Name: 小鼠海马齿状回管颗粒细胞的体内钙成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 了解小鼠海马齿状回颗粒细胞的体内钙成像方法，该方案将病毒注射与GRIN透镜植入整合为单次手术，以提高神经活动记录的数据质量与准确性，助力认知神经科学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作得到上海市基础研究特区计划—复旦大学21TQ1400100（22TQ019）、上海市科技创新重大专项、临港实验室（项目编号：LG-QS-202203-09）和国家自然科学基金（32371036）的资助。

所有动物实验程序均经复旦大学机构动物护理和使用委员会批准（202109004S）。本研究中使用的小鼠均为6月龄的C57BL/6J，雌雄均有。小鼠维持在12小时光照循环条件下，光照时间为上午8点至晚上8点。DG区域病毒注射使用的坐标如下：前/后（A/P）：-2.2 mm，内/外（M/L）：1.5 mm，背/腹（D/V）：距脑表面1.7 mm。
1. 病毒注射至齿状回
<ol>
	<li>穿戴防护装备，包括一次性无菌手套和防护服。</li>
	<li>准备所需的手术器械、两管5 mL生理盐水（0.9% NaCl [无菌] 或人工脑脊液）以及两支25 G鲁尔锁钝头针。 
	注意：所有手术器械在手术前必须彻底灭菌。我们采用高温高压灭菌法（121–134 °C，20 psi）对器械进行灭菌，并使用含酒精的消毒剂喷洒表面。所有手术过程中均使用0.9%无菌生理盐水。手术期间，使用加热玻璃珠对器械进行间歇性灭菌。</li>
	<li>用清水配制10%的次氯酸钠溶液，用于消毒可能接触病毒的物品。</li>
	<li>如有需要，使用无菌生理盐水稀释AAV-CaMKIIα-GCaMP6f病毒，并将其储存在4 °C冰箱或冰上。病毒的目标终浓度为1 × 1012 GC/mL。 
	注意：为保持病毒完整性，建议避免反复冻融。为此，我们通常在收到病毒后将其分装为小体积（例如每管2 µL），并保存于-80 °C冰箱中。病毒应在解冻当天使用，不应长期储存在4 °C。</li>
	<li>使用微量移液器拉制仪将微量移液管拉至尖端细小，用手术剪剪去尖端一小部分，并用矿物油填充管内。确保移液管能正常吸液后，将其安装到注射器上。 
	注意：我们采用一步拉制法，加热器功率设置为最大功率的约60%。也可使用其他拉制仪完成此步骤。总体目标是使尖端直径约为50–100 µm；直径过小会影响液体流动，过大则可能导致小鼠脑组织损伤。</li>
	<li>开启所有仪器，包括小鼠麻醉机、体温维持装置（加热垫）和真空泵。此外，在手术前测量小鼠的体重。 
	注意：在操作过程中，我们通过肉眼观察小鼠呼吸频率，并偶尔检测其体温，以确保其状态良好。</li>
	<li>将小鼠放入含2.5%异氟烷和1 L/min氧气的气体麻醉舱中。通过监测小鼠呼吸状况评估麻醉深度。 
	注意：呼吸频率应维持在约每秒1次，以保证小鼠健康。</li>
	<li>将小鼠从气体麻醉舱中取出，并放置于立体定位仪上。</li>
	<li>在开始下一步操作前，确认小鼠已充分麻醉。通过夹捏双侧后肢足垫测试足底回缩反射。若小鼠对夹捏有反应，应追加麻醉药物，并重新测试反射后再继续操作。</li>
	<li>用面罩覆盖小鼠鼻部，将异氟烷流速设定为1.5%。使用耳杆牢固固定小鼠头部（图2A）。 
	注意：固定耳杆时应避免过紧，否则可能影响小鼠呼吸，严重时甚至导致死亡。</li>
	<li>腹腔注射地塞米松（溶于0.9%生理盐水，2 mg/kg）&#160;以预防术后炎症。同时皮下注射&#160;卡洛芬（溶于0.9%生理盐水，5 mg/kg）以减轻术后疼痛。</li>
	<li>在小鼠眼睛上涂抹眼用软膏。</li>
	<li>使用手术剪修剪小鼠头部顶部毛发，并使用脱毛膏清除残留毛发，直至皮肤完全暴露。将脱毛膏涂抹于小鼠头皮，静置约5分钟，然后用纱布擦去脱毛膏。</li>
	<li>使用棉签蘸取碘伏消毒剂和75%乙醇对无毛区域进行消毒。</li>
	<li>使用手术剪（或手术刀片）沿头皮中线做连续切口，切除部分头皮以暴露颅骨表面（图2B）。用生理盐水冲洗颅骨表面，然后使用真空泵清除筋膜和多余生理盐水。重复此过程多次，直至伤口周围停止出血。用棉签擦拭颅骨表面以保持干燥。 
	注意：去除筋膜的其他方法包括使用棉球或棉签擦拭。</li>
	<li>当人字缝和前囟清晰可见时，使用定位针调整颅骨表面。进行多次调整，直至整个头部水平（Z轴方向误差小于0.05 mm）。</li>
	<li>将针尖从前囟移动至适当的目标位置。以人字缝为参考点确定目标坐标。使用可擦记号笔标记四个点以界定病毒注射区域：A/P: -2.0 mm，M/L: -1.5 mm；A/P: -2.5 mm，M/L: -1.5 mm；A/P: -2.25 mm，M/L: -1.0 mm；以及A/P: -2.25 mm，M/L: -2.0 mm。 
	注意：本方案在同一手术中完成病毒注射和GRIN透镜植入。本协议中所有手术均在右半球进行，但理论上任一半球均可使用。在上述四点界定的注射区域内，于三个不同位置分别注射80 nL病毒。尽管三个位置为任意选择，但我们建议分散注射以促进病毒更广泛扩散，从而增加感染细胞数量。</li>
	<li>使用微型钻头在该区域进行颅骨开窗，以上述四点为边界。当脑组织可见时停止钻孔（图2C）。 
	注意：尽量缓慢钻孔。用力过大会导致钻头损伤脑组织，缓慢钻孔也有助于防止脑组织过热。</li>
	<li>使用超细镊子清除骨屑和硬脑膜，并持续用无菌生理盐水冲洗该区域。 
	注意：此步骤中少量出血属正常现象，因部分毛细血管破裂所致；只需持续用生理盐水冲洗直至出血停止即可。</li>
	<li>使用注射器控制面板推出部分矿物油，为后续装载病毒预留空间。以100 nL/s的速度向微量移液管中填充至少240 nL稀释后的病毒。 
