录仪 + Labchart 软件</td><td>ADInstruments</td><td>ML826</td><td>计算机硬件与软件</td></tr><tr><td>Precision XN 内联流量传感器，3.2 mm（1/8&quot;）内径 ME4PXN-KR37 XF</td><td>ADInstruments</td><td>ME4PXN</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>一次性手术刀柄及刀片 #11，10 个/包</td><td>BSN Medical (Aust) Pty Ltd</td><td>73252-36</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex 47 mm 硅胶垫圈，5 个/包</td><td>Merck Millipore</td><td>SX0004701</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>硅胶 O 型圈 5-329，10 个/包</td><td>Merck Millipore</td><td>XX1104707</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>单 buret 夹</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847T32</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>插入式进液滤器，孔径 10 &amp;micro;m（鼓泡器）</td><td>Sigma-aldrich</td><td>59277</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>小型 360° 旋转连接器</td><td>Thomas Scientific</td><td>8847E35</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich Pty Ltd</td><td>S6297 - 250g</td><td>用于配制 Krebs 缓冲液</td></tr><tr><td>Swinnex 滤器支架，47 mm</td><td>Merck Millipore</td><td>SX0004700</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>1 mL 注射器，每盒 100 支</td><td>Becton Dickinson Pty Ltd</td><td>302100</td><td></td></tr><tr><td>三爪夹钳，臂直径 9 mm，臂长 125 mm，带双螺钉，用于夹持 5–80 mm 物体</td><td>Met-App Australia Pty Ltd</td><td>1356</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>管路流量计模块 TS410</td><td>ADInstruments</td><td>TS410</td><td>数据采集</td></tr><tr><td>PVC 管，内径 6.35 mm × 外径 9.52 mm，50 英尺卷（15.24 m），透明，不含 DEHP 邻苯二甲酸盐，食品级，符合 REAC 标准</td><td>Thermo Fisher</td><td>NAL 8701-0600</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>PVC 管，内径 7.94 mm × 外径 11.1 mm，50 英尺卷（15.24 m），透明，不含 DEHP 邻苯二甲酸盐，食品级，符合 REAC 标准</td><td>Thermo Fisher</td><td>NAL 8701-0900</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>PVC 管，内径 9.52 mm × 外径 12.7 mm，100 英尺卷</td><td>Thermo Fisher</td><td>NAL 8701-4120</td><td>装置构建</td></tr><tr><td>Vannas 剪刀，8.5 cm，直型，7 mm 刀片</td><td>Coherent Scientific</td><td>WPI-500-086</td><td>手术设备</td></tr><tr><td>30 升水浴锅，带悬浮托盘</td><td>Thermoline Scientific</td><td>TLWB-30</td><td>装置构建</td></tr></tbody></table>

使用离体工作大鼠心脏模型评估供体心脏保存策略

Using an Isolated Working Rat Heart Model to Test Donor Heart Preservation Strategies

优化供体心脏保存液在器官获取、运输和移植过程中对减少供体心脏缺血-再灌注损伤具有关键作用。本实验室先前的研究表明，在供体心脏保存液中添加硝酸甘油和促红细胞生成素可显著改善长时间冷保存以及循环死亡后捐献心脏的心脏功能恢复。该补充方案已在澳大利亚、比利时和英国的移植中心投入临床使用。本文概述了一种利用离体心脏灌注模型测试保存液补充策略的实验方案 离体 离体工作大鼠心脏（IWRH）灌注回路。利用该方法，可在长时间冷静态保存、脑死亡后捐献及循环死亡后捐献等供体心脏保存情境下，测试不同的补充干预策略。通过主动脉流量、冠状动脉流量、心输出量、脉压和心率等指标评估心脏功能恢复情况，可用于判断特定保存策略是否能够减轻供体心脏的缺血-再灌注损伤。