	注意：应通过控制面板排出管内气泡，以确保微量移液管释放准确的液体体积。若多次尝试后液体体积仍不准确，应考虑更换微量移液管并重新开始。建议吸取比实际注射量更多的病毒，以避免将矿物油意外注入小鼠脑内。</li>
	<li>将微量移液管移至颅骨开窗区域上方，然后缓慢将其插入脑组织，直至达到目标Z轴深度（D/V：脑表面下1.70 mm）。 
	注意：许多参考图谱以颅骨表面作为D/V 0点。根据我们的经验，使用脑表面坐标对齿状回（DG）的定位更为可靠。</li>
	<li>使用控制面板设置注射器以1 nL/s的流速注射80 nL病毒（图2D）。点击控制面板上的INJECT 按钮开始注射。随后，在颅骨开窗区域内选择另外两个位置，重复上述操作。 
	注意：每次注射约需2分钟。注射完成后，需额外等待8–10分钟再移动至下一位置。若移除过程中发生出血，应立即用生理盐水冲洗。</li>
	<li>缓慢将微量移液管从小鼠脑组织中撤出（图2E）。</li>
</ol>
2. 齿状回中GRIN透镜的植入
注意：在完成 240 nL 病毒注射后立即执行此步骤。
<ol>
	<li>将直径为1 mm的GRIN透镜在75%乙醇中消毒20分钟；植入前用生理盐水充分冲洗。</li>
	<li>使用微型钻头扩大颅骨开孔，使前后方向（A/P）的开口扩大至约1 mm。用生理盐水清除碎屑。</li>
	<li>用夹具固定GRIN透镜，并确保露出足够长度。 
	注意：在后续步骤中使用紫外光固化树脂将夹具固定于颅骨时，容易将夹具粘到GRIN透镜上。但如果透镜露出长度足够，则可避免此问题。</li>
	<li>使用夹具将GRIN透镜移至颅骨开孔区域上方。当GRIN透镜底部接触脑组织表面时，将Z轴位置设为零。然后取下GRIN透镜夹具并放置一旁。</li>
	<li>将25 G鲁尔锁钝头针连接至真空泵吸管，并将压力调节至0.04 MPa。 
	注意：如果是首次执行此步骤，可适当降低压力，以缓慢抽吸脑组织。</li>
	<li>通过在脑组织上方缓慢旋转钝头针尖端并轻压脑组织以促进抽吸。抽吸过程中持续用生理盐水（4 °C保存）冲洗，以保持清晰的视野。密切观察组织特征以监控抽吸深度：皮层组织呈淡粉色，其下方的胼胝体呈白色纤维状，海马CA1层呈深红灰色。当组织表面变得平滑且大面积CA1暴露时，停止抽吸（图3）。 
	注意：此步骤对整个操作的成功至关重要，通常也是最困难的部分。我们提供了一份常见问题列表以帮助读者排查此步骤中的问题（表1）。此外，建议持续用冷生理盐水冲洗创面，这可在一定程度上减少出血。
	<ol>
		<li>若针头堵塞，将堵塞的针头连接至注射器，冲洗清除阻塞物。若无效，尝试更换针头。</li>
		<li>若持续出血，可能遮挡脑组织视野。此时应等待血液凝固后，再用生理盐水冲洗。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将夹具移至钻孔上方。当GRIN透镜接触脑组织表面时，将Z轴设为0。若GRIN透镜直径大于孔径，使用微型钻头进一步扩大孔径，然后重复此操作。</li>
	<li>将GRIN透镜插入孔中，深度（D/V）为-1.32 mm。让夹具保持5–10分钟。抬起夹具后，用生理盐水冲洗孔洞。重复此步骤3次（图4A）。 
	注意：此步骤中脑组织出血属正常现象。经多次生理盐水冲洗后，孔内应无残留血液。此步骤对成像质量影响极大，若血液未清除干净，可能导致成像视野发黑。</li>
	<li>用生理盐水彻底清洁颅骨，然后在涂抹紫外光固化树脂前使其自然干燥。</li>
	<li>用针头将紫外光固化树脂涂布于GRIN透镜周围。用紫外灯照射该区域15秒，确保树脂完全固化（图4B）。 
	注意：应少量多次涂抹紫外光固化树脂，重复操作直至GRIN透镜周围区域完全覆盖。使用紫外灯照射时，注意避免将GRIN透镜与夹具粘连。</li>
	<li>小心地将夹具从GRIN透镜上取下。用紫外光固化树脂覆盖整个暴露的颅骨，并将头固定板准确放置于颅骨上。用紫外灯照射整个颅骨和头固定板15秒（图4C）。 
	注意：头固定板是在连接底板时用于牢固固定小鼠头部的组件（头固定板设计见补充文件1）。应尽可能牢固地固定头固定板；若头固定板脱落，将导致整个手术失败。根据我们的经验，充分涂抹紫外光固化树脂通常足以提供牢固附着。如需更强固定，可考虑安装颅骨螺钉。</li>
	<li>用3D打印的保护帽覆盖暴露的GRIN透镜（保护帽设计见补充文件2）。使用M1.6螺钉将保护帽固定在头固定板上（图4D）。</li>
	<li>将小鼠放回笼中，并置于加热毯上以促进恢复。待小鼠能够自由活动后，将其转移至实验动物房。</li>
	<li>注意：为避免因争斗损坏底板，术后小鼠可单独饲养或与极少数同伴同笼。我们建议术后每笼不超过三只小鼠。</li>
	<li>使用10%次氯酸钠溶液对工作台面进行消毒。脱去一次性个人防护装备（PPE），并将其丢弃至生物危害袋中。</li>
	<li>术后每日监测小鼠3天，记录小鼠体重，并观察其伤口愈合情况和运动能力。连续3天每日腹腔注射地塞米松和卡洛芬溶液（剂量同步骤1.11）。必要时提供湿润饲料或其他治疗以促进恢复。</li>
</ol>
3. 检查成像视野的质量
注意：小鼠在手术后需 2-3 周恢复，方可进行首次 体内 钙成像实验。此步骤的目的是检查手术质量和小鼠的恢复状况。如果在成像视野中可观察到单细胞活动，且小鼠状态良好，则将基板固定于小鼠颅骨上。若成像质量或小鼠健康状况不佳，应通过颈椎脱位法处死小鼠。
<ol>
	<li>使用 USB 3.0 数据线将微型显微镜数据采集盒连接至计算机，然后通过盒体上的 连接显微镜 接口（SMA）连接同轴电缆。</li>
	<li>启动微型显微镜控制软件，在软件中点击 选择配置文件 | 用户配置文件 V4 plus 以查看实时图像。</li>
	<li>使用定制的固定装置夹紧小鼠的头板，将其固定在跑步轮上。用微型显微镜支架（3D 打印制成；设计详见 补充文件 3）固定微型显微镜，并使用立体定位仪将显微镜移动至小鼠头部上方（图 4E）。</li>
	<li>用螺丝刀取下镜头盖。用 75% 乙醇轻轻擦拭 GRIN 透镜表面。将微型显微镜置于暴露的 GRIN 透镜正上方，并使显微镜底面与透镜表面保持平行。通过缓慢降低显微镜靠近 GRIN 透镜，找到最佳焦平面。 
	注意：先将焦平面设为 0，再调整显微镜位置，以便有更多空间调节焦距。选择能够清晰显示最多细胞数量的焦平面。</li>
	<li>在微型显微镜控制软件中，将 LED 光源功率调节至最佳水平。 
	注意：为观察单个细胞活动，成像视野既不应过曝也不应过暗。LED 强度 通常设置在 10% 左右。</li>
	<li>若可见血管血流，且细胞数量丰富、在成像视野中分布均匀，则进入实验的下一环节。 
	注意：此步骤中能够观察到单个细胞活动至关重要，这会影响数据分析结果。通常，区域性活动（荧光波动的斑块状信号）难以解释，可能提示目标神经元偏离 GRIN 透镜焦平面。若成像视野呈黑色、细胞呈现区域性活动或细胞数量不足，则该小鼠不用于后续实验。</li>
	<li>断开微型显微镜的连接线缆。</li>
</ol>
4. 将微型显微镜基板固定到小鼠颅骨上
<ol>
	<li>将底板连接到微型显微镜上，并重新调整微型显微镜的位置，以获得成像质量良好的视野。</li>
	<li>在混合碗中混合义齿基托材料。 
	注意：混合物的稠度应适中，既不能过于流动，也不能过于坚硬。若流动性过强，容易覆盖梯度折射率（GRIN）透镜表面，导致成像视野丢失；若过于坚硬，则义齿基托材料无法紧密填充底板与头板之间的缝隙。</li>
	<li>在小心地于微型显微镜底板周围涂抹第一层义齿基托材料时，注意不要改变微型显微镜的位置。待第一层材料固化后，再从底板向头板涂抹第二层材料。待所有义齿基托材料完全固化后，松开固定螺钉，将微型显微镜从底板上取下。 
	注意：使用义齿基托材料时，应密切关注软件中的成像视野，并在材料固化前完成必要的调整。</li>
	<li>轻柔地将固定臂从微型显微镜上移除。</li>
	<li>将底板帽插入底板中，以保护暴露的梯度折射率（GRIN）透镜，并拧紧固定螺钉（图 4F）。</li>
	<li>将小鼠放回其饲养笼中。在进行行为学实验前，给予小鼠数天时间恢复。</li>
</ol>
5. 数据采集
注意：体内钙成像可与任何行为学测试同时进行。在本方案中，我们以线性轨道为例。该线性轨道长1.5 m&#160;，两端均设有水源，作为小鼠的奖励。小鼠可佩戴微型显微镜（miniscope），在轨道上来回奔跑，持续20分钟。在此期间，小鼠通常能够完成约60次试验。
<ol>
	<li>使用 USB 3.0 数据线将微型显微镜数据采集盒连接到计算机，然后通过连接显微镜（SMA）接口将同轴电缆连接至采集盒。</li>
	<li>启动微型显微镜控制软件，在软件中点击选择配置文件 | 用户配置文件 V4 plus以查看实时图像。</li>
	<li>使用 USB 3.0 数据线将工业相机连接到计算机。</li>
	<li>启动相机控制软件，在软件中点击打开设备，并选择文件以导入数据采集参数。将视频格式设置为AVI 容器中的无压缩视频，点击开始按钮以查看实时图像。 
	注意：为减小行为记录视频的文件大小，视野应排除轨道以外的任何非必要区域。</li>
	<li>使用定制的固定装置通过夹紧头板将小鼠固定在跑轮上。</li>
	<li>使用螺丝刀松开紧定螺钉，取下基板盖，并用 75% 乙醇清洁 GRIN 透镜表面。</li>
	<li>将微型显微镜安装至其基座上，并将其牢固固定在小鼠头部的基座上。</li>
	<li>滑动焦平面按钮，找到最佳焦平面。</li>
	<li>轻柔地将小鼠从跑轮转移至线性轨道。</li>
	<li>点击并按住录制按钮，开始使用微型显微镜进行记录；随后点击开始采集按钮以启动相机记录，持续记录 20 分钟。</li>
	<li>分别保存在体钙成像数据、行为数据和 Arduino 数据，并以日期、实验会话编号及小鼠编号命名这些文件。 
	注意：使用微型显微镜的研究通常需要对单个实验动物进行长期的数据采集，清晰的文件命名有助于后续数据处理流程。</li>
	<li>将微型显微镜从基座上拆下。</li>
	<li>关闭相机控制软件、微型显微镜控制软件以及计算机。</li>
	<li>从连接显微镜（SMA）接口拔下同轴电缆，并从相机拔下 USB 3.0 数据线。</li>
	<li>旋松基座上的紧定螺钉，重新装回基板盖，并拧紧螺钉。</li>
	<li>将小鼠放回其所在的饲养笼中。</li>
</ol>
6. 数据处理
<ol>
	<li>在 MATLAB 中加载记录的钙成像数据。 
	注意：我们认识到数据分析应根据实验设计进行调整。在此提供一个预处理流程，可将原始钙成像视频转换为来自单个细胞的活动轨迹。我们认为该流程具有较高的通用性，对用户具有参考价值。本节所述所有脚本均可在 补充文件 4 中找到。</li>
	<li>将成像数据从 AVI 格式转换为 HDF5 (.h5) 格式。 
	注意：微型显微镜的原始输出为经过压缩的 AVI 文件，未压缩文件通常大小为数十吉字节。HDF5 文件格式支持虚拟访问和部分读取，便于后续分析中的可视化和数据操作。</li>
	<li>应用非刚性运动校正（NoRMCorre）19。</li>
	<li>若计算机内存有限，影响后续步骤运行，可对运动校正后的视频进行下采样。 
	注意：微型显微镜采集的原始数据尺寸为 600 × 600。通过空间下采样，可将视频尺寸减小至 200 × 200。该方法显著降低数据存储需求，并加快数据处理速度。</li>
	<li>根据在线代码库中 EXTRACT 程序的说明20（https://github.com/schnitzer-lab/EXTRACT-public），对下采样后的数据应用 EXTRACT 方法，以识别单细胞信号。</li>
</ol>