基础灌注的结果将决定初始实验（储存前）是否成功。在Langendorff模式下显示的主动脉流量应介于14 - 22 mL/min之间。由于主动脉为逆向灌注，流量计上显示的Langendorff流量为负值。可接受的Langendorff曲线示例见图4A。
切换至工作模式后，待心脏状态稳定，主动脉流量应至少达到30 mL/min。初始阶段流量短暂上升至约50 mL/min，随后下降至约25 mL/min，再回升至稳定的基线主动脉流量，此过程属于正常现象。当基线参数达到满意水平（主动脉流量 > 30 mL/min，冠状动脉流量10–20 mL/min，心率200–300次/分钟）时，即可进行心脏储存。良好的基线记录示例见图4B。
根据所测试的保存液不同，一些心脏在长时间低温静态保存后可能无法获得良好的恢复效果，即使其基线状态极佳。图4C展示了一个在工作模式下显示恢复不良的示例曲线。
主动脉血流的最终功能恢复可通过再灌注结束时的主动脉血流读数相对于基线值的百分比来计算。例如，若心脏的基线主动脉血流（AF）为 40 mL/min，冷静态保存后再灌注结束时的 AF 为 20 mL/min，则该心脏的 AF 恢复率为 50%。此数据表示方法的示例如图 5所示。
<img alt="离体心脏灌流装置系统示意图；用于血流分析的离体心脏位置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66910/66910fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：工作心脏灌流回路。（A）离体工作大鼠心脏灌流回路的照片。红色框标示离体心脏所处的位置。（B）离体工作心脏灌流回路的示意图，显示了Krebs-Henseleit（KH）缓冲液在回路中的流动方向，其中Langendorff模式（虚线）和工作模式（实线）的灌流路径。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66910/66910fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="用于主动脉压力数据分析的数字滤波器设置通道配置界面示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66910/66910fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：LabChart 软件设置。（A）通道设置中用于主动脉压力、主动脉血流和心率的配置。（B）使用三个通道设置的 LabChart 模板示例，右侧窗口显示各个独立通道的配置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66910/66910fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="解剖心脏模型、悬挂系统、夹具装置的静态平衡设置示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66910/66910fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：插管与心脏停搏。（A）将心脏置入水浴夹套腔室前的插管操作。左侧插管插入主动脉，右侧插管经左心耳插入左心室。肺血管已结扎，肺组织已解剖分离。（B）给予心脏停搏液后，将心脏置于盛有停搏液的烧杯中。在从装置上断开前，插管已用动脉夹夹闭。（C）心脏置于冰盒中进行长时间低温保存的示例。此处两颗心脏已保存用于再灌注。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66910/66910fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Langendorff 和工作模式心脏轨迹；实验数据；心脏功能分析；恢复结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66910/66910fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：LabChart 轨迹示例。 压力（红色曲线）、主动脉血流（蓝色曲线）和心率（绿色曲线）的记录轨迹，分别对应以下情况的心脏：（A）良好的 Langendorff 模式记录轨迹；（B）工作模式再灌注期间良好恢复；（C）工作游戏副本再灌注期间恢复不良。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66910/66910fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="佐尼波利德对心脏指标影响的柱状图；主动脉血流、冠状动脉血流、心输出量和心率的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66910/66910fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：功能恢复的代表性图示。（A）主动脉血流，（B）冠状动脉血流，（C）心输出量，以及（D）心率。本图经Gao等人8许可重复使用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66910/66910fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们描述了一种 离体 用于评估供体心脏保存策略的离体工作大鼠心脏方案。本文描述了啮齿类动物供体心脏静态冷保存的实验方案；然而，该方案也可用于循环死亡后捐献和脑死亡后捐献所获取的供体心脏。