Real-Time Imaging for Neuron Activity in the Dentate Gyrus Cells of Mice 

<ol><li>Scoville, W. B., Milner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+recent+memory+after+bilateral+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).</li>
<li>Spiers, H. J., Burgess, N., Hartley, T., Vargha-Khadem, F., O'keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+hippocampal+pathology+impairs+topographical+and+episodic+memory+but+not+visual+pattern+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Bilateral hippocampal pathology impairs topographical and episodic memory but not visual pattern matching.</a> Hippocampus. 11 (6), 715-725 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neurophysiological+approaches+in+the+study+of+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular neurophysiological approaches in the study of learning.</a> Physiol Rev. 48 (1), 65-134 (1968).</li>
<li>Zemla, R., Basu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal function in rodents.</a> Curr Opin Neurobiol. 43, 187-197 (2017).</li>
<li>Basu, J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corticohippocampal+circuit%2C+synaptic+plasticity%2C+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a021733(2015).</li>
<li>Gobbo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+signature+of+spatial+decision-making+during+navigation+by+freely+moving+rats+by+using+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal signature of spatial decision-making during navigation by freely moving rats by using calcium imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2212152119(2022).</li>
<li>Schuette, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabaergic+ca1+neurons+are+more+stable+following+context+changes+than+glutamatergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gabaergic ca1 neurons are more stable following context changes than glutamatergic cells.</a> Sci Rep. 12 (1), 10310(2022).</li>
<li>Daumas, S., Halley, H., Francés, B., Lassalle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding%2C+consolidation%2C+and+retrieval+of+contextual+memory%3A+Differential+involvement+of+dorsal+ca3+and+ca1+hippocampal+subregions%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Encoding, consolidation, and retrieval of contextual memory: Differential involvement of dorsal ca3 and ca1 hippocampal subregions.</a> Learn Mem. 12 (4), 375-382 (2005).</li>
<li>Ognjanovski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum%3A+Parvalbumin-expressing+interneurons+coordinate+hippocampal+network+dynamics+required+for+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Erratum: Parvalbumin-expressing interneurons coordinate hippocampal network dynamics required for memory consolidation.</a> Nat Commun. 8, 16120(2017).</li>
<li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li>
<li>Yassa, M. A., Stark, C. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+separation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern separation in the hippocampus.</a> Trends Neurosci. 34 (10), 515-525 (2011).</li>
<li>Ryan, T. J., Roy, D. S., Pignatelli, M., Arons, A., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory.+Engram+cells+retain+memory+under+retrograde+amnesia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Memory. Engram cells retain memory under retrograde amnesia.</a> Science. 348 (6238), 1007-1013 (2015).</li>
<li>Manahan-Vaughan, D., Reymann, K. G., Brown, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+investigations+into+the+role+of+histamine+in+the+dentate+gyrus+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological investigations into the role of histamine in the dentate gyrus of the rat.</a> Neuroscience. 84 (3), 783-790 (1998).</li>
<li>Kim, S., Jung, D., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+cell+maps+slowly+develop+via+competitive+learning+and+conjunctive+coding+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Place cell maps slowly develop via competitive learning and conjunctive coding in the dentate gyrus.</a> Nat Commun. 11 (1), 4550(2020).</li>
<li>Danielson, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+dentate+gyrus+mossy+cells+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of dentate gyrus mossy cells in behaving mice.</a> Neuron. 93 (3), 552-559.e4 (2017).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+gcamp6m%27s+ca2%2B-dependent+change+in+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deciphering the molecular mechanism responsible for gcamp6m's ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0170934(2017).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normcorre%3A+An+online+algorithm+for+piecewise+rigid+motion+correction+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Normcorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data.</a> J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).</li>
<li>Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInan%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2021).</li>
<li>Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+viral+injection+and+gradient-index+lens+implantation+for+deep+brain+in+vivo+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging.</a> J Vis Exp. (176), (2021).</li>
<li>Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-day+calcium+imaging+of+ca1+hippocampus+in+freely+moving+rats+reveals+a+high+preponderance+of+place+cells+with+consistent+place+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-day calcium imaging of ca1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields.</a> J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).</li>
<li>Masala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+hippocampal+Ca2%2B+micro-waves+following+synapsin-dependent+adeno-associated+viral+expression+of+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Aberrant hippocampal Ca2+ micro-waves following synapsin-dependent adeno-associated viral expression of Ca2+ indicators.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> J Neurosci Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Hsiao, Y. -T., Wang, A. Y. -C., Lee, T. -Y., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+baseplating+and+a+miniscope+preanchored+with+an+objective+lens+for+calcium+transient+research+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice.</a> J Vis Exp. (172), e62611(2021).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniscope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniscope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> J Neurosci Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Cholvin, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+spatial+representation+by+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific spatial representation by hippocampal granule cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 6227(2022).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文介绍了一种在小鼠齿状回（DG）中进行体内钙成像的实验方法。我们认为，该方案将有助于致力于研究DG在多种认知过程中功能的科研人员，特别是在关注特定基因标记的亚群时尤为适用。本文阐述了本方案的优势，强调了手术操作中的若干关键步骤，并讨论了该方法的局限性。
我们测试了现有文献中报道的多种齿状回成像方法，并对本方案中详述的实验流程进行了优化。在我们看来，以下三项关键改进显著提高了本方案的成功率。首先，我们将所有外科手术步骤合并为一次操作，而目前针对皮层下区域的许多钙成像研究通常将病毒注射与透镜植入分为两次独立手术进行。我们方法的一个关键优势在于，病毒表达与脑组织恢复现在可以同步进行，使小鼠准备所需的等待时间缩短了一半，通常可节省数月时间21。此外，分次手术需要对小鼠进行精确的重新定位，因为即使出现约100 µm范围内的轻微倾斜，也会导致手术失败。为避免透镜错位，一些研究团队开发了一种将微型显微镜直接连接至透镜的方法，并尝试在植入手术过程中实时观察传感器的神经元表达情况。这种替代方案需要对常用的立体定位装置进行复杂的工程改...

先前的研究发现，海马体是大脑中处理和提取记忆所必需的结构1,2。自20世纪50年代以来，啮齿类动物海马体的神经回路一直是研究记忆形成、存储和提取的重点3。海马体内的解剖结构包括齿状回（DG）、CA1、CA2、CA3、CA4和下托等亚区4。这些亚区之间存在复杂的双向连接，其中DG、CA1和CA3构成一个显著的三突触回路，由颗粒细胞和锥体细胞组成5。该回路的主要输入来自内嗅皮层（EC）&#160;，并被广泛用作研究突触可塑性的经典模型。以往关于海马体功能的体内研究主要集中于CA1区6,7，因其更容易接近。尽管CA1神经元在记忆的形成、巩固和提取中发挥重要作用，特别是在空间记忆的位置细胞方面，但海马体的其他亚区也同样至关重要8,9。特别是，近期研究强调了DG在记忆形成中的功能。已有报道指出，DG中的位置细胞比CA1中的更为稳定10，其活动反映特定情境的信息11。此外，依赖活动标记的DG颗粒细胞可被重新激活，从而诱导与记忆相关的行为12。因此，为了更深入地理解DG中的信息编码机制，在动物执行依赖记忆的任务时，研究DG亚区的活动至关重要。
以往对齿状回（DG）活动的研究主要采用在体电生理学技术13。然而，该技术存在一些局限性：首先，在电记录中，难以直接识别产生信号的各种细胞类型。所记录的信号来自抑制性和兴奋性细胞两者，因此需要进一步的数据处理方法来区分这两类细胞。此外，电记录难以与其他细胞类型信息（如投射特异性亚群或活动依赖性标记）相结合。另外，由于齿状回的解剖形态特点，记录电极通常以垂直方向植入，这极大地限制了可记录的神经元数量。因此，电记录难以在同一动物中实现对齿状回结构中数百个单个神经元的同时监测&#160;14。
记录齿状回神经元活动的一种互补技术是使用体内钙成像15。钙离子是生物体细胞信号传导过程中的基本成分，在多种生理功能中发挥关键作用，尤其在哺乳动物神经系统中至关重要。当神经元被激活时，其胞内钙离子浓度会迅速升高，反映出神经元活动与信号传递的动态特性。因此，记录神经元内钙离子水平的实时变化，有助于深入理解神经编码机制。
钙成像技术利用特制的荧光染料或基因工程改造的钙离子指示剂（GECIs），通过检测荧光强度的变化来监测神经元内的钙离子浓度，这些变化可通过显微成像进行捕捉16。其中，GCaMP系列钙离子指示剂基因应用较为广泛，其由绿色荧光蛋白（GFP）、钙调蛋白和M13多肽序列组成。当GCaMP与钙离子结合时可发出绿色荧光17，从而可通过成像手段记录绿色荧光的动态变化18。此外，为了获得目标脑区的清晰图像，通常会在感兴趣区域上方植入梯度折射率透镜（GRIN透镜）。该透镜可实现对无法从脑表面直接观察的深部脑区进行成像。
该技术相对容易与其他遗传工具结合，用于标记不同类型的细胞。此外，由于成像平面与齿状回（DG）中细胞的排列方向平行，每次成功手术后均可对数百个神经元进行成像。本文中，我们提供了一套完整且详细的手术操作流程 体内 小鼠齿状回中的钙成像图1）。该操作包含两个主要步骤：第一步是将 AAV-CaMKIIα-GCaMP6f 病毒注射至 DG 区域；第二步是在病毒注射部位上方植入 GRIN 透镜。这两项操作在同一次手术中完成。手术恢复后，下一步是使用微型显微镜（miniscopes）检测成像质量。若成像视野中包含数百个活跃细胞，则继续进行后续操作，即使用牙科水泥将 miniscope 基板固定于小鼠颅骨上；此后小鼠即可用于成像实验。我们还提供了一套基于 MATLAB 的预处理流程，用于高效分析所采集的钙信号数据。