优化供体心脏保存液在器官获取过程中对减轻供体心脏的缺血-再灌注损伤起到了关键作用，……

本研究采用离体大鼠心脏灌注系统，以验证供体心脏保存过程中补充策略的效果。我们的目标是确定能够改善供体心脏功能恢复的保存策略，特别是在长时间冷保存或循环停止后长时间温缺血的情况下。通过离体工作态大鼠心脏实验方案，初步测试了目前临床供体心脏保存策略，即在心脏保存液中添加硝酸甘油和促红细胞生成素的效果。这为在进入临床应用之前先开展猪心脏移植研究提供了理论依据。与Langendorff灌注技术相比，采用离体工作态大鼠心脏灌注方案的优势在于能够获得心脏的功能性指标，例如主动脉血流和心输出量。首先，将麻醉后的大鼠置于仰卧位。用胶带固定动物的四肢，然后在其上方安装鼻罩以给予氧气。将无菌纱布浸入盛有Krebs-Henseleit缓冲液的容器中。将浸湿的纱布置于冰上。在腹部做一横向切口后，移动胃和肠以暴露左肾静脉。注射肝素，并按压注射部位直至出血停止。待肝素循环数分钟后，从两侧切开肋骨并横穿膈肌，完全打开胸腔。小心提起心脏-肺组织块，沿降主动脉剪开，保持主动脉弓完整。将心脏-肺组织块转移至盛有冰冻克雷布斯-亨塞莱特缓冲液的容器中，以停搏心脏。首先，将新近切除的大鼠心脏-肺组织块置于冰上的纱布片中。剥离主动脉周围的多余脂肪，然后修剪主动脉，保留约三至五毫米以备插管。在肺动脉上做一个长一至二毫米的切口。将修剪好的心脏-肺组织块直接置于冰上，位于插管正下方。接下来，使用流量控制软管夹调节Langendorff侧的灌流流速，以进行主动脉插管。小心地将主动脉插到左侧插管上。用黑色夹子固定，并用2-0丝线结扎。完全打开流量控制管夹，以增加兰格多夫灌注的流量。然后打开后负荷管夹。使用软件开始监测心脏活动。调整心肺组织块，使肺的前表面朝向操作者。用2-0丝线结扎左肺叶。用2-0丝线一次性结扎其余肺叶。然后旋转心脏，使结扎的肺部朝向后方。使用一对小型Vannas剪刀，修剪左心耳约2至3毫米的一段，以在心房上形成一个小开口。小心地将左心耳插管至左侧插管中。用黑色夹子固定，并用2-0丝线缝合结扎。调整心脏腔室的水套，使心脏位于腔室中央。现在，将压力传感器与空气相通。在软件中选择主动脉压力，然后依次点击桥式放大器（bridge amp）、调零（zero）和确定（OK），以对压力传感器进行调零。以Langendorff模式灌注心脏10分钟。随后，将气石从Langendorff Krebs-Henseleit缓冲液储液罐转移至工作模式Krebs-Henseleit缓冲液储液罐中。打开来自工作灌注液的三通旋塞。关闭通向主动脉插管的大夹子，打开通向左心耳的流路，以切换至工作模式。以工作模式灌注心脏15分钟。向心脏停搏液腔内注入50毫升指定的心脏保存液。降下水套，并关闭工作模式侧的三通旋塞。关闭夹子以阻断流向左心房插管的液体流动。然后打开主动脉插管的灌流。现在关闭朗根多夫侧的夹子和后负荷侧的夹子，打开停跳液管路的夹子。从压力管路中冲出15毫升停跳液。通过主动脉插管用停跳液灌注心脏，并收集冠状静脉流出液。三分钟后，关闭停跳液夹子以及通向主动脉插管的小型蓝色夹子。在主动脉插管上放置一个鳄鱼夹，同时在左侧插管上也放置一个鳄鱼夹。将心脏插管组件从管路中断开，并将其放入盛有心脏停搏液的烧杯中，置于冰盒内。在冷静态保存后重新灌注心脏时，需在冷保存后小心地将心肺组件重新固定到灌注管路上。使用装有克雷布斯-亨塞莱特缓冲液的钝端18号注射器，排出插管中的任何空气。先连接主动脉插管，然后打开兰格多夫装置一侧的管夹。重新连接左侧插管，并在将其连接到灌流回路之前，确保插管内的空气已被排尽。在切换至工作模式之前，保持工作侧夹子处于关闭状态。主动脉流量为每分钟14至22毫升时，可获得良好的兰格多夫（Langendorff）灌注流量。切换至工作模式后，主动脉流量至少达到每分钟30毫升，有助于心脏的保存。尽管初始记录曲线良好，但部分心脏在长时间冷静态保存后仍未能实现良好恢复。

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