<table><tbody><tr><td>200 &amp;mu;L 通用移液器吸头</td><td>Transcat Pipettes</td><td>1030-260-000-9</td><td>用于移除血液和生理盐水</td></tr><tr><td>25 G 鲁尔锁钝头针（预弯分配吸头）</td><td>iSmile</td><td>20-0105</td><td>用于取出脑组织</td></tr><tr><td>3D 打印保护帽</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于保护梯度折射率透镜（GRIN Lens）</td></tr><tr><td>75% 乙醇</td><td>上海沪试实验室设备有限公司</td><td>bwsj-230219105303</td><td>用于消毒及清洁 GRIN 透镜表面</td></tr><tr><td>AAV2/9-CaMKII&amp;alpha;-GCaMP6f 病毒</td><td>Brain Case</td><td>BC-0083</td><td>用于病毒注射</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td>cc 2018 版本 22.1</td><td>用于绘制图像</td></tr><tr><td>麻醉气泵</td><td>瑞沃德生命科学有限公司</td><td>R510-30</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>相机控制软件</td><td>大恒图像</td><td>Galaxy Windows SDK_CN (V2)</td><td>用于记录行为数据</td></tr><tr><td>套管/陶瓷套管支架（GRIN 透镜支架）</td><td>瑞沃德生命科学有限公司</td><td>68214</td><td>用于固定 GRIN 透镜</td></tr><tr><td>卡洛芬（Carprofen）</td><td>MedChemExpress</td><td>53716-49-7</td><td>用于减轻小鼠术后疼痛&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>同轴电缆</td><td>Open ephys</td><td>CW8251</td><td>用于连接微型显微镜与微型显微镜数据采集盒（DAQ box）</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>奥林巴斯生命科学&amp;nbsp;</td><td>FV3000</td><td>用于观察脑切片</td></tr><tr><td>棉签</td><td>南昌祥医医疗器械有限公司</td><td>20202140438</td><td>用于消毒</td></tr><tr><td>定制头板</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于将小鼠固定在跑步轮上</td></tr><tr><td>定制头板支架</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于固定小鼠的头板</td></tr><tr><td>义齿基托材料（自凝型）</td><td>New Centry Dental</td><td>430205</td><td>用于固定微型显微镜</td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Veet</td><td>ASIN : B001DUUPQ0</td><td>用于去除小鼠体毛</td></tr><tr><td>台式数字立体定位仪，SGL M</td><td>瑞沃德生命科学有限公司</td><td>68803</td><td>用于病毒注射和 GRIN 透镜植入</td></tr><tr><td>地塞米松（Dexamethasone）</td><td>华楚有限公司</td><td>N/A</td><td>用于预防小鼠术后炎症</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>瑞沃德生命科学有限公司</td><td>MZ62-WX</td><td>用于手术过程中观察状态</td></tr><tr><td>大容量气体过滤罐，6 个装</td><td>瑞沃德生命科学有限公司</td><td>R510-31-6</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>GRIN 透镜</td><td>GoFoton</td><td>CLHS100GFT003</td><td>用于 GRIN 透镜植入</td></tr><tr><td>GRIN 透镜</td><td>InFocus Grin Corp</td><td>SIH-100-043-550-0D0-NC</td><td>用于 GRIN 透镜植入</td></tr><tr><td>诱导室—小鼠（15 cm × 10 cm × 10 cm）</td><td>瑞沃德生命科学有限公司</td><td>V100</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>工业相机</td><td>大恒图像</td><td>MER-231-41U3M-L, VS-0618H1</td><td>用于获取行为数据</td></tr><tr><td>碘伏消毒剂</td><td>青岛海诺英诺威消毒科技有限公司</td><td>8861F6DFC92A</td><td>用于消毒</td></tr><tr><td>异氟烷（Isoflurane）</td><td>瑞沃德生命科学有限公司</td><td>R510-22-10</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>液体样品收集管（用于 Nanoject III 的玻璃毛细移液管）</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>用于病毒注射</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2021b</td><td>用于数据分析</td></tr><tr><td>微型钻头</td><td>瑞沃德生命科学有限公司</td><td>78001</td><td>用于开颅手术</td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Narishige International USA</td><td>PC-100</td><td>用于拉制液体样品收集管</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>用于病毒注射</td></tr><tr><td>微型显微镜数据采集（DAQ）软件</td><td>Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)</td><td>N/A</td><td>用于记录钙成像数据</td></tr><tr><td>微型显微镜数据采集（DAQ）盒（V3.3）</td><td>Open ephys</td><td>V3.3</td><td>用于采集钙成像数据</td></tr><tr><td>Miniscope V4</td><td>Open ephys</td><td>V4</td><td>用于活体钙成像</td></tr><tr><td>Miniscope V4 基板（Variant 2）</td><td>Open ephys</td><td>Variant 2</td><td>用于固定微型显微镜</td></tr><tr><td>Nanoject III 可编程纳升级注射仪</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-207</td><td>用于病毒注射</td></tr><tr><td>眼科软膏</td><td>齐森制药有限公司</td><td>H37022025</td><td>用于保持眼睛湿润</td></tr><tr><td>PCR 管</td><td>LabServ</td><td>309101009</td><td>用于稀释病毒</td></tr><tr><td>个人计算机（ThinkPad）</td><td>联想</td><td>20W0-005UCD</td><td>用于记录钙成像数据和行为数据</td></tr><tr><td>跑步轮</td><td>上海爱代宠物用品有限公司</td><td>NA-H115</td><td>用于在安装基板时固定小鼠</td></tr><tr><td>螺丝刀（M1.6 螺丝）</td><td>Greenery（烟台绿野工具有限公司）</td><td>60902</td><td>用于拧下 M1.6 螺丝</td></tr><tr><td>螺丝刀（紧定螺钉）</td><td>Greenery（烟台绿野工具有限公司）</td><td>S2</td><td>用于拧下紧定螺钉</td></tr><tr><td>紧定螺钉</td><td>TBD</td><td>2-56 锥端紧定螺钉</td><td>用于将微型显微镜固定在其基板上</td></tr><tr><td>小动物麻醉机</td><td>瑞沃德生命科学有限公司</td><td>R500</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>无菌注射器</td><td>江苏长城医疗器械有限公司</td><td>20163140236</td><td>用于冲洗血液</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>瑞沃德生命科学有限公司</td><td>S14016-13</td><td>用于剪除毛发和头皮</td></tr><tr><td>ThermoStar 温度控制器，含 69025 加热垫</td><td>瑞沃德生命科学有限公司</td><td>69027</td><td>用于维持动物体温</td></tr><tr><td>超细镊子</td><td>瑞沃德生命科学有限公司</td><td>F11020-11</td><td>用于清除骨屑和硬脑膜</td></tr><tr><td>USB 3.0 电缆</td><td>Open ephys</td><td>N/A</td><td>用于连接微型显微镜 DAQ 盒与计算机</td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>金士达</td><td>66105854002</td><td>用于将 GRIN 透镜固定在颅骨上</td></tr><tr><td>紫外光固化树脂（光固化胶）</td><td>Loctite</td><td>32268</td><td>用于将 GRIN 透镜固定在颅骨上</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>麒麟贝尔</td><td>GL-802B</td><td>用于移除血液、生理盐水和脑组织</td></tr></tbody></table>

小鼠海马齿状回颗粒细胞的活体钙成像

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

实时方法通常在学习与记忆的研究中是必需的， 体内 钙成像技术为研究清醒动物在执行行为任务期间的神经元活动提供了可能。由于海马体与情景记忆和空间记忆密切相关，已成为神经科学研究中的关键脑区&#160;该领域的研究。在近期研究中，通过使用微型显微镜记录小鼠在执行开放场和线性轨道等行为任务时海马CA1区的神经活动，对记忆印迹细胞和位置细胞进行了研究。尽管齿状回是海马体中的另一个重要区域，但它极少被采用该方法研究 体内 由于成像深度较大且成像难度较高，对齿状回进行成像具有挑战性。本方案详细介绍了钙成像的完整流程，包括病毒注射、植入梯度折射率（GRIN）透镜以及安装基板以实现对海马齿状回的成像。我们进一步描述了如何使用MATLAB对钙成像数据进行预处理。此外，该方法也可为其他需要成像的深部脑区研究提供参考。

图1 展示了实验流程示意图，包括病毒注射、GRIN透镜植入和基板固定 体内 通过微型显微镜进行钙成像及数据处理。整个流程通常需要1个月。 图2 展示了病毒注射的示例操作步骤，包括颅骨钻孔位置的确定以及植入GRIN透镜前脑组织的状态。
图3展示了去除脑组织的过程，这对手术的成功至关重要。随着更多组织被吸除，不同的组织层逐渐显现。当观察到一层灰色、有反光的组织时，即可停止吸除操作。
图4 展示了GRIN透镜植入手术的流程，包括插入GRIN透镜、将头固定板粘附于颅骨以及用定制的盖帽覆盖GRIN透镜。成像质量的 体内 钙成像的成功依赖于病毒注射和GRIN透镜植入的效果。 
<strong class="xfi...

海马体中的齿状回在学习和记忆中发挥着重要而独特的功能。本方案描述了一套稳定且高效的方法，用于对自由活动小鼠齿状回颗粒细胞进行在体钙成像。

实时方法通常在学习与记忆研究中是必需的，而活体钙成像则为研究神经元活动提供了可能……

在此方案中，我们使用微型显微镜来研究海马齿状回中的神经活动。我们的目标是探究不同疾病状态下神经元编码和空间表征的变化。我认为，体内研究齿状回的关键挑战在于获取高质量的钙成像数据。各种表达是否满意、GRIN透镜是否植入到正确位置，以及整个手术过程中的其他细节，对于研究的成功至关重要。在传统的钙成像手术中，病毒注射和GRIN透镜植入通常作为两个独立的手术步骤进行。在我们的方案中，将这两个步骤合并为一次操作，这不仅缩短了等待时间，还确保了GRIN透镜的精确定位。本实验室采用多种显微成像技术研究认知功能背后的神经动力学。我们希望理解支持认知的神经活动模式，并结合理论建模与因果干预手段，解析大脑中信息传递与神经计算的过程。首先，将麻醉后的小鼠置于立体定位仪上。使用手术剪沿头皮正中线做连续切口，并切除部分头皮以暴露颅骨表面。使用微型钻头在指定区域进行颅骨开窗，并设定四个点作为边界。当脑组织开始可见时，停止钻孔。使用控制面板将注射器设置为注入 80 纳升病毒。点击控制面板上的“注射”按钮，以每秒 1 纳升的流速将病毒注入齿状回。为吸取脑组织，将钝针针尖在脑组织上方缓慢旋转，并轻轻按压以促进吸出。抽吸过程中需持续用冷生理盐水冲洗，以保持脑组织视野清晰。密切观察组织特征，以监测抽吸深度。皮质组织呈淡粉色。下方的胼胝体呈现为白色的纤维组织，而海马体CA1层则呈深红色和灰色。当组织表面变得平滑且大面积的CA1区暴露出来时，停止吸引。将连接在GRIN透镜上的支架移至钻孔上方。当GRIN透镜接触脑组织表面时，将Z轴设为零。将GRIN透镜插入背腹轴减去1.32毫米的孔中。让固定装置静置5至10分钟，然后抬起固定装置，并用生理盐水冲洗孔洞。使用针头将紫外固化树脂涂抹在GRIN透镜周围。用紫外光照射该区域15秒，以确保树脂完全固化。小心地将固定装置从GRIN透镜上取下。用紫外光固化树脂覆盖整个暴露的颅骨。将头骨固定板放置在颅骨的适当位置。用紫外光照射整个颅骨和头骨固定板15秒。使用3D打印的保护帽覆盖暴露的GRIN透镜。使用M1.6螺丝将保护帽固定在头板上。打开微型显微镜控制软件，点击“选择配置文件”，然后选择VS代码，接着选择用户配置文件。现在点击“运行”，然后滑动LED电源按钮以调节亮度。滑动焦距调节按钮，将数值设置到接近零的位置。将底板连接到微型显微镜上，并重新调整微型显微镜的位置，以获得成像质量良好的视野。小心地在微型显微镜基板周围涂上第一层义齿基托材料。待第一层水泥硬化后，从基板向头板涂抹第二层水泥。待所有义齿基托材料完全硬化后，松开固定螺钉，并将微型显微镜从基板上取下。将底板盖插入底板中，以保护暴露的GRIN透镜，并拧紧固定螺钉。成像完成后，将成像数据从AVI格式转换为HDF5格式。应用非刚性运动校正，并对运动校正后的视频进行降采样。将提取物应用于下采样数据以识别单细胞信号，然

in-vivo-calcium-imaging-granule-cells-dentate-gyrus-hippocampus

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

小鼠海马齿状回管颗粒细胞的体内钙成像 

为了理解新皮层中微环路的网络动态，必须同时记录大量神经元的活动。在体双光子钙成像技术是目前唯一能够以单细胞分辨率记录密集神经元群体活动的方法。...

活体小鼠第2/3层双光子钙成像

来源：Shannonhouse, J., 等. 活体背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像. 《视觉化实验杂志》...

小鼠完整背根神经节中神经元集群的活体钙成像

来源： Calvo-Rodríguez, et al. 老化海马神经元中亚细胞 Ca2+ 的荧光与生物发光成像. J. Vis. Exp. (2015).

短期与长期大鼠海马神经元培养物的体外钙成像

来源：Lee, H. et. al., 在自由活动小鼠杏仁核中使用头戴式微型显微镜成功实现活体钙成像。J. Vis. Exp.

自由活动小鼠中的实时微型内窥镜钙成像

我们介绍一种制备小鼠背侧-中间海马区急性脑片的方案。我们将这种横向切片制备方法与冠状切片在记录质量以及所记录神经元形态特征的保存方面进行比较。...

成年小鼠背侧海马急性脑片制备用于全细胞记录及齿状回神经元重建

本文介绍了如何暴露一只活体、麻醉状态下的实验小鼠的膝状神经节，并利用钙成像技术记录这些神经元群体对不同味觉刺激的反应，从而实现使用多种刺激物进行多次重复实验。该方法可用于深入比较哪些神经元对哪些味觉物质产生反应。...

小鼠膝状神经节神经元对味觉刺激反应的活体钙成像

我们介绍一种从腹侧暴露成年小鼠脑干的实验方案。通过使用梯度折射率透镜与微型显微镜，可利用钙成像技术在活体中检测下橄榄核神经元胞体的活动。...

in vivo 小鼠下橄榄核钙成像

本方案描述了背根神经节（DRG）的手术暴露过程，随后在对同侧后爪施加多种刺激的同时，利用Pirt-GCaMP3小鼠对神经元集合进行GCaMP3（基因编码的Ca2+指示剂；绿色荧光蛋白-钙调蛋白-M13蛋白3）Ca2+成像。...

体内完整背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

本方案概述了 体内 利用钙成像技术测量腰段6背根神经节（L6...

体内背根神经节神经元对躯体和内脏刺激反应的钙成像

基因编码的钙离子指示剂（GECI）可实现对感觉神经元信号传导的稳健且群体水平的分析。本文中，我们开发了一种新方法，可实现 体内 大鼠三叉神经节神经元活动的GECI可视化...

体内大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像

本方案描述了 体内 完整三叉神经节（TG）神经元的GCaMP钙成像。该描述包括TG暴露手术， 体内 共聚焦显微镜成像三叉神经节神经元、在三叉神经节神经元显微成像期间施加体感刺激，以及分析 体内 GCaMP...

体内完整三叉神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

了解小鼠海马齿状回颗粒细胞的体内钙成像方法，该方案将病毒注射与GRIN透镜植入整合为单次手术，以提高神经活动记录的数据质量与准确性，助力认知神经科学研究。

小鼠海马齿状回颗粒细胞的活体钙成像

探索更多视